Name: Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a usar imagem bioluminescente in vivo para rastrear infecção por Trypanosoma brucei em camundongos, visualizando estágios tardios no sistema nervoso central. Este método reduz o tempo de avaliação de fármacos de 180 para 90 dias.

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Agradecemos a John Kelly e Martin Taylor (London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine) para a prestação de T. b. brucei GVR35-VSL-2 e Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) para o conselho em imagem in vivo. Este trabalho foi financiado pela Fundação Programa de Saúde Global Bill e Melinda Gates (número de concessão OPPGH5337).

Ética Todo o trabalho foi realizado sob a aprovação do Reino Unido Escritório Animais (Scientific Procedures) Act 1986 e da London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine Animal Welfare and Ethics Review Board. CHEGADA orientação são seguidos neste relatório. 1. In Vivo Passagem de Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei <ol><li> Remover um estoque criopreservado (stabilate denominado) de T. b. brucei estirpe GVR35-VSL-2 (disponível a partir de Professor John Kelly na London School of Hygiene &amp; Tropical Medicine através MTA) 9 de azoto líquido e deixar equilibrar à temperatura ambiente. Diluir stabilate a 2 x 10 4 tripanossomas / ml em solução salina tamponada com fosfato de glicose (PBS-G) estéril de pH 8,0 (1 L PBS + glucose 15 g) 10. Nota: T. b. brucei GVR35-VSL-2 é não infecciosa para os seres humanos e requer SAPO licenciado instalações para a realização de experimentos. </li><li> inject de 20-25 g feminina rato CD1 com 0,2 ml diluído tripanossomas por via intraperitoneal (ip) com uma agulha 25 G. Este é o &quot;rato doador&quot;. Coloque o rato infectado em um Specific Pathogen Free (SPF) -cage e alimentação ad libitum. Nota: ratinhos CD1 são uma estirpe não consanguíneos e T. b. infecções brucei GVR35 estão bem caracterizados nesta estirpe. No entanto, este protocolo é igualmente aplicável às estirpes puras ou geneticamente modificados, mas é importante notar que a cor da pele pode ter impacto sobre a sensibilidade da imagem 6,9. </li><li> Monitorar parasitemia periférica por amostragem de sangue. Colocar o rato dentro de um limitador de plástico e levar de 5 ul de sangue a partir da cauda por punção venosa com 21 L de agulha ou flebotomia e misturar 1/10 com cloreto de amónio estéril de 0,85%, para lisar as células vermelhas do sangue e permitir a contagem mais fácil. </li><li> Contar o sangue diluído em um Neubauer hemocitômetro. <ol><li> Carregar o sangue diluído em ambas as câmaras. Contagem de toda a central de grID de uma câmara para dar N tripanossomas. Concentração de tripanossomas sanguíneos em = N x 10 4 / ml tripanossomas, ajustar para qualquer factor de diluição e calcular a média das duas câmaras. Nota: Após cerca de 5-7 dias após a infecção, parasitemia periférica deve subir suficientemente para levar a cabo uma infecção com uma concentração de 2 x 10 4 tripanossomas / ml. </li></ol></li><li> Quando os níveis de tripanossomas são altos o suficiente para o número de ratos necessários, vá para a etapa 1.6. Um nível de parasitémia de 6 x 10 4 tripanossomas / ml em um rato dador é suficiente para a infecção de 10 ratinhos. Nota: Para tamanhos estatisticamente significativas de grupo, n = 6 para cada grupo de tratamento de ratinhos são necessários 8. Para outros modelos de infecção, cálculos de alimentação teria de ser aplicado para determinar tamanhos de grupo apropriados. </li><li> Coloque ratos em uma caixa de calor (a 28-30 ° C durante cerca de 5-10 minutos) para permitir que as veias da cauda para dilatar.Para induzir a anestesia terminal, administrar 20 mg / kg iv pentobarbital com uma agulha 25 G. Confirmar rato é anestesiado, pressionando suavemente as patas para garantir que não haja reflexo de retirada. </li><li> Heparinizar uma agulha G 21, por alíquotas de 5 ml de heparina em 5.000 USP unidades / ml para um tubo de bijou e chupando duas vezes dentro e para fora da agulha ligada a uma seringa de 1 ml. </li><li> Leve o heparinizado 21 G agulha e seringa de 1 ml, e realizar punção cardíaca no rato passagem anestesiado pela inserção da agulha centralmente por baixo da caixa torácica (uma gota de sangue vai reunir na base da agulha) e puxe o êmbolo de modo a não entrar em colapso da câmara do coração. Recolha um mínimo de 0,7 ml de sangue. </li><li> Dilui-se o sangue infectado para produzir um inoculo de 2 x 10 4 tripanossomas / ml em PBS-G a pH 8,0 como passo 1.1 acima. Nota: Neste ponto, o sangue restante pode ser criopreservadas para produzir stabilate por mistura com 8% de glicerol, 20% de Ca fetal inactivado pelo calorsoro lf (oi-FCS) e sangue infectado de 72%. Lentamente congelar a -80 ° C por meio de um processo lento de congelação-congelação recipiente para atingir uma taxa de arrefecimento de 1 ° C / min, antes de transferir para azoto líquido. </li></ol> 2. infecção de camundongos Experimental <ol><li> Coloque CD1 camundongos fêmeas (~ 21-25 g) em uma caixa de aquecimento para gentilmente quente para dilatar veias. Colocar os ratinhos aquecidos em um sistema de retenção de plástico e injecção de 0,2 ml de inoculo diluiu-se por via intravenosa com uma agulha G 25 na veia da cauda, ​​o equivalente a 4.000 tripanossomas por ratinho. Coloque a pressão no local da injecção depois de deter a hemorragia. Nota: infecção intraperitoneