A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica
November 6th, 2009
A microfluídica Digital é uma técnica caracterizada pela manipulação de gotículas discretas (~ nL - mL) em uma matriz de eletrodos pela aplicação de campos elétricos. É bem adequado para a realização rápida, seqüencial, miniaturizados automatizado ensaios bioquímicos. Aqui, nós relatamos uma plataforma capaz de automatizar várias etapas de processamento proteômica.
A proteômica clínica é uma nova disciplina importante que promete a descoberta de biomarcadores que serão úteis para o diagnóstico precoce e prognóstico da doença. Aqui relatamos um novo método de microfluídica digital ou DMF que integra várias etapas de processamento usadas em proteômica clínica, incluindo extração de proteínas, redução de re-solubilização, alquilação e digestão enzimática. O DMF usa microgotículas discretas de proteínas de amostra em uma matriz de eletrodos e pode ser executado à temperatura ambiente, permitindo a análise automatizada paralela de amostras.
Essa metodologia representa um avanço significativo em relação aos métodos convencionais e tem o potencial de ser uma nova ferramenta útil em proteômica clínica. Olá, sou Steve Sche do Laboratório Professor Erin Wheeler no Departamento de Química e Instituto de Biomateriais e Engenharia Biomédica da Universidade de Toronto. Olá, sou Gabriel do Wheeler Lab da Universidade de Toronto.
E eu sou Vivian Luke, também do laboratório Wearer da Universidade de Toronto. Eu sou Erin Wheeler. Tenho a sorte de trabalhar com Steve Mace e Vivian.
Hoje mostraremos um procedimento para processamento proteômico usando microfluídica digital. Usamos este procedimento em nosso laboratório para estudar proteínas e amostras biológicas. Então vamos começar.
Inicie o procedimento na hotte limpando os substratos de vidro em solução de Piranha. Enquanto estiver usando proteção adequada, a solução de piranha é composta de três a um ácido sulfúrico concentrado a 30% de peróxido de hidrogênio. Portanto, deve-se ter cuidado ao trabalhar com ele.
Incubar os substratos de vidro em piranha por 10 minutos e após a limpeza, enxaguá-los e deionizar ou desaguar e secar os substratos com gás nitrogênio. Coloque os substratos dentro da câmara de evaporação do feixe de elétrons para deposição de cromo com uma espessura de 250 nanômetros. Remova os substratos da câmara assim que essa espessura for alcançada e enxágue com isopropanol, depois seque em uma placa quente por cinco minutos a 115 graus Celsius.
Preparar os substratos secos com hexametilxilazina ou HMDS por revestimento giratório em 30 segundos. Código de centrifugação de 3000 RPM novamente com foto Shipley S 1811. Resista usando parâmetros idênticos.
Pré-asse o substrato diretamente em uma chapa quente a 100 graus Celsius minutos. Em seguida, padronize a fotorresistência por exposição à radiação ultravioleta ou UV por cinco segundos através de uma máscara fotográfica. Em seguida, desenvolva os substratos expostos aos raios UV no desenvolvedor Shipley MF 3 21 O suficiente para submergir o substrato por três minutos depois.
Enxágüe o substrato em poste de água DI. Asse diretamente em uma chapa quente a 100 graus Celsius por um minuto. Grave o cromo exposto imergindo os substratos por 30 segundos em apenas o suficiente para cobri-los completamente.
Enxágue os substratos com água DI e mergulhe em um decapante Z 300 T o suficiente para submergir o substrato por 10 minutos. Para remover o fotorresistente restante. Enxágüe em água DI e seque em gás nitrogênio.
Após este depósito, dois a cinco micrômetros Paraline C.An polímero isolante no substrato por depósito de vapor químico depósito 50 nanômetros de Teflon AF para tornar a superfície hidrofóbica por revestimento giratório uma solução. 1% de peso por peso no nervo da flora FC 40 a 2000 RPM por 60 segundos. No substrato.
Repita com óxido de índio estanho não passado ou substrato de vidro ITO para criar o poste da placa superior. Asse os dois substratos em uma chapa quente a 160 graus Celsius. 10 minutos para configurar o dispositivo microfluídico digital.
