Desenvolvimento de um modelo de rato baseada alfa-sinucleína para a doença de Parkinson por meio de injecção estereotáxica de um vector viral recombinante adeno-associado
28 de fevereiro de 2016
Este manuscrito descreve como a entrega de genes locais mediada por vetores virais fornece uma maneira atraente de expressar transgenes no sistema nervoso central. O protocolo descreve todas as etapas cruciais para realizar uma injeção de vetor viral na substância negra do rato para desenvolver um modelo animal baseado em vetor viral para a doença de Parkinson.
O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um modelo animal baseado em vetor viral para a Doença de Parkinson por meio de injeção estereotáxica no sistema nervoso central. Este método pode ser utilizado para desenvolver modelos animais normais, que permitem testes pré-clínicos de fármacos e podem ser úteis no estudo do mecanismo molecular da Doença de Parkinson, bem como de muitos outros distúrbios neurodegenerativos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para o direcionamento específico de regiões cerebrais.
Pode-se obter uma alta expressão gênica no cérebro e utilizá-la para criar modelos animais em linhagens e espécies animais específicas. Diferentes sistemas vetoriais finais foram desenvolvidos. A escolha do sistema vetorial depende do tamanho do gene que se deseja expressar, da duração da expressão gênica, dos tecidos que se deseja direcionar e de questões de biossegurança.
O procedimento será demonstrado por Annelies Aertgeerts, uma técnica do nosso laboratório. Comece por anestesiar corretamente uma rata Wistar fêmea de oito semanas de idade, conforme protocolos aprovados. Verifique se foi alcançado um plano cirúrgico de anestesia apertando cada pata e observando a ausência do reflexo de retirada.
Em seguida, utilize um implantador MicroTransponder para posicionar um MicroTransponder na parte dorsal do rato. Verifique se o MicroTransponder está posicionado corretamente e se é possível obter uma leitura. Agora, corte os pelos do couro cabeludo do rato e aplique anestésico local no couro cabeludo e nas orelhas.
Transfira a rata para uma cabine de fluxo laminar e realize o restante do procedimento utilizando técnica asséptica. Posicione a rata no estereotáxico, fixando primeiro as hastes auriculares, seguidas pela haste bucal e nasal. Cubra o corpo da rata com um cobertor de papel para evitar queda na temperatura corporal.
Aplique um lubrificante ocular para evitar que os olhos sequem. Em seguida, desinfete o couro cabeludo de acordo com os procedimentos aprovados. Utiliza-se aqui 1% de iodo em álcool isopropílico a 70%.
Após fazer uma pequena incisão na linha média do couro cabeludo, remova cuidadosamente as membranas do crânio e lave com solução salina. Após deixar o crânio secar, certifique-se de que bregma e lambda possam ser claramente visualizados. Agora, preencha uma seringa microinjetora de 10 microlitros, com agulha de calibre 30 e comprimento de 20 milímetros, com AAV recombinante e coloque-a na bomba microinjetora motorizada conectada ao instrumento estereotáxico.
Para transdução específica dos neurônios dopaminérgicos da substância negra, vetores virais adeno-associados recombinantes são a primeira opção devido aos seus altos títulos e eficiência na transdução de neurônios dopaminérgicos. Teste o fluxo, liberando uma gota de AAV. Descarte qualquer AAV liberado em um detergente limpeza polivalente.
Verifique visualmente se a cabeça está fixada reta no suporte craniano. Em seguida, verifique se o crânio está nivelado, movendo primeiro a ponta da agulha até o bregma e medindo a altura nesse ponto, abaixando a ponta da agulha na direção dorsal-ventral até que toque o crânio. Repita o procedimento no lambda.
Após retornar a agulha ao bregma, mova a agulha nas direções ântero-posterior e médio-lateral até as coordenadas estereotáxicas para microinjeção. Anote as coordenadas. No local da injeção, meça a altura do crânio como anteriormente e certifique-se de que não difira em mais de 0,3 mm da altura do bregma.
Em seguida, faça cuidadosamente um furo de dois milímetros no crânio. Após a realização do furo, meça a altura da dura para determinar o referencial a partir do qual será aplicada a coordenada dorsal-ventral. Penetre a dura utilizando uma agulha de calibre 26.
Absorva qualquer sangue com o tecido estéril e prossiga apenas após cessar completamente a hemorragia. Agora, abaixe lentamente a agulha da seringa de microinjeção pré-carregada no cérebro até a coordenada dorsal-ventral. E espere por um minuto.
