Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

O objetivo geral deste procedimento é expressar proteínas de interesse marcadas com fluoróforos em células de insetos comercialmente disponíveis, para melhor elucidação da função proteica e/ou do tráfego celular de proteínas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais de biologia celular e bioquímica relacionadas à funcionalidade das proteínas, interações proteicas e/ou localização subcelular das proteínas. A principal vantagem desta técnica é que os construtos podem ser rapidamente gerados e as proteínas expressas podem ser avaliadas funcionalmente em células vivas, sem efeitos prejudiciais associados à expressão por baculovírus, aumentando assim a produtividade.

Embora este método possa fornecer insights no estudo de proteínas de insetos, ele também pode ser aplicado a qualquer sistema no qual se deseje estudar a função proteica ou a localização celular. A demonstração do procedimento de cultura celular de insetos e transfeção será feita por Danni LeRoy, uma técnica do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, retire os frascos estoque de células SF9 e Tni congeladas do congelador a menos 80 graus celsius e deixe-as descongelar em banho-maria a 37 graus celsius.

Após o descongelamento, descontamine os frascos com etanol 70% e coloque-os sobre gelo. Todas as manipulações celulares que exigirem a abertura de frascos e frascos de cultura de tecidos devem ser realizadas dentro de uma câmara de fluxo laminar para manter condições estéreis. Adicione quatro mililitros de meio para insetos sem soro a um novo frasco T25 e quatro mililitros de meio TNM-FH a outro frasco T25.

Transfira um mililitro de células Tni descongeladas para o frasco com meio para insetos sem soro e um mililitro de células SF9 descongeladas para o frasco com meio TNM-FH. Coloque os frascos em uma incubadora a 28 graus Celsius, não umidificada, e deixe as células aderirem por 30 a 45 minutos. Substitua o meio de semeadura por cinco mililitros do meio apropriado.

E devolva os frascos ao incubador não umidificado a 28 graus Celsius. Monitore diariamente a confluência celular. Passe as células quando atingirem 90% de confluência, conforme mostrado nestas imagens representativas.

Incline o frasco contendo as células confluentes de modo que o meio escorra para um canto, longe da monocamada celular, e utilize uma pipeta serológica estéril de cinco mililitros para remover cuidadosamente o meio sem perturbar as células. Para células Tni, use uma nova pipeta serológica estéril de cinco mililitros para adicionar suavemente quatro mililitros de meio para insetos sem soro sobre a monocamada confluente. Mova a ponta da pipeta pelo frasco e irriague lentamente para remover as células fracamente aderidas ao fundo do frasco.

Para verificar a adequada dessanexação das células, remova todo o meio, vire o frasco e observe se o fundo do frasco está limpo. Para células SF9, que aderem com mais firmeza, adicione quatro mililitros de meio TNM-FH fresco e utilize um espátula celular para desprender as células aderidas. Use uma pipeta serológica de cinco mililitros para misturar suavemente e reduzir a agregação celular.

Após destacar as células, transfira aproximadamente 0,1 mililitros de cada mistura de células e meio para um tubo microfúgico de 1,5 mililitro. Em um tubo microfúgico separado de 0,5 mililitro, adicione 10 microlitros de cada mistura de células e meio a 10 microlitros de azul de tripano. Retire a lâmina de câmara para contagem de células da embalagem e adicione 10 microlitros da mistura de meio celular com azul de tripano a cada lado da lâmina de contagem.

Insira a lâmina em um contador automático de células e determine a densidade celular e a viabilidade. Transfira aproximadamente de um a 1,5 vezes 10 à 6ª potência de células para frascos T25 com meio fresco. Rotule os frascos com o nome da linhagem celular, a data, o meio utilizado, o número de células adicionadas e o número de passagem.

Coloque os frascos em uma incubadora a 28 graus Celsius por até 72 horas. O procedimento de transfeção de células de inseto também deve ser realizado dentro de uma cabine de fluxo laminar. Semee um frasco T25 com até um vezes 10 à sexta potência de células Tni ou SF9 em um meio apropriado para células de inseto.

Células Tni são utilizadas nesta demonstração. Incube as células até atingirem confluência por 72 horas a 18 graus celsius. Setenta e duas horas depois, remova e descarte o meio antigo e desprenda as células Tni com quatro mililitros de meio para insetos fresco e sem soro, conforme mostrado anteriormente.

O aspecto mais difícil deste procedimento é obter a densidade apropriada de células aderidas às placas com fundo de vidro durante a transfeção. Não se deve adicionar mais do que sete vezes 10 à 5ª potência de células a cada placa. Após usar um contador automatizado de células para estimar a densidade celular, misture completamente, mas suavemente, a suspensão celular invertendo o tubo e adicione aproximadamente sete vezes 10 à 5ª potência de células a placas individuais de 35 milímetros com fundo de vidro.