Remova os revestimentos de polímero das almofadas de contato de um substrato inferior raspando com um bisturi. Acople as almofadas expostas do substrato inferior com conectores de 40 pinos em um computador executando a visualização do laboratório. Usamos uma caixa de controle construída em casa que contém relés com sinais controlados por dpad.
A caixa de controle do computador facilita o controle do usuário sobre a aplicação de sinais de 100 volts RMS por 18 kilohertz ao dispositivo por meio dos conectores de 40 pinos. Ligue também um gerador de funções e amplificador. Monte o dispositivo posicionando dois pedaços de fita dupla-face de espessura total de 140 micrômetros nas bordas do substrato inferior.
Pipete quatro microlitros de água DI em um dos reservatórios e coloque o dispositivo posicionando a lâmina de óxido de índio e estanho não padronizada na parte superior do dispositivo com o lado revestido de Teflon voltado para baixo. Conecte um conector de aterramento ao trecho da placa superior. O laboratório criou um programa de inicialização na visualização de laboratório para calibrar o controle de feedback que o dispositivo agora está pronto para experimentos.
Neste protocolo, usaremos albumina de soro bovino ou BSA como amostra de proteína para demonstrar nosso design e uso de microfluídica digital. A BSA é diluída em tampão de trabalho ou WB feito de 100 milimolares tris HCL pH 7,8 com 0,08% de peso F1 27 onic por volume. Preparar um mililitro de cada amostra e solução reagente e indicar o reservatório ao qual será adicionada.
Após a preparação do reagente, remova a placa superior do dispositivo e pipete quatro microlitros de solução para o reservatório designado. Depois de encher os reservatórios, recoloque a placa superior no dispositivo. Use o programa de exibição de laboratório interno para executar as etapas a seguir.
Lembre-se de que a interface do computador permite que o usuário dispense cerca de 600 nanolitros de gotículas de reservatórios e manipule as gotículas no conjunto de eletrodos. Primeiro, dispense uma gota de proteína contendo amostra de R um e uma gota de precipitante de R dois. Mescle as duas gotículas e deixe a gota combinada incubar por cinco minutos para que as proteínas precipitem na superfície.
Acionar o sobrenadante para longe da proteína precipitada para o reservatório de resíduos. R três, para lavar a proteína precipitada, dispensar três gotículas de tampão de lavagem de R quatro e conduzi-las através da proteína precipitada e para o reservatório de resíduos. Deixar secar o precipitado e distribuir uma gota de tampão re-solubilizante de R cinco para a proteína.
Deixar incubar o tampão durante 20 minutos até que o precipitado se dissolva. Em seguida, dispense uma gota de agente redutor de R seis e mescle-a com a gota de amostra. Misture a gota combinada acionando-a em seis eletrodos em um padrão circular.
Deixe a gota incubar por uma hora em temperatura ambiente. Dispensar uma gota de agente alquilante de R seven e fundi-la com a gota de amostra, seguida de mistura. Deixe a gota incubar por 15 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz.
Finalmente, dispense uma gota de tripsina de R oito e mescle-a com a gota de amostra, seguida de mistura. Deixe a gota incubar por três horas a 37 graus Celsius em uma placa de Petri em uma placa quente. Para terminar a reação, remova a placa superior e tempere a digestão por pipetagem.
Aponte seis mililitros de ácido tricloroacético a 2,5% em água na gota de reação. Purifique o produto da reação temperada sifonando a gota de amostra diretamente da placa inferior. Usando uma ponta zip C 18, de acordo com as instruções do fabricante, as amostras agora podem ser diluídas conforme necessário e avaliadas por espectrometria de massa para identificar as proteínas na amostra usando este sistema.
Seguidas por proteínas de espectrometria de massa foram identificadas com pontuações de probabilidade de menos de uma vez E elevado a três negativos, equivalente a um intervalo de confiança de 99,9% e coberturas de sequência de pelo menos 30%. Então, mostramos hoje como utilizamos a microfluídica digital para extrair e processar proteínas de maneira automatizada. Esta metodologia fornece uma solução potencial para perda e contaminação de amostras durante o isolamento e identificação de proteínas.