Em seguida, injete três microlitros de AAV a uma taxa de 0,25 microlitros por minuto. Após a injeção, mantenha a agulha no local por mais cinco minutos para prevenir refluxo ao longo do trajeto da agulha antes de removê-la lentamente. Suture o couro cabeludo usando poliéster trançado codificado 3,0 e desinfete a pele com iodo a 1% e isopropanol a 70%.
Para soltar a barra nasal e a barra bucal, e depois as duas barras auriculares, removendo suavemente o animal do aparelho estereotáxico. Neste momento, administre analgesia e, se necessário, um agente reversor da anestesia. Em seguida, coloque a rata em uma gaiola limpa sobre uma placa aquecida ajustada a 38 graus Celsius e monitore atentamente até que acorde.
Após a cirurgia, a cinética da neurodegeneração pode ser estudada em todo o animal utilizando testes comportamentais e imagem por PET, e após o sacrifício, utilizando técnicas de imunohistoquímica. O teste do cilindro para avaliar o uso espontâneo dos membros anteriores foi realizado em diversos momentos após a microinjeção do AAV recombinante que expressa a alfa-sinucleína com mutação A53T na substância negra. A partir de três semanas após a injeção, observou-se um comprometimento motor significativo em ratos que receberam a dose mediana.
Quatro semanas após a injeção, observou-se uma diminuição de 50% no uso espontâneo da pata dianteira contralateral. Enquanto os animais injetados com o controle eGFP não mostraram assimetria no uso da pata dianteira. Ratos que receberam uma dose mais alta do AAV recombinante 2/7A53T alfa-sinucleína apresentaram um comprometimento mais acentuado no uso da pata dianteira em 29 dias após a injeção.
Para comprovar que o déficit motor observado era dependente de dopamina, foi administrada uma única dose de L-dopa. Quando o teste do cilindro foi repetido 45 minutos após o tratamento com L-dopa, observou-se uma recuperação completa do uso da pata dianteira nos animais injetados com o vírus adeno-associado recombinante 2/7A53T alfa-sinucleína. Para acompanhar, de forma não invasiva e ao longo do tempo, a cinética da neurodegeneração dopaminérgica nigroestriatal em animais individuais, a ligação do transportador de dopamina foi quantificada utilizando tomografia por emissão de pósitrons em pequenos animais com F-18FECT como radioligante.
A ligação ao DAT diminuiu significativamente no corpo caudado ipsilateral de ratos injetados com o vírus adeno-associado recombinante 2/7A53T alfa-sinucleína ao longo do tempo. Após 32 dias, observou-se uma redução na ligação ao DAT de até 85%. Como controle positivo, a injeção da neurotoxina 6-OHDA na SN induziu perda de 90% da ligação ao DAT em sete dias.
Seções cerebrais de ratos microinjetadas com alfa-sinucleína AAV recombinante 2/7A53T ao longo do tempo foram imunomarcadas para tirosina hidroxilase, um marcador de neurônios dopaminérgicos. Esta figura demonstra a perda progressiva de neurônios dopaminérgicos ao longo de um período de 29 dias após a microinjeção. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 45 minutos.
Ao realizar este procedimento, é importante utilizar vetores finais de alta qualidade. Após este procedimento, outras técnicas, como imagem por PET não invasiva, análise comportamental e análise imunohistoquímica, podem ser realizadas para determinar o grau de neurodegeneração e neuropatologia. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma injeção de vetor viral na substância negra, com o objetivo de desenvolver modelos animais baseados em vetores virais para a Doença de Parkinson.
Não se esqueça de que trabalhar com vetores virais pode ser perigoso, e que precauções como atuar sob fluxo laminar e a descontaminação adequada de resíduos devem sempre ser tomadas ao seguir este procedimento.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este manuscrito descreve um método para desenvolver um modelo animal baseado em vetor viral para a doença de Parkinson por meio de injeção estereotáxica no sistema nervoso central. Esta técnica permite a expressão gênica direcionada em regiões cerebrais específicas, facilitando testes pré-clínicos de fármacos e o estudo de distúrbios neurodegenerativos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Terapia Genética
- Distúrbios Neurodegenerativos
Contexto
- A entrega de genes mediada por vetor viral é um método eficaz para a expressão gênica no cérebro.
- Essa abordagem pode criar modelos animais para o estudo de doenças como a de Parkinson.
- O direcionamento específico de regiões cerebrais aumenta a relevância dos modelos.
