Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

O objetivo geral deste procedimento é expressar proteínas marcadas com fluorescência de interesse dentro de células de insetos disponíveis comercialmente para a elucidação aprimorada da função proteica e/ou tráfego celular de proteínas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave baseadas em biologia celular e bioquímica sobre funcionalidade de proteínas, interações de proteínas e/ou localização de proteínas subcelulares. A principal vantagem desta técnica é que as construções podem ser rapidamente geradas e as proteínas expressas funcionalmente avaliadas em células vivas sem efeitos deletérios associados à expressão de baculovírus, melhorando assim o rendimento.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o estudo de proteínas de insetos, ele também pode ser aplicado a qualquer sistema para o qual o estudo da função da proteína ou da localização celular seja desejado. Demonstrando o procedimento para cultura e transfecção de células de insetos estará Danni LeRoy, uma técnica do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, remova os frascos de estoque de células SF9 e Tni congeladas do freezer de 80 graus Celsius negativos e deixe-os descongelar em banho-maria de 37 graus Celsius.

Após o descongelamento, descontamine os frascos com etanol 70% e coloque-os no gelo. Todas as manipulações celulares que requerem a abertura de frascos e frascos de cultura de tecidos devem ser realizadas dentro de uma capela de fluxo laminar para manter as condições estéreis. Adicionar quatro mililitros de meio de insectos isento de soro a um novo balão T25 e quatro mililitros de meio TNM-FH a outro balão T25.

Transferir um mililitro de células Tni descongeladas para o balão com meio de insectos isento de soro e um mililitro de células SF9 descongeladas para o balão com meio TNM-FH. Coloque os frascos em uma incubadora não umidificada a 28 graus Celsius e deixe as células se fixarem por 30 a 45 minutos. Substitua o meio de semeadura por cinco mililitros do meio apropriado.

E devolva os frascos para a incubadora não umidificada de 28 graus Celsius. Monitore a confluência celular diariamente. Passe as células quando atingirem 90% de confluência, conforme mostrado por essas imagens representativas.

Inclinar o balão que contém as células confluentes de modo a que o meio flua para um canto afastado da monocamada celular e utilizar uma pipeta serológica estéril de cinco mililitros para remover cuidadosamente o meio sem perturbar as células. Para células Tni, use uma nova pipeta sorológica estéril de cinco mililitros para adicionar suavemente quatro mililitros de meio de inseto sem soro na monocamada confluente. Mova a ponta da pipeta pelo frasco e irrigue lentamente para remover as células frouxamente presas ao fundo do frasco.

Para verificar o desprendimento adequado das células, retire todos os meios, vire o balão e observe se o fundo do balão está limpo. Para células SF9, que aderem com mais força, adicione quatro mililitros de meio TNM-FH fresco e use um raspador de células para desalojar as células anexadas. Use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para misturar suavemente e reduzir a aglomeração celular.

Depois de separar as células, transfira aproximadamente 0,1 mililitros de cada célula e mistura de meio para um tubo de micro-fuga de 1,5 mililitro. Em um tubo de micro-fuga separado de 0,5 mililitro, adicione 10 microlitros de cada célula e mistura média a 10 microlitros de azul de tripano. Remova a lâmina da câmara do contador de células de sua embalagem e adicione 10 microlitros da mistura de azul de tripano do meio celular em cada lado da lâmina de contagem.

Insira a lâmina em um contador de células automatizado e determine a densidade e a viabilidade da célula. Transferir cerca de uma a 1,5 vezes 10 para as 6ª células para frascos T25 com meios frescos. Rotule os frascos com a linha celular, data, meio usado, número de células adicionadas e número de passagem.

Colocar os frascos numa incubadora a 28 graus Celsius durante um máximo de 72 horas. O procedimento de transfecção de células de insetos também deve ser realizado dentro de uma capela de fluxo laminar. Semear um balão T25 com até 10 elevado à 6.a célula Tni ou SF9 num meio de células de inseto adequado.

As células Tni são usadas nesta demonstração. Cultive as células até a confluência por 72 horas a 18 graus Celsius. 72 horas depois, remova e descarte o meio antigo e desaloje as células Tni com quatro mililitros de meio de inseto fresco sem soro, conforme mostrado anteriormente.

O aspecto mais difícil deste procedimento é obter a densidade adequada de células presas aos pratos de fundo de vidro durante a transfecção. Não mais do que sete vezes 10 elevado à 5ª célula deve ser adicionado a cada prato. Depois de usar um contador de células automatizado para estimar a densidade celular, misture bem, mas suavemente, a suspensão celular invertendo o tubo e adicione aproximadamente sete vezes 10 às 5ª células a pratos individuais de fundo de vidro de 35 milímetros.

