Análise Funcional Complementação (FCA): Um Exercício Laboratório concebido e implementado para complementar o Ensino de Bioquímica Pathways

O objetivo geral do Ensaio de Complementação Funcional é elucidar a atividade de uma enzima, introduzindo uma cópia funcional do gene correspondente em uma célula mutante para ver se ela restaura um fenótipo de tipo selvagem no fundo mutante. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em uma variedade de campos, como bioquímica, microbiologia, genética, biologia vegetal, evolução e outros. A principal vantagem dessa técnica é que ela avalia a função, atividade e/ou papel de uma enzima, em condições in vivo, que normalmente são de natureza fisiológica, em oposição às condições in vitro, que normalmente são de natureza artificial.

As implicações desta técnica se estendem à identificação e/ou elucidação da função de enzimas não caracterizadas e aquelas que ainda têm funções putativas ou previstas. Demonstrando esse procedimento de complementação funcional está o estudante de biotecnologia e biociências moleculares, Taylor Harkness, aluno do meu laboratório. Após a clonagem dos genes DapL, TarB, MurE e RSH de acordo com o protocolo de texto, inocular 50 mililitros de meio líquido com uma única colônia de células bacterianas mutantes para serem transformadas com um gene de interesse e crescerem durante a noite.

No segundo dia, use a cultura noturna de 50 mililitros para inocular 1 litro do meio apropriado e crescer a 30 graus Celsius para a fase de bloqueio ou para um OD600 de 0,4 a 0,6. Colha as células por centrifugação a 5.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, decantar o sobrenadante e usar 500 mililitros de água destilada estéril, gelada e gelada para ressuspender o pellet.

Centrifugue as células novamente e, após decantar o sobrenadante, use 250 mililitros de glicerol a 10% estéril e gelado para ressuspender o pellet. Depois de girar as células uma última vez, use dois mililitros de glicerol a 10% para ressuspender as células. Transfira alíquotas de 50 microlitros para tubos de microcentrífuga e congele imediatamente colocando os tubos em um banho de etanol com gelo seco.

Armazene as células a menos 80 graus Celsius para eletroporação. Para efectuar a electroporação, adicionar 1 microlitro de plasmídeo recombinante a uma alíquota de 50 microlitros de células competentes e colocar sobre gelo durante cinco minutos. Transfira as células para uma cubeta de eletroporação e defina o aparelho de eletroporação para as seguintes configurações: capacitância de 25 graus Fahrenheit, 2.5 quilovolts e resistência de 200 ohms.

Em seguida, com a cubeta no dispositivo, forneça um pulso. Adicione 1 mililitro de meio de recuperação à cubeta e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Permitir que as células recuperem incubando a cultura numa incubadora agitada com rotação suave durante 60 minutos à temperatura adequada exigida pelo mutante.

Para selecionar os transformantes, pipetar 100 microlitros da cultura para o meio com placas de ágar e usar um espalhador estéril para espalhar a solução. Em seguida, incube durante a noite na temperatura apropriada. Consulte o protocolo de texto para obter mais detalhes.

Para realizar a análise de complementação, transforme AOH1 com o vetor vazio pBAD33 ou com vetores de expressão dapL usando eletroporação, como acabamos de demonstrar. Colocar a mistura de transformação em meio de ágar LB, suplementado com 50 microgramas por mililitro de Dap, 34 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 50 microgramas por mililitro de canamicina. Incube as placas a 30 graus Celsius por 24 horas antes de observar os resultados.

Com o vetor vazio pBAD33 ou com o vetor que expressa murE, transforme o mutante TKL-11 usando eletroporação, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Coloque os transformantes em placas de ágar LB, suplementadas com 50 microgramas por mililitro de tiamina e 34 microgramas por mililitro de cloranfenicol, e incube as placas a 30 graus Celsius por 24 horas antes de verificar se há transformadores. Teste de complementação por listras ou plaqueamentos de colônias das transformações controle e experimental em duas placas de meio LB, mais 0,2% de arabinose e 50 microgramas por mililitro de tiamina.

Incubar uma placa a 30 graus Celsius e a outra a 42 graus Celsius por 24 horas antes de avaliar o fenótipo de crescimento. Transforme a cepa Hx699 mutante e a cepa Rr217 do tipo selvagem da espécie novosphingobium com o vetor vazio pRK290 ou um vetor contendo o gene rshNsp nativo em dois eventos de transformação separados cada, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Coloque os transformantes em dextrose de batata ou ágar PD suplementado com 10 microgramas por mililitro de tetraciclina e incube por pelo menos 72 horas ou até que os transformantes apareçam.

Em seguida, risque os transformantes em um padrão X em placas de ágar PD frescas com tetraciclina. Depois de incubar a 30 graus Celsius por pelo menos quatro dias, examine visualmente o fenótipo de crescimento de ambas as placas. O duplo mutante AOH1 de E.coli abriga uma mutação no gene DapE e uma deleção do gene DapD, e não crescerá a menos que o Dap seja fornecido.

Como visto aqui, o mutante AOH1 que expressa DapLs é capaz de crescer em meio livre de LLDap, convertendo THDP em LLDap na via de lise de Dap. A enzima MurE facilita a adição de m-DAP ao peptidoglicano de bactérias gram-negativas. O mutante E.coli MurE, TKL-11, não pode crescer a 42 graus Celsius.

Neste experimento, apenas as células TKL-11 transformadas com MurE crescem a 42 graus Celsius. Uma mutação no gene TyrB impede a síntese de tirosina e fenilalanina. No entanto, como mostrado aqui, quando a cepa DL39 mutante TyrB expressa o gene A.thaliana At5g36160, ela cresce em meio M9, sem tirosina e fenilalanina, demonstrando que a enzima pode sintetizar tirosina.

O mutante Hx699 em espécies de novosphingobium abriga uma proteína RSH não funcional e produz fenótipo hipomucoidal. No entanto, a transformação com o gene RSH nativo produz polissacarídeos extracelulares mais solúveis na faixa X multicelular que é hipermucoidal. Em contraste, quando o mutante Hx699 é transformado com um vetor vazio, ele produz um fenótipo hipomucoidal.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 24 a 48 horas. Se realizada corretamente, dependendo do crescimento do organismo modelo utilizado, excluindo as etapas de clonagem, competência de preparação e transformação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar os requisitos de condição de crescimento dos mutantes usados na análise de complementação funcional.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como caracterizações axiomáticas tradicionais in vitro, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como especificidade do substrato, temperatura e pH ótimo e taxas de velocidade somática, etc. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia e em muitos campos de subdivisão, como a microbiologia, elucidarem a função in vivo, ou papel, de enzimas de uma variedade de organismos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer células bacterianas eletrocompetentes, como transformar bactérias usando eletroporação e como avaliar a função de genes/enzimas usando complementação funcional.

Não se esqueça de que trabalhar com organismos patogênicos pode ser extremamente perigoso e as precauções necessárias devem ser tomadas.