Um método rápido para processamento de sangue para aumentar o rendimento dos níveis plasmáticos de peptídeos no sangue humano

O objetivo geral deste método RAPID é melhorar o rendimento de hormônios peptídicos endógenos a serem medidos no sangue humano. O método RAPID foi recentemente estabelecido para uso em ratos e também é adequado para uso em sangue humano. O método RAPID melhora o rendimento e permite a detecção da forma molecular correta do peptídeo endógeno.

O método RAPID é fácil de usar. No entanto, o método RAPID é mais demorado e mais caro em comparação com a amostragem de sangue padrão. Portanto, pode ser mais aplicável no ambiente de pesquisa.

A demonstração visual deste método é crítica, pois a diluição oportuna das amostras, bem como a eluição, são de grande importância para garantir um nível adequado de peptídeos. Colete sangue venoso em um horário padronizado após um jejum noturno de uma veia do antebraço. E processe de acordo com procedimentos padrão, ou o método RAPID.

Instrua os sujeitos a não se exercitarem ou fumarem antes da retirada de sangue. Para processamento padrão, colete sangue em tubos contendo EDTA resfriados e centrifugue em 10 minutos a 3000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante e mantenha-o a menos 80 graus Celsius até processamento adicional por radioimunoensaio.

Para processamento RÁPIDO, dilua imediatamente o sangue de um a 10, em tampão RAPID gelado. PH três vírgula seis, contendo zero vírgula um molar amoniumasitate. Cloreto de sódio de cinco molares de ponto zero e inibidores enzimáticos.

Dentro de 10 minutos, centrifugue a amostra RAPID a 3000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius e colete o sobrenadante usando uma pipeta. Em seguida, carregue os cartuchos de cromatografia com 100% de actitonitrila, a 10 mililitros por minuto. Após o equilíbrio com 0,1% trifluoroacético ou TFA.

Carregar com o sobrenadante de amostra RAPID, a uma taxa constante de um mililitro por minuto, utilizando uma bomba de seringa. Após lavar os cartuchos com três mililitros de 0,1% de TFA, a 10 mililitros por minuto, eluir lentamente a amostra RAPID com dois mililitros de acetonitrila a 70% contendo 0,1% de TFA, a dois mililitros por minuto. Secar as amostras eluídas por centrifugação a vácuo e conservá-las a 80 graus Celsius negativos, até ao processamento posterior por radioimunoensaio.

Obtenha iodo 125 peptídeos humanos marcados com rádio. Mantenha os peptídeos em pó até o experimento. Em seguida, dilua novamente em ácido acético a 0,1%.

Para processamento padrão, logo após a retirada de sangue, em tubos contendo EDTA resfriados, transfira um mililitro de sangue em um tubo com 50 microlitros de radiomarcador, contendo 3000 a 6000 CPM. Para o processamento RAPID, transfira um mililitro de EDTA contendo sangue para um tubo contendo nove mililitros de tampão RAPID e 500 microlitros de radiomarcador contêm 30.000 a 60.000 CPM. Devido à diluição de um a 10, use um volume 10 vezes maior de radiomarcador para processamento RÁPIDO.

Diretamente após a aplicação das diferentes etapas do método RAPID, avalie a recuperação de peptídeos marcados radioativamente usando um contador gama. Não seque as amostras por centrifugação a vácuo e observe o armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para medição, transferir o sobrenadante para tubos que se encaixam no contador gama.

E avalie as contagens por minuto. Medir todo o sobrenadante em amostras-padrão. Em amostras RAPID, analise um décimo do volume total para obter uma quantidade comparável de radiomarcador usado.

Como padrão de 100%, use duas amostras com 50 microlitros de peptídeo radiomarcado de iodo 125 que não passam por processamento. Meça a radioatividade de todas as amostras ao mesmo tempo. Retire o sangue, em tubos contendo EDTA resfriados, e transfira um mililitro para tubos contendo 200 microlitros de acil grelina radiomarcada, contendo 15.000 a 20.000 CPM, para processamento padrão.