- Diferentes sistemas de vetores podem ser adaptados conforme as necessidades da pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo animal confiável para a doença de Parkinson.
- Facilitar a avaliação pré-clínica de terapias potenciais.
- Investigar os mecanismos moleculares subjacentes à doença de Parkinson.
Métodos Utilizados
- Injeção estereotáxica de vetores virais na substância negra.
- Seleção de sistemas de vetores com base no tamanho do gene e na duração da expressão.
- Alvo de linhagens e espécies animais específicas para o desenvolvimento do modelo.
- Avaliação dos níveis de expressão gênica no cérebro.
Resultados Principais
- Entrega gênica bem-sucedida para regiões cerebrais específicas.
- Estabelecimento de um modelo animal funcional para a doença de Parkinson.
- Níveis elevados de expressão do transgene observados.
- Potencial para estudos adicionais sobre mecanismos neurodegenerativos.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa da doença de Parkinson.
- A entrega mediada por vetor viral pode aprimorar a compreensão da neurodegeneração.
- Aplicações futuras podem incluir a testagem de novas estratégias terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o desenvolvimento de um modelo alvo em rato para a doença de Parkinson por meio da administração estereotáxica de vetores AAV recombinantes para a substância negra, apoiando a redução de riscos mecanicistas da patologia da alfa-sinucleína. O modelo facilita a avaliação pré-clínica da neurodegeneração dopaminérgica e de intervenções terapêuticas, fornecendo confiança preditiva para a validação de alvos em programas de doenças neurodegenerativas. Ao alcançar expressão transgênica específica de região e pontos finais comportamentais e de imagem quantificáveis, a abordagem alinha-se a fluxos de trabalho de descoberta precoce focados no esclarecimento de vias e na identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da neurodegeneração dopaminérgica mediada por alfa-sinucleína em um sistema relevante para a doença.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da expressão regional específica de transgenes e fenotipagem comportamental.
- Valor Preditivo: Fornece leituras quantitativas de motoras e de imagem que se correlacionam com a perda dopaminérgica, auxiliando no triagem pré-clínica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos validados com fenótipos neurodegenerativos mensuráveis para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Fornece saídas padronizadas e reprodutíveis por meio do teste do cilindro e imagem por PET de ligação ao DAT para prontidão do ensaio.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes alvos neurodegenerativos mediante adaptação do vetor e das coordenadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Modela a perda progressiva dopaminérgica nigroestriatal que espelha a fisiopatologia do Parkinson.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Relaciona a superexpressão da alfa-sinucleína com déficits comportamentais dependentes da dopamina e neurodegeneração.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de avançar/não avançar com base na neurodegeneração dependente da dose e na resposta à L-dopa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e os testes de eficácia pré-clínicos, permitindo a avaliação iterativa dos mecanismos neurodegenerativos e dos candidatos terapêuticos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a toxicidade da alfa-sinucleína e a elucidação de vias em neurônios dopaminérgicos.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios com desfechos quantitativos comportamentais e de neuroimagem para avaliação de compostos.
- Análises: Oferece quantificação da ligação ao DAT por meio de PET e imunohistoquímica da tirosina hidroxilase como biomarcadores translacionais de neurodegeneração.
- Pesquisa Translacional: Conecta a manipulação molecular a desfechos funcionais, apoiando a continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para modelagem de alvos neurodegenerativos por meio de entrega viral estereotáxica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da recapitulação de fenótipos-chave da doença de Parkinson.
- Valor Operacional: Procedimentos cirúrgicos e de injeção padronizados garantem reprodutibilidade entre diferentes locais e estudos.
- Valor Estratégico: Permite decisões antecipadas de avançar/não avançar baseadas em dados, reduzindo a ambiguidade mecanicista no engajamento do alvo.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de terapias direcionadas à alfa-sinucleína com base em dados de resposta à dose e reversibilidade.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia estereotáxica, manipulação de vetores virais e anestesia de roedores.
- Depende da infraestrutura de microtomia, imunohistoquímica, imagem por emissão de pósitrons (PET) e testes comportamentais.
- Necessita padronização entre equipes quanto às coordenadas, títulos de vetores e regimes de dosagem.
- As considerações para adaptação incluem a seleção do promotor, o tropismo do sorotipo e o desenho do transgene para diferentes alvos.
- As limitações práticas incluem a variabilidade cirúrgica, a difusão do vetor além dos núcleos-alvo e a cinética de expressão específica a cada espécie.
