A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

A proteômica clínica é uma importante disciplina emergente que promete a descoberta de biomarcadores úteis para o diagnóstico e prognóstico precoces de doenças. Aqui relatamos um novo método de microfluídica digital ou DMF que integra várias etapas de processamento utilizadas na proteômica clínica, incluindo extração de proteínas, redisolução, redução, alquilação e digestão enzimática. A DMF utiliza microgotas discretas de proteínas da amostra sobre uma matriz de eletrodos e pode ser executada à temperatura ambiente, permitindo a análise automatizada e paralela de amostras.

Esta metodologia representa um avanço significativo em relação aos métodos convencionais e tem o potencial de ser uma nova ferramenta útil na proteômica clínica. Olá, sou Steve Sche do Laboratório da Professora Erin Wheeler do Departamento de Química e do Instituto de Biomateriais e Engenharia Biomédica da Universidade de Toronto. Olá, sou Gabriel do Laboratório Wheeler da Universidade de Toronto.

E eu sou Vivian Luke, também do laboratório Wearer na Universidade de Toronto. Eu sou Erin Wheeler. Tenho a sorte de trabalhar com Steve Mace e Vivian.

Hoje vamos mostrar um procedimento para processamento proteômico utilizando microfluídica digital. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar proteínas e amostras biológicas. Então, vamos começar.

Inicie o procedimento na capela, limpando os substratos de vidro com a solução de Piranha. Enquanto usa proteção adequada, a solução de Piranha é composta por três partes de ácido sulfúrico concentrado para uma parte de peróxido de hidrogênio a 30%. Portanto, deve-se ter cuidado ao manipulá-la.

Incube os substratos de vidro em piranha por 10 minutos e, após a limpeza, enxágue-os com água desionizada ou deionizada e seque os substratos com gás nitrogênio. Coloque os substratos dentro da câmara de evaporação por feixe de elétrons para deposição de cromo até uma espessura de 250 nanômetros. Remova os substratos da câmara assim que essa espessura for atingida e enxágue com isopropanol, depois seque em uma placa aquecida por cinco minutos a 115 graus Celsius.

Priming os substratos secos com hexa metil xilazina ou HMDS por meio de revestimento por centrifugação durante 30 segundos. Centrifugue novamente a 3000 RPM com a fotoresina Shipley S 1811 utilizando parâmetros idênticos.

Pré-aqueça o substrato diretamente em uma placa aquecedora a 100 graus Celsius por minutos. Em seguida, faça o padrão do fotoresiste mediante exposição à radiação ultravioleta ou UV por cinco segundos através de uma máscara fotográfica. A seguir, desenvolva os substratos expostos ao UV em desenvolvedor Shipley MF 3 21, suficiente para submergir o substrato, durante três minutos após.

Lave o substrato em água desionizada após. Asse diretamente em uma placa aquecedora a 100 graus Celsius por um minuto. Grave o cromo exposto imergindo os substratos por 30 segundos em quantidade suficiente de solução gravadora de cromo para cobri-los completamente.

Lave os substratos com água DI e imerja em um removedor Z 300 T suficiente para submergir o substrato por 10 minutos. Para remover o fotoresiste remanescente. Enxágue com água DI e seque em gás nitrogênio.

Após essa deposição, dois a cinco micrômetros de Paraline C.An, um polímero isolante, são depositados sobre o substrato por deposição química de vapor, seguido do depósito de 50 nanômetros de Teflon AF para tornar a superfície hidrofóbica por meio da aplicação, em spin coating, de uma solução a 1% em peso em Fluroinerte FC 40 a 2000 RPM durante 60 segundos sobre o substrato.

Repita com um substrato de óxido de índio-estanho ou vidro ITO não passivado para criar o pino superior. Incube ambos os substratos em uma placa aquecedora a 160 graus Celsius por 10 minutos para montar o dispositivo microfluídico digital.

Remova revestimentos poliméricos dos pontos de contato de um substrato inferior raspando com um bisturi. Conecte os pontos expostos do substrato inferior a conectores de 40 pinos com alimentação em um computador executando o LabVIEW. Utilizamos uma caixa de controle construída em laboratório que contém relés com sinais controlados por dpad.