Deixe as células se fixarem por 20 a 25 minutos a 28 graus Celsius. Para cada transfecção, adicione dois microgramas de DNA de plasmídeo a 0,1 mililitros de meio de inseto sem soro sem FBS em um tubo de micro-fuga estéril de 1,5 mililitro. Em um tubo separado, misture oito microlitros de reagente de transfecção com 0,1 mililitros de meio de inseto sem soro.

Em seguida, transfira a solução para o tubo que contém o DNA plasmidial de interesse. Agite levemente e incube em temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. Em seguida, dilua a mistura de transfecção de plasmídeo com 0,8 mililitros de meio de inseto sem soro, elevando o volume total para um mililitro.

Remova cuidadosamente a mídia do prato de vidro que contém as células conectadas. Cubra as células anexadas com o meio de transfecção de plasmídeo diluído. Incube as células a 28 graus Celsius por cinco horas.

Após cinco horas, remova e descarte o meio de transfecção e lave suavemente as células com um mililitro de meio de inseto sem soro, tomando cuidado para não desalojar as células. Adicione dois mililitros de meio de célula de inseto fresco sem soro e incube a 28 graus Celsius por 48 a 72 horas. 48 a 72 horas após a transfecção das células do inseto, lave as células uma vez com um mililitro de meio de inseto IPL-41 e cubra com dois mililitros de IPL-41 para obter imagens.

Adicione quatro gotas de reagente de coloração de células vivas Hoechst ao meio e incube a 28 graus Celsius por 20 a 25 minutos. Coloque a antena de 35 milímetros no microscópio confocal de varredura a laser auto-fechado. Embora muitos pratos de vidro estejam disponíveis comercialmente, é importante que eles se encaixem no estágio do microscópio e pode ser necessário determinar empiricamente qual vidraria é mais compatível com a fixação das células.

Ajuste o microscópio para as condições de observação Hoechst, EGFP e mCherry. 359 nanômetros e 461 nanômetros para excitação e emissão de Hoechst. 489 nanômetros e 510 nanômetros para excitação e emissão de EGFP.

E 580 nanômetros e 610 nanômetros para excitação e emissão de mCherry. Usando uma objetiva de 10X, execute uma varredura inicial para confirmar a expressão fluorescente. Depois disso, mude para o modo de varredura usando uma objetiva de imersão em água com contraste de fase de 60X.

Ajuste a potência do laser, a sensibilidade do detector, a velocidade de varredura, a profundidade do eixo Z e o zoom digital para otimizar o contraste e a resolução da imagem. Visualize as células com zoom digital de 1,5X para fornecer um total de amplificação de 90X. Salve e exporte os dados brutos como arquivos de imagem TIFF para análise posterior.

As células Tni foram transfectadas com os plasmídeos indicados e a expressão das proteínas recombinantes foi visualizada por meio de microscopia de fluorescência confocal. A transfecção e expressão bem-sucedidas de BtDrip1-EGFP recombinante são evidentes pela presença de fluorescência verde na superfície da célula. As células transfectadas com BtDrip2 versão um EGFP mostram fluorescência verde dentro indicando a expressão intracelular de BtDrip2 versão um.

Da mesma forma, as células transfectadas com PIB DmSPR-mCherry ou PIB PLA2G15-mCherry apresentam fluorescência vermelha indicando a expressão das respectivas quimeras. Nas imagens mescladas, as áreas laranja ou amarela indicam a expressão de EGFP e mCherry, o que sugere que as proteínas estão co-localizadas dentro das mesmas estruturas subcelulares. Uma sobreposição de células duplamente transfectadas com PIB BtDrip1-EGFP e PIB DmSPR-mCherry sugere co-localização de BtDrip1-EGFP e DmSPR-mCherry na superfície da célula.

Células duplamente transfectadas com BtDrip2 versão um EGFP e PIB DmSPR-mCherry mostram pouca co-localização de sinais de fluorescência verde e vermelho, confirmando a expressão intracelular de BtDrip2 versão um. Em contraste, a co-expressão de PIB BtDrip2 versão um EGFP e o marcador lisossômico PIB PLA2G15-mCherry resultou em uma sobreposição significativa nos sinais fluorescentes citoplasmáticos verde e vermelho. Isso sugere fortemente que BtDrip2 é tráfego para lisossomos intercelulares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar quimeras de proteínas fluorescentes em células de insetos cultivadas. Este sistema oferece construção rápida de vetores na síntese de proteínas, evita desafios de sistemas de expressão baseados em vírus e fornece um meio robusto para observar proteínas de tráfego celular.