Desenvolvimento de um modelo de rato baseada alfa-sinucleína para a doença de Parkinson por meio de injecção estereotáxica de um vector viral recombinante adeno-associado

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um modelo animal baseado em vetor viral para a doença de Parkinson via injeção estereotáxica no sistema nervoso central. Este método pode ser usado para desenvolver modelos animais normais que permitem testes pré-clínicos de drogas e podem ser benéficos no estudo do mecanismo molecular da doença de Parkinson, bem como de muitos outros distúrbios neurodegenerativos. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para direcionar regiões específicas do cérebro.

A alta expressão cerebral de trincheira pode ser alcançada e pode ser usada para criar modelos animais em linhagens e espécies animais específicas. Os diferentes sistemas de vetores finais foram desenvolvidos. A escolha do sistema de vetores depende do tamanho da vala que você deseja expressar, da duração da expressão gênica, dos sons que você deseja atingir e das questões de biossegurança.

Demonstrando o procedimento estará Annelies Aertgeerts, técnica do nosso laboratório. Comece anestesiando adequadamente uma rata Wistar fêmea de oito semanas de idade de acordo com os protocolos aprovados. Verifique se um plano cirúrgico de anestesia foi alcançado apertando cada pata e observando a ausência do reflexo de retirada.

Em seguida, use um implantador MicroTransponder para colocar um MicroTransponder nas costas do rato. Verifique se o MicroTransponder está posicionado corretamente e se uma leitura pode ser obtida. Agora corte o cabelo no couro cabeludo do rato e aplique anestésico local no couro cabeludo e nas orelhas.

Transfira o rato para uma capela de fluxo laminar e execute o resto do procedimento usando técnica asséptica. Coloque o rato na estrutura estereotáxica, prendendo as barras auriculares, seguidas pela barra da boca e do nariz. Cubra o corpo do rato com um cobertor de papel para evitar uma queda na temperatura corporal.

Aplique um lubrificante ocular para evitar que os olhos sequem. Em seguida, desinfete o couro cabeludo de acordo com os procedimentos aprovados. Um por cento de iodo em 70% de isopropil é usado aqui.

Depois de fazer uma pequena incisão na linha média do couro cabeludo, raspe suavemente as membranas do crânio e enxágue com solução salina. Depois de deixar o crânio secar, certifique-se de que bregma e lambda possam ser vistos claramente. Agora, encha uma seringa de microinjeção de 10 microlitros, calibre 30 e 20 milômetros com AAV recombinante e coloque-a na bomba de microinjeção motorizada conectada ao instrumento estereotáxico.

Para transações específicas dos neurônios dopaminérgicos da substância negra, os vetores AV recombinantes são a primeira escolha devido aos seus altos títulos e eficiência na transdução de neurônios dopaminérgicos. Teste o fluxo, liberando uma gota de AAV. Descarte qualquer AAV liberado em um detergente de limpeza polivalente.

Verifique visualmente se a cabeça está fixada diretamente na estrutura da cabeça. Em seguida, verifique se o crânio está plano, movendo primeiro a ponta da agulha para bregma e medindo a altura neste ponto, abaixando a ponta da agulha no sentido dorsal-ventral até que toque o crânio. Repita o procedimento em lambda.

Depois de retornar a agulha ao bregma, mova a agulha na direção anterior, posterior e medial lateral para as coordenadas estereotáxicas para microinjeção. Anote as coordenadas. No local da injeção, meça a altura do crânio como antes e certifique-se de que não difere de mais de 0,3 mm da altura do bregma.

Em seguida, faça um furo de dois milímetros no crânio. Uma vez feito o furo, meça a altura da dura-máter para determinar a referência a partir da qual aplicar a coordenada dorsal-ventral. Penetre na dura-máter usando uma agulha de calibre 26.

Absorva qualquer sangue com o tecido estéril e prossiga somente depois que todo o sangramento tiver parado. Agora, abaixe lentamente a agulha da seringa de microinjeção pré-carregada no cérebro até a coordenada dorsal-ventral. E faça uma pausa por um minuto.

Em seguida, injete três microlitros de AAV a uma taxa de 0,25 microlitros por minuto. Após a injeção, deixe a agulha permanecer no lugar por mais cinco minutos para evitar o refluxo ao longo do trajeto da agulha antes de removê-la lentamente. Costure o couro cabeludo usando poliéster trançado codificado 3.0 e desinfete a pele com um por cento de iodo e 70% de isopropil.

Para afrouxar a barra do nariz e da boca e, em seguida, as duas barras auriculares, para remover suavemente o animal do instrumento estereotáxico. Neste momento, administre analgesia e, se necessário, um agente de reversão da anestesia. Em seguida, coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento ajustada para 38 graus Celsius e monitore de perto até que ele acorde.

Após a cirurgia, a cinética da neurodegeneração pode ser estudada em todo o animal usando testes comportamentais e imagens PET e após o sacrifício, usando técnicas imuno-histoquímicas. O teste do cilindro para avaliar o uso espontâneo do membro anterior foi realizado em vários momentos após a microinjeção de AAV recombinante expressando a mutação A53T alfa sinucleína na substância negra. A partir de três semanas após a injeção, o comprometimento motor significativo foi observado em ratos que receberam a dose mediana.

Quatro semanas após a injeção, foi observada uma diminuição de 50% no uso espontâneo da pata dianteira contralateral. Já os animais injetados com eGFP controle não mostraram assimetria no uso da pata dianteira. Os ratos que receberam uma dose mais alta de AAV 2 / 7A53T alfa sinucleína recombinante mostraram um comprometimento mais pronunciado do uso da pata dianteira 29 dias após a injeção.

Para provar que o comprometimento motor observado era dependente da dopamina, uma dose única de L-doba foi administrada. Quando o teste do cilindro foi repetido 45 minutos após o tratamento com L-dopa, foi observada uma recuperação completa do uso da pata dianteira nos animais injetados com alfa-sinucleína AAV 2/7A53T recombinante. Para acompanhar a cinética da neurodegeneração dopaminérgica nigroestriatal de forma não invasiva ao longo do tempo, em animais individuais, a ligação transportada pela dopamina foi quantificada usando tomografia por emissão de pósitrons em pequenos animais com F-18FECT como radioligante.

A ligação de DAT diminuiu significativamente no budiman caudado ipsilateral de ratos injetados com AAV 2 / 7A53T alfa sinucleína recombinante ao longo do tempo. Após 32 dias, foi observada uma diminuição na ligação de DAT de até 85%. Como controle positivo, a injeção da neurotoxina 6 OHDA no SN induziu 90% de perda de ligação de DAT em sete dias.

Seções cerebrais de ratos microinjetados com AAV 2/7A53T alfa-sinucleína recombinante ao longo do tempo foram imunomarcadas para tirosina hidroxilase, um marcador de neurônios dopaminérgicos. Este número demonstra a perda progressiva de neurônios dopaminérgicos ao longo de um período de 29 dias após a microinjeção. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 45 minutos.

Ao tentar este procedimento, é importante usar correspondências vetoriais finais de alta qualidade. Após este procedimento, outras técnicas, como imagens PET não invasivas, análise do comportamento e análise imuno-histoquímica podem ser realizadas para determinar o nível de neurodegeneração e neuropatologia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como realizar uma injeção de vetor viral na substância negra para desenvolver modelos animais baseados em vetores virais para a doença de Parkinson.

Não se esqueça de que trabalhar com vetores virais pode ser perigoso e que precauções como trabalhar sob fluxo laminar e descontaminação adequada de resíduos devem sempre ser tomadas seguindo este procedimento.