A caixa de controle por computador facilita o controle do usuário sobre a aplicação de 100 volts RMS por sinais de 18 quilohertz ao dispositivo por meio dos conectores de 40 pinos. Ligue também um gerador de funções e um amplificador. Monte o dispositivo posicionando duas tiras de fita adesiva dupla-face com espessura total de 140 micrômetros nas bordas do substrato inferior.

Pipete quatro microlitros de água desionizada em um dos reservatórios e feche o dispositivo posicionando a lâmina de óxido de índio e estanho sem padrão na parte superior do dispositivo, com o lado revestido com teflon voltado para baixo. Conecte um conector de terra à placa superior. O programa de inicialização criado no laboratório no LabVIEW para calibrar o controle de feedback está pronto; o dispositivo agora está preparado para experimentos.

Neste protocolo, utilizaremos a albumina sérica bovina ou BSA como amostra proteica para demonstrar o nosso design e uso da microfluídica digital. A BSA é diluída no tampão de trabalho ou WB, composto por tris HCl 100 milimolar pH 7,8 com 0,08% p/v de Tween F127. Prepare um mililitro de cada solução de amostra e reagente e identifique o reservatório no qual será adicionado.

Após o preparo dos reagentes, remova a placa superior do dispositivo e pipete quatro microlitros da solução no reservatório designado. Após preencher os reservatórios, recoloque a placa superior no dispositivo. Utilize o programa interno de visualização do laboratório para executar os seguintes passos.

Lembre-se, a interface do computador permite ao usuário dispensar gotas de cerca de 600 nanolitros a partir de reservatórios e manipular as gotas na matriz de eletrodos. Primeiro, dispense uma gota da amostra contendo proteína do reservatório R1 e uma gota do precipitante do reservatório R2. Una as duas gotas e deixe a gota combinada incubando por cinco minutos para que as proteínas precipitem sobre a superfície.

Acione o sobrenadante, afastando-o do proteína precipitada, em direção ao reservatório de resíduos. Para a lavagem da proteína precipitada, dispense três gotas de tampão de lavagem do R quatro e direcione-as sobre a proteína precipitada até o reservatório de resíduos. Deixe o precipitado secar e dispense uma gota de tampão de ressolubilização do R cinco sobre a proteína.

Deixe o tampão incubar por 20 minutos até que o precipitado tenha se dissolvido. Em seguida, dispense uma gota do agente redutor do R seis e combine-a com a gota da amostra. Misture a gota combinada movimentando-a por seis eletrodos em um padrão circular.

Deixe a gota incubar por uma hora à temperatura ambiente. Dispense uma gota de agente alquilante do R sete e combine-a com a gota da amostra, seguido de mistura. Deixe a gota incubar por 15 minutos à temperatura ambiente, protegida da luz.

Por fim, dispense uma gota de tripsina do poço R e una-a à gota da amostra, seguido de mistura. Deixe a gota incubando por três horas a 37 graus Celsius em uma placa de Petri sobre uma placa aquecedora. Para encerrar a reação, remova a placa superior e pare a digestão por pipetagem.

Adicione 0,6 mL de ácido tricloroacético 2,5% em água à gota de reação. Purifique o produto da reação interrompida por aspiração da gota da amostra diretamente da placa inferior. Utilizando uma ponta zip em C 18, de acordo com as instruções do fabricante, as amostras podem agora ser diluídas conforme necessário e avaliadas por espectrometria de massas para identificar as proteínas na amostra usando este sistema.

Proteínas identificadas por espectrometria de massas apresentaram pontuações de probabilidade inferiores a um vezes E elevado a menos três, equivalente a um intervalo de confiança de 99,9% e coberturas de sequência de pelo menos 30%. Assim, a DMF é uma metodologia muito útil para o processamento automatizado de amostras proteômicas. Hoje mostramos como utilizamos a microfluídica digital para extrair e processar proteínas de maneira automatizada. Esta metodologia oferece uma solução potencial para a perda de amostras e contaminação durante o isolamento e identificação de proteínas.

Esperamos aplicar este método no futuro a outras aplicações biológicas, incluindo ensaios imunológicos e ensaios baseados em células. Ao realizar este tipo de experimento, a coisa mais importante é lembrar-se de aproveitá-lo. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.