Um método rápido para processamento de sangue para aumentar o rendimento dos níveis plasmáticos de peptídeos no sangue humano
28 de abril de 2016
O método de transformação rápida de sangue pode ser usado em seres humanos e produz níveis mais elevados de péptidos, bem como permite a avaliação da forma molecular correcto. Portanto, este método vai ser uma ferramenta valiosa na investigação peptídeo.
O objetivo geral deste método RAPID é melhorar o rendimento de hormônios peptídicos endógenos a serem medidos no sangue humano. O método RAPID foi recentemente estabelecido para uso em ratos e também é adequado para uso em sangue humano. O método RAPID melhora o rendimento e permite a detecção da forma molecular correta do peptídeo endógeno.
O método RAPID é fácil de usar. No entanto, o método RAPID é mais demorado e mais caro em comparação com a amostragem de sangue padrão. Portanto, pode ser mais aplicável no ambiente de pesquisa.
A demonstração visual deste método é crítica, pois a diluição oportuna das amostras, bem como a eluição, são de grande importância para garantir um nível adequado de peptídeos. Colete sangue venoso em um horário padronizado após um jejum noturno de uma veia do antebraço. E processe de acordo com procedimentos padrão, ou o método RAPID.
Instrua os sujeitos a não se exercitarem ou fumarem antes da retirada de sangue. Para processamento padrão, colete sangue em tubos contendo EDTA resfriados e centrifugue em 10 minutos a 3000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante e mantenha-o a menos 80 graus Celsius até processamento adicional por radioimunoensaio.
Para processamento RÁPIDO, dilua imediatamente o sangue de um a 10, em tampão RAPID gelado. PH três vírgula seis, contendo zero vírgula um molar amoniumasitate. Cloreto de sódio de cinco molares de ponto zero e inibidores enzimáticos.
Dentro de 10 minutos, centrifugue a amostra RAPID a 3000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius e colete o sobrenadante usando uma pipeta. Em seguida, carregue os cartuchos de cromatografia com 100% de actitonitrila, a 10 mililitros por minuto. Após o equilíbrio com 0,1% trifluoroacético ou TFA.
Carregar com o sobrenadante de amostra RAPID, a uma taxa constante de um mililitro por minuto, utilizando uma bomba de seringa. Após lavar os cartuchos com três mililitros de 0,1% de TFA, a 10 mililitros por minuto, eluir lentamente a amostra RAPID com dois mililitros de acetonitrila a 70% contendo 0,1% de TFA, a dois mililitros por minuto. Secar as amostras eluídas por centrifugação a vácuo e conservá-las a 80 graus Celsius negativos, até ao processamento posterior por radioimunoensaio.
Obtenha iodo 125 peptídeos humanos marcados com rádio. Mantenha os peptídeos em pó até o experimento. Em seguida, dilua novamente em ácido acético a 0,1%.
Para processamento padrão, logo após a retirada de sangue, em tubos contendo EDTA resfriados, transfira um mililitro de sangue em um tubo com 50 microlitros de radiomarcador, contendo 3000 a 6000 CPM. Para o processamento RAPID, transfira um mililitro de EDTA contendo sangue para um tubo contendo nove mililitros de tampão RAPID e 500 microlitros de radiomarcador contêm 30.000 a 60.000 CPM. Devido à diluição de um a 10, use um volume 10 vezes maior de radiomarcador para processamento RÁPIDO.
Diretamente após a aplicação das diferentes etapas do método RAPID, avalie a recuperação de peptídeos marcados radioativamente usando um contador gama. Não seque as amostras por centrifugação a vácuo e observe o armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para medição, transferir o sobrenadante para tubos que se encaixam no contador gama.
E avalie as contagens por minuto. Medir todo o sobrenadante em amostras-padrão. Em amostras RAPID, analise um décimo do volume total para obter uma quantidade comparável de radiomarcador usado.
Como padrão de 100%, use duas amostras com 50 microlitros de peptídeo radiomarcado de iodo 125 que não passam por processamento. Meça a radioatividade de todas as amostras ao mesmo tempo. Retire o sangue, em tubos contendo EDTA resfriados, e transfira um mililitro para tubos contendo 200 microlitros de acil grelina radiomarcada, contendo 15.000 a 20.000 CPM, para processamento padrão.
