Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

O objetivo geral deste protocolo é usar imagens ao vivo in vivo para rastrear uma infecção por tripanossomas em tempo real, visualizando o sangue inicial até os estágios finais da infecção cerebral no camundongo, imitando a progressão clínica da doença do sono. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do tripanossomo, identificando potenciais novos tratamentos terapêuticos e avaliando a eficácia contra a infecção. A principal vantagem dessa técnica é que a avaliação do medicamento pode ser estabelecida em 90 dias, em oposição aos 180 dias necessários para o modelo de tipo de papel anterior.

Este protocolo pode fornecer informações sobre a tripanossomíase africana humana, mas também é aplicável a outros modelos de doenças infecciosas, como tuberculose ou doença de Chagas. Comece colocando camundongos fêmeas CD1 de 21 a 25 gramas em uma caixa de aquecimento para dilatar as veias da cauda. Em seguida, coloque os camundongos aquecidos individualmente em um dispositivo de contenção de plástico e use uma agulha de calibre 25 para injetar 0,2 mililitros de innóculo diluído do tripanossomo brucei GVR35VSL2 por via intravenosa na veia da cauda, colocando pressão no local da injeção imediatamente após para conter o sangramento.

Para monitorar a infecção por meio de microscopia de esfregaço, coloque cinco microlitros de sangue em uma lâmina de vidro. Use uma segunda lâmina de vidro para espalhar suavemente a gota na primeira lâmina, produzindo uma película fina. Deixe as lâminas secarem ao ar e depois fixe o sangue em 100% de metanol seguido de 10 minutos em Giemsa.

No final da incubação, enxágue as lâminas com água destilada e deixe-as secar ao ar. Em seguida, conte o número de tripanossomas em 10 campos de visão em um subjetivo de 100x. Para rastrear a infecção por imagens bioluminescentes, aqueça uma alíquota de D-luciferina à temperatura ambiente.

Em seguida, use uma agulha de calibre 25 para injetar intraperitonealmente 150 miligramas por quilograma de luciferina aquecida por animal. Em seguida, inicialize a máquina usando o software do gerador de imagens de acordo com as instruções do fabricante. Então, quando a câmera e a placa aquecida atingirem as temperaturas apropriadas, coloque grandes separadores pretos entre os animais anestesiados para minimizar o sangramento de qualquer sinal bioluminescente brilhante.

Fotografe os camundongos usando uma série de tempos de exposição com binning médio, um F-stop e um filtro aberto e um campo de visão E de 12,5 vezes 12,5 centímetros. Para garantir uma imagem completa dos camundongos, gire os animais para obter as vistas ventral, dorsal e lateral. No dia 21, imagem e filme de sangue dos camundongos, conforme demonstrado.

Em seguida, dose os animais com 40 miligramas por quilograma de aceturato de diminazina por via intraperitoneal para eliminar a parasitemia periférica. Depois de obter imagens dos animais no dia 35, coloque os cérebros excisados em uma seção de plástico preto e coloque 50 microlitros de 15 miligramas por mililitro de luciferina sobre os tecidos. Em seguida, imagine o cérebro usando as mesmas configurações demonstradas para a imagem de todo o animal.

Para quantificar o grau de bioluminescência em regiões específicas de interesse, ou ROIs, selecione a ferramenta ROI no software de imagem e crie uma ROI retangular para a quantificação de todo o animal. Posicione o ROI sobre a imagem do mouse da ponta do nariz até a base da cauda e, usando a caixa do mesmo tamanho para cada animal e cada ponto de tempo, meça o fluxo total. Para avaliar apenas o ROI do cérebro, crie um ROI circular e coloque-o sobre a região da cabeça do animal.

Repita para cada animal e meça o fluxo total. Em seguida, usando a imagem com a maior bioluminescência e a guia de ajuste de imagem na paleta de ferramentas, selecione uma escala logarítmica e uma escala de cores mínima e máxima apropriada para a imagem e aplique essa escala a todas as imagens dentro do experimento. O desenvolvimento da infecção pode ser seguido in vivo por medições sequenciais da bioluminescência para determinar o grau de infecção nos animais ao longo de um experimento.

À medida que a infecção progride, um aumento na bioluminescência pode ser observado em todos os animais nos primeiros 21 dias, à medida que o sinal se torna mais disseminado e intenso, com as regiões mais altas de bioluminescência aparentes na área do baço. No dia 21, os camundongos são tratados com pós-imagem de aceturato de diminazina, como acabamos de demonstrar, resultando em apenas baixos níveis de bioluminescência presentes no cérebro no dia 28, à medida que a infecção periférica é eliminada. No dia 35, o sinal não só ainda está presente na região da cabeça, mas também se tornou mais intenso, indicando uma possível infecção cerebral.

A quantificação tanto da parasitemia periférica quanto da bioluminescência permite a avaliação da cinética da doença. Por exemplo, neste experimento, no dia 7 foi observado um alto sinal de bioluminescência de um vezes 10 elevado ao 8º fótons por segundo, enquanto a parasitemia observada foi muito baixa nos esfregaços de sangue gerados no mesmo dia. No dia 28, a parasitemia tornou-se indetectável nos esfregaços de sangue devido ao tratamento com aceturato de diminazeno administrado no dia 21, enquanto a bioluminescência continuou acima dos níveis de fundo até o dia 35, representando a bioluminescência observada na região da cabeça e confirmando a maior sensibilidade da análise de bioluminescência sobre o esfregaço de sangue.

A imagem de bio uminescência do próprio cérebro revela diferenças na carga de infecção entre os animais, que não parece se localizar em regiões anatômicas específicas do tecido. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de obter uma boa faixa de tempos de exposição para garantir dados de imagem de qualidade, pois a superexposição, por exemplo, afeta negativamente detalhes importantes da localização. Após este procedimento, outros métodos a jusante, como PCR quantitativo e imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a carga de parasitas cerebrais e a localização de parasitas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do tripanossomo realizarem a avaliação de medicamentos dentro de 90 dias após a infecção, devido à maior sensibilidade da detecção de recaídas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar imagens de bioluminescência da infecção por tuberculose para acompanhar a progressão da doença desde o sangue até a infecção em estágio avançado do cérebro.