Esperamos aplicar esse método no futuro a outras aplicações biológicas, incluindo imunoensaios e ensaios baseados em células. Ao fazer esse tipo de experimento, o mais importante é lembrar de aproveitá-lo. Então é isso.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo discute um novo método de microfluídica digital (DMF) que integra múltiplas etapas de processamento para proteômica clínica. A técnica permite a manipulação de micro gotículas em uma matriz de eletrodos, facilitando ensaios bioquímicos automatizados à temperatura ambiente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Proteômica clínica
- Ensaios bioquímicos
- Microfluídica digital
Fundamentos
- A proteômica clínica visa descobrir biomarcadores para diagnóstico e prognóstico de doenças.
- A microfluídica digital permite o manuseio de gotículas discretas para análise bioquímica.
- O método pode ser executado à temperatura ambiente, melhorando o processamento de amostras.
- A automação das etapas de processamento proteômico é crucial para a eficiência.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um novo método de DMF para proteômica clínica.
- Integrar extração de proteínas, solubilização, redução, alquilação e digestão.
- Demonstrar as vantagens do DMF sobre métodos convencionais.
Métodos Utilizados
- Integração de múltiplas etapas de processamento proteômico usando DMF.
- Uso de micro gotículas discretas em uma matriz de eletrodos.
- Automação da análise de amostras.
- Realização de experimentos à temperatura ambiente.
Principais Resultados
- O método DMF automatiza com sucesso várias etapas proteômicas.
- A análise paralela de amostras é alcançada eficientemente.
- A metodologia mostra melhorias significativas sobre as técnicas tradicionais.
- O potencial para ampla aplicação na proteômica clínica é destacado.
Conclusões
- O novo método de DMF representa um avanço significativo na proteômica clínica.
- Oferece uma abordagem versátil e eficiente para descoberta de biomarcadores.
- Aplicações futuras podem melhorar o diagnóstico precoce e prognóstico de doenças.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Digital microfluidics (DMF) addresses a key bottleneck in clinical proteomics by automating multi-step protein processing workflows, reducing manual handling and associated variability. This enables reproducible, high-throughput preparation of samples for biomarker discovery, directly supporting early-stage target validation and assay development. By integrating extraction, solubilization, reduction, alkylation, and digestion on a single platform, DMF enhances predictive confidence in proteomic data generation for downstream R&D decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through automated, reproducible protein sample preparation from complex biological fluids.
- Operational Value: Reduces manual pipetting steps, minimizing sample loss and contamination during upstream processing.
- Predictive Value: Supports biomarker identification with high sequence coverage and confidence scores, improving target selection reliability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitatively processable protein digests suitable for mass spectrometry-based screening campaigns.
- Operational Value: Facilitates parallel processing of multiple samples, increasing throughput for hit confirmation and lead profiling.
- Assay Readiness: Produces consistent enzymatic digestion outputs, enabling reliable compound evaluation in proteomic screens.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase proteomics with preclinical validation by ensuring consistent sample preparation across study stages.
- Mechanistic De-risking: Reduces variability in post-translational modification analysis, supporting confident pathway elucidation.
- Predictive Confidence: Enables reproducible generation of proteomic datasets used to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
DMF fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven proteomics from initial target engagement through lead identification by delivering standardized, automation-ready sample inputs.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by enabling reproducible processing of disease-relevant protein samples from serum or cell lysates.
- Screening: Delivers assay-ready peptide mixtures with consistent digestion efficiency, enabling reliable LC-MS/MS readouts for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative, high-confidence proteomic outputs (e.g., sequence coverage >30%, probability scores <1e-3) that facilitate comparative condition analysis.
- Translational Research: Ensures sample preparation consistency from discovery through preclinical stages, supporting biomarker alignment and validation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for automated proteomic processing across multiple projects, reducing revalidation burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein sample preparation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of proteomic workflows through automated droplet manipulation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent waste and enabling parallel sample processing.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reliable, high-quality proteomic data for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, surface chemistry, and electrode-based fluid control.
- Depends on access to microfabrication tools (e.g., spin coater, UV exposure system) and instrumentation for electrochemical actuation.
- Necessitates cross-team standardization of device preparation protocols to ensure inter-laboratory reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to diverse sample types (e.g., serum, whole blood, cell lysates) due to varying viscosity and protein content.
- Practical limitations include the need for cleanroom-compatible fabrication steps and careful handling of hydrophobic surfaces to maintain droplet integrity.