Para o processamento RAPID, transfira um mililitro de sangue para um tubo contendo nove mililitros de tampão rápido e 200 microlitros de acil grelina radiomarcada contendo 15.000 a 20.000 CPM. Depois, processe as amostras como antes. Para análise posterior por HPLC de fase reversa, carregue diretamente as amostras em uma coluna C18 de ligação estável equilibrada em 17% de acetonitrila em água suplementada com 0,1% de TFA.
Após cinco minutos de equilíbrio, use um gradiente de 17 a 40% de acetonitrila, para eluir a amostra em 40 minutos, a um mililitro por minuto. Colete frações de um mililitro a cada minuto e analise a radioatividade usando um contador gama. Em um experimento separado, carregue 200 microlitros de acil grelina radiomarcada contendo 15.000 a 20.000 CPM diretamente na coluna e execute HPLC como antes.
Para radioimunoensaio, descongele os sobrenadantes congelados e o pó seco a vácuo à temperatura ambiente. Imediatamente antes do radioimunoensaio, suspender novamente as amostras secas de RAPID em água bidestilada Avaliar a kisspeptina e a grelina total, bem como a acil grelina, usando radioimunoensaios comerciais de acordo com os protocolos do fabricante.
Use tubos de borossilicato que permitam a formação estável da paleta. No primeiro dia, incubar as amostras com tampão de ensaio e corpo primário, na diluição fornecida pelo fabricante por um período de 24 horas. No segundo dia, adicione o marcador de iodo 125, vórtice e incube por um período de 24 horas.
No terceiro dia, adicione o reagente de percipitação, vórtice e incube conforme recomendado pelo fabricante. Em seguida, centrifugue os tubos a 3.000 Gs por 20 minutos a quatro graus Celsius. Remover os sobrenadantes e contar a radioactividade nas paletas, utilizando um contador gama.
Calcule a desacil grelina, como a diferença da grelina total menos a acila grelina. Avalie a relação acila, desacil grelina, mergulhando acila por desacil grelina para cada amostra individual. Se possível, processar todas as amostras num único lote, para evitar a variabilidade entre ensaios.
O processamento sanguíneo RAPID aumenta o rendimento de peptídeos radiomarcados com iodo 125 no sangue humano, em comparação com o processamento de sangue padrão. Após o processamento sanguíneo padrão, a recuperação de peptídeos radiomarcados variou de 48% a 68% em nove peptídeos. O processamento RAPID melhorou o rendimento em todos os peptídeos marcados com iodo 125, com uma recuperação variando de 71% a 98% Aqui é mostrado o perfil de eluição da acil grelina marcada com iodo 125 no sangue humano após o processamento de sangue padrão ou RAPID.
Após o processamento RAPID, a grelina marcada com iodo 125 escapou na posição esperada. Enquanto após o procedimento padrão, um pico mais precoce foi observado. Provavelmente correspondendo a desacil grelina.
Isso representou uma degradação de 62% do peptídeo. O processamento de sangue RAPID melhora a relação acila, desacil grelina em comparação com o processamento padrão. Após o processamento RAPID, a proporção de acila, desacil grelina no sangue de indivíduos com peso normal foi de um a três.
Em comparação com um a 23 após o processamento de sangue padrão. Resultados semelhantes foram observados em condições anoréxicas e obesas. O processamento sanguíneo RÁPIDO resulta em aumento dos níveis sanguíneos de kisspeptina endógena em comparação com o processamento padrão.
Em indivíduos anoréxicos e com peso normal, os níveis de kisspeptina endógena circulante foram significativamente mais altos após o RAPID em comparação com o processamento padrão. A diferença não atingiu significância em condições de obesidade. Uma vez dominada e executada corretamente, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora.
Este método é especialmente importante quando a concentração esperada do peptídeo é baixa ou as diferenças entre os grupos são pequenas. Uma recomendação geral para peptídeos não pode ser dada. O benefício potencial de cada peptídeo deve ser testado uma vez no início.
Essa técnica abre caminho para pesquisadores de diferentes áreas explorarem o rendimento e, mais importante, a forma molecular correta dos hormônios peptídicos endógenos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar o método RAPID para processamento de sangue em humanos.
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Visão geral
O método de processamento de sangue RAPID melhora o rendimento de hormônios peptídeos endógenos no sangue humano, permitindo uma avaliação precisa da forma molecular. Este método, inicialmente desenvolvido para ratos, é fácil de usar, mas pode ser mais adequado para pesquisa devido aos seus requisitos de maior custo e tempo.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Pesquisa de peptídeos
- Métodos de processamento de sangue
- Hormônios endógenos
Fundo
- O método RAPID melhora o rendimento de peptídeos em amostras de sangue.
- Permite a detecção de formas moleculares corretas de peptídeos.
- Originalmente estabelecido para uso em ratos.
- Adaptável para aplicações em sangue humano.
Objetivo do estudo
- Melhorar a medição de hormônios peptídeos endógenos.
- Fornecer um método confiável para avaliar as formas moleculares dos peptídeos.
- Avaliar a viabilidade do método RAPID no sangue humano.
Métodos utilizados
- Técnica de processamento de sangue RAPID
- Comparação com métodos padrão de amostragem de sangue
- Avaliação dos níveis de peptídeos e formas moleculares
- Aplicação em sangue de rato e humano
Principais resultados
- Níveis mais elevados de peptídeos obtidos usando o método RAPID.
- Avaliação precisa das formas moleculares dos peptídeos.
- Método é fácil de usar, mas mais demorado e caro.
- Possivelmente mais aplicável em ambientes de pesquisa.
Conclusões
- O método RAPID é uma ferramenta valiosa para pesquisa de peptídeos.
- Oferece melhorias significativas sobre os métodos padrão.
- Pesquisas adicionais podem otimizar sua aplicação em ambientes clínicos.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of endogenous peptide hormones is critical for target validation in metabolic disease research, where low abundance and rapid degradation compromise data reliability. The RAPID method addresses this challenge by stabilizing peptides during blood processing, thereby improving assay sensitivity and enabling detection of correct molecular forms. This supports mechanistic de-risking in early discovery by reducing false negatives and enhancing predictive confidence in biomarker measurements.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by improving recovery of labile peptides such as acyl ghrelin and kisspeptin, reducing false-negative rates in target engagement studies.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for peptide stabilization that supports reproducible target validation across laboratories.
- Predictive Value: Increases confidence in biomarker quantification by preserving the native molecular form, aiding in go/no-go decisions for targets with low circulating concentrations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates higher-yield peptide samples, improving signal-to-noise ratios in radioimmunoassay and mass spectrometry-based screening campaigns.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through consistent peptide recovery, reducing variability in high-throughput screening outputs.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for downstream screening, enhancing platform reuse in peptide-focused discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant systems by maintaining peptide integrity across normal weight, anorexic, and obese conditions, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing reliable peptide measurements for pharmacokinetic and pharmacodynamic modeling.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in peptide hormone measurements.
Pipeline & Workflow Integration
The RAPID method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and biomarker assessment prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by improving detection of endogenous peptides like glucagon-like peptide-1 and insulin, enabling clearer pathway interrogation.
- Screening: Enhances assay readiness through improved peptide recovery and molecular form accuracy, enabling reliable compound evaluation in functional assays.
- Analytics: Delivers quantitative outputs such as acyl/desacyl ghrelin ratios and peptide recovery rates, helping teams compare experimental conditions with greater precision.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining peptide integrity across disease models, supporting biomarker alignment in metabolic research.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable sample preparation capability rather than a single-use technique, enabling consistent application across multiple peptide targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by improving peptide yield and preserving correct molecular forms, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of peptide measurements across sample processing workflows.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing false negatives in low-abundance peptide detection, improving capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets by providing more reliable biomarker data for advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peptide biochemistry and protease inhibition to properly formulate and apply the RAPID buffer.
- Needs access to refrigerated centrifuges, vacuum concentrators, and HPLC systems for sample processing and analysis.
- Demands cross-team standardization of blood collection timing, fasting state, and processing delays to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different peptide classes or sample volumes beyond the validated range.
- Involves higher reagent costs and processing time compared to standard EDTA-on-ice methods, limiting routine use to focused research applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Blood Processing
3:14
Recovery of Radiolabled Peptides
5:15
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Radiolabled Ghrelin
6:50
Radioimmunoassay
8:42
Results: Comparison of RAPID Method Versus Standard Processing for Assessing Plasma Peptide Levels in Human Blood
10:43
Conclusion