Para o processamento RAPID, transfira um mililitro de sangue para um tubo contendo nove mililitros de tampão rápido e 200 microlitros de acil grelina radiomarcada contendo 15.000 a 20.000 CPM. Depois, processe as amostras como antes. Para análise posterior por HPLC de fase reversa, carregue diretamente as amostras em uma coluna C18 de ligação estável equilibrada em 17% de acetonitrila em água suplementada com 0,1% de TFA.

Após cinco minutos de equilíbrio, use um gradiente de 17 a 40% de acetonitrila, para eluir a amostra em 40 minutos, a um mililitro por minuto. Colete frações de um mililitro a cada minuto e analise a radioatividade usando um contador gama. Em um experimento separado, carregue 200 microlitros de acil grelina radiomarcada contendo 15.000 a 20.000 CPM diretamente na coluna e execute HPLC como antes.

Para radioimunoensaio, descongele os sobrenadantes congelados e o pó seco a vácuo à temperatura ambiente. Imediatamente antes do radioimunoensaio, suspender novamente as amostras secas de RAPID em água bidestilada Avaliar a kisspeptina e a grelina total, bem como a acil grelina, usando radioimunoensaios comerciais de acordo com os protocolos do fabricante.

Use tubos de borossilicato que permitam a formação estável da paleta. No primeiro dia, incubar as amostras com tampão de ensaio e corpo primário, na diluição fornecida pelo fabricante por um período de 24 horas. No segundo dia, adicione o marcador de iodo 125, vórtice e incube por um período de 24 horas.

No terceiro dia, adicione o reagente de percipitação, vórtice e incube conforme recomendado pelo fabricante. Em seguida, centrifugue os tubos a 3.000 Gs por 20 minutos a quatro graus Celsius. Remover os sobrenadantes e contar a radioactividade nas paletas, utilizando um contador gama.

Calcule a desacil grelina, como a diferença da grelina total menos a acila grelina. Avalie a relação acila, desacil grelina, mergulhando acila por desacil grelina para cada amostra individual. Se possível, processar todas as amostras num único lote, para evitar a variabilidade entre ensaios.

O processamento sanguíneo RAPID aumenta o rendimento de peptídeos radiomarcados com iodo 125 no sangue humano, em comparação com o processamento de sangue padrão. Após o processamento sanguíneo padrão, a recuperação de peptídeos radiomarcados variou de 48% a 68% em nove peptídeos. O processamento RAPID melhorou o rendimento em todos os peptídeos marcados com iodo 125, com uma recuperação variando de 71% a 98% Aqui é mostrado o perfil de eluição da acil grelina marcada com iodo 125 no sangue humano após o processamento de sangue padrão ou RAPID.

Após o processamento RAPID, a grelina marcada com iodo 125 escapou na posição esperada. Enquanto após o procedimento padrão, um pico mais precoce foi observado. Provavelmente correspondendo a desacil grelina.

Isso representou uma degradação de 62% do peptídeo. O processamento de sangue RAPID melhora a relação acila, desacil grelina em comparação com o processamento padrão. Após o processamento RAPID, a proporção de acila, desacil grelina no sangue de indivíduos com peso normal foi de um a três.

Em comparação com um a 23 após o processamento de sangue padrão. Resultados semelhantes foram observados em condições anoréxicas e obesas. O processamento sanguíneo RÁPIDO resulta em aumento dos níveis sanguíneos de kisspeptina endógena em comparação com o processamento padrão.

Em indivíduos anoréxicos e com peso normal, os níveis de kisspeptina endógena circulante foram significativamente mais altos após o RAPID em comparação com o processamento padrão. A diferença não atingiu significância em condições de obesidade. Uma vez dominada e executada corretamente, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora.

Este método é especialmente importante quando a concentração esperada do peptídeo é baixa ou as diferenças entre os grupos são pequenas. Uma recomendação geral para peptídeos não pode ser dada. O benefício potencial de cada peptídeo deve ser testado uma vez no início.

Essa técnica abre caminho para pesquisadores de diferentes áreas explorarem o rendimento e, mais importante, a forma molecular correta dos hormônios peptídicos endógenos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar o método RAPID para processamento de sangue em humanos.