Through the Looking Glass: Microscopia Time-lapse e Longitudinal de rastreamento de células individuais para estudar Therapeutics Anti-câncer

O objetivo geral deste procedimento é observar a resposta terapêutica contra o câncer em células individuais em cultura. Este método pode responder a questões fundamentais na área de pesquisa do câncer, incluindo a resposta terapêutica heterogênea e o destino celular. Para começar, sob uma capela de fluxo laminar estéril certificada, prepare as células HT1080 em placas certificadas para cultura celular de acordo com o protocolo descrito e incube as células em uma incubadora de cultura celular umidificada.

Dois dias antes da aquisição de imagens, semeie 50.000 células HT1080 FuGENE por poço no número desejado de poços de uma placa de 12 poços com fundo de vidro nº 1,5. Ajuste o número de células semeadas conforme a taxa de crescimento e o tipo de placa utilizado, de modo a obter aproximadamente 60% de confluência no início do experimento.

Configure a câmara ambiental com aproximadamente 80% de umidade e temperatura ajustada na posição da amostra em 37 graus Celsius. Certifique-se de que o reservatório de água esteja cheio com água destilada estéril, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, ligue a câmara ambiental na temperatura desejada e posicione-a no estágio do microscópio e configure.

Se houver qualquer espaço livre entre a câmara superior da platina e o encaixe da platina, coloque pedaços de filme de parafina sobre as bordas da abertura do encaixe da platina, antes de inserir a câmara, para acoplar a câmara à platina. Certifique-se de que nenhuma conexão esteja puxando a câmara, pois ambos os casos podem introduzir artefatos de movimento. Insira uma placa falsa com água na câmara e permita que a câmara equilibre a 37 graus Celsius, mantendo então uma temperatura estável.

Para preparar a microscopia, ligue o microscópio, o computador e todos os periféricos necessários. Dependendo da fonte de luz, aguarde para ligá-la somente quando necessário. Com o revólver de objetivas em uma posição baixa, selecione a objetiva de 20x com abertura numérica de 0,7.

Em seguida, posicione a amostra sobre a objetiva, o que facilitará a localização das células quando a amostra estiver na câmara. Após transferir as células a serem imageadas para a câmara ambiental, conforme o protocolo descrito, feche a câmara para manter um ambiente estável e ligue o gás atmosférico. Em seguida, selecione as condições de aquisição de imagens que previnam a fototoxicidade, limitando os tempos de exposição e utilizando luz de menor intensidade.

Para encontrar os planos X, Y e Z e os comprimentos de onda desejados para cada posição a ser imageada. Para um registro prolongado da maioria dos processos celulares, adquira uma imagem a cada dez a vinte minutos. Uma resolução temporal maior fornece mais pontos de dados e um rastreamento celular mais robusto, mas resulta em maior exposição acumulada à luz e conjuntos de dados maiores.

Como as HT1080 FuGENE possuem proteínas fluorescentes verdes e vermelhas dinâmicas, utilize os seguintes tempos de exposição e use uma binarização dois por dois. Nas configurações avançadas, ative o foco automático controlado por software usando as configurações padrão. Defina um intervalo de foco automático de 10 micrômetros com o tamanho de passo recomendado.

No recipiente experimental, para reduzir a deriva térmica, substitua metade do meio por meio contendo a droga desejada previamente aquecido a 37 graus Celsius. Por fim, inicie o intervalo de tempo e adquira as imagens de acordo com o protocolo descrito no texto. Esses filmes mostram exemplos de um par de linhagens celulares de câncer de mama MCF7 emparelhadas que diferem apenas em seu status de p53, as quais foram tratadas com uma droga anticancerígena que inibe a quinesina-5, resultando em parada mitótica.

Como visto nesta figura, quando o p53 é removido por meio de silenciamento estável do p53, em vez de sofrerem arresto após saírem da mitose, as células passam por ciclos repetidos nos quais entram em uma segunda rodada de mitose ao invés de sofrerem arresto, e saem da mitose sem divisão. São mostradas aqui células de carcinoma cervical derivadas de Hela que expressam estavelmente o marcador de cromatina Histona 2b fundido ao mCherry e a beta tubulina fundida ao EGFP. Quando tratadas com o fármaco estabilizador de microtúbulos paclitaxol, o alinhamento e a segregação cromossômica são interrompidos durante a mitose, resultando na formação de protuberâncias nucleares e micronúcleos, que são propensos a danos no DNA.

Esta linhagem celular coexpressa de forma estável os dois indicadores fluorescentes de ciclo celular baseados na ubiquitina para CDT1, em laranja, e geminina em verde, e progride normalmente pelo ciclo celular. Quando as mesmas células são tratadas com o inibidor de CDK46, as células progridem pela fase G2 e se dividem normalmente, mas depois apresentam forte arresto na fase G1, indicando o potencial de efeitos citostáticos eficazes em tumores em crescimento. A principal vantagem desta técnica é que você pode acompanhar diretamente, em tempo real e ao longo de muitos dias, a resposta de uma única célula, em vez de inferir essas respostas.