Deixe as células aderirem por 20 a 25 minutos a 28 graus Celsius. Para cada transfeção, adicione dois microgramas de DNA plasmidial a 0,1 mililitro de meio para insetos sem soro, sem FBS, em um tubo microcêntrifuga estéril de 1,5 mililitro. Em um tubo separado, misture oito microlitros de reagente de transfeção com 0,1 mililitro de meio para insetos sem soro.

Em seguida, transfira a solução para o tubo contendo o DNA plasmidial de interesse. Vortexie suavemente e incube à temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. A seguir, dilua a mistura de transfeção do plasmídeo com 0,8 mililitros de meio para insetos sem soro, elevando o volume total para um mililitro.

Remova cuidadosamente o meio do recipiente de vidro contendo as células aderidas. Cubra as células aderidas com o meio de transfeção de plasmídeo diluído. Incube as células a 28 graus Celsius por cinco horas.

Após cinco horas, remova e descarte o meio de transfeção e lave suavemente as células com um mililitro de meio para insetos sem soro, tomando cuidado para não destacar as células. Adicione dois mililitros de meio fresco para células de insetos sem soro e incube a 28 graus Celsius por 48 a 72 horas. De 48 a 72 horas após a transfeção das células de insetos, lave as células uma vez com um mililitro de meio IPL-41 para insetos e, em seguida, cubra com dois mililitros de IPL-41 para obtenção de imagens.

Adicione quatro gotas do reagente de coloração vital com Hoechst ao meio e incube a 28 graus Celsius por 20 a 25 minutos. Coloque o prato de 35 milímetros no microscópio confocal a laser com compartimento fechado. Embora muitos pratos de vidro estejam comercialmente disponíveis, é importante que eles se encaixem na platina do microscópio, e pode ser necessário determinar empiricamente qual vidraria é mais compatível com a adesão celular.

Ajuste o microscópio para as condições de observação de Hoechst, EGFP e mCherry. 359 nanômetros e 461 nanômetros para excitação e emissão de Hoechst. 489 nanômetros e 510 nanômetros para excitação e emissão de EGFP.

E 580 nanômetros e 610 nanômetros para excitação e emissão do mCherry. Utilizando uma objetiva de 10X, realize uma varredura inicial para confirmar a expressão fluorescente. Em seguida, mude para o modo de varredura utilizando uma objetiva de contraste de fase de 60X com imersão em água.

Ajuste a potência do laser, a sensibilidade do detector, a velocidade de varredura, a profundidade no eixo Z e o zoom digital para otimizar o contraste e a resolução da imagem. Imagem das células com zoom digital de 1,5X para obter um total de amplificação de 90X. Salve e exporte os dados brutos como arquivos de imagem TIFF para análise posterior.

Células Tni foram transfectadas com os plasmídeos indicados e a expressão das proteínas recombinantes foi visualizada utilizando microscopia de fluorescência confocal. A transfeção bem-sucedida e a expressão de BtDrip1-EGFP recombinante são evidentes pela presença de fluorescência verde na superfície celular. Células transfectadas com a versão um de BtDrip2-EGFP mostram fluorescência verde no interior, indicando a expressão intracelular da versão um de BtDrip2.

Da mesma forma, células transfectadas com PIB DmSPR-mCherry ou PIB PLA2G15-mCherry exibem fluorescência vermelha, indicando a expressão das respectivas quimeras. Nas imagens sobrepostas, as áreas laranja ou amarelas indicam expressão de EGFP e mCherry, o que sugere que as proteínas estão co-localizadas dentro das mesmas estruturas subcelulares. Uma sobreposição de células duplamente transfectadas com PIB BtDrip1-EGFP e PIB DmSPR-mCherry sugere co-localização de BtDrip1-EGFP e DmSPR-mCherry na superfície celular.

Células duplamente transfectadas com a versão um do BtDrip2-EGFP e com o PIB-DmSPR-mCherry mostram pouca colocalização dos sinais de fluorescência verde e vermelha, confirmando a expressão intracelular da versão um do BtDrip2. Em contraste, a coexpressão do PIB-BtDrip2 versão um-EGFP e do marcador lisossomal PIB-PLA2G15-mCherry resultou em uma sobreposição significativa dos sinais fluorescentes verde e vermelho no citoplasma. Isso sugere fortemente que o BtDrip2 é direcionado aos lisossomos intracelulares.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar quimeras de proteínas fluorescentes em células de insetos cultivadas. Este sistema oferece construção rápida de vetores na síntese proteica, evita os desafios dos sistemas de expressão baseados em vírus e fornece um método robusto para observar proteínas de tráfego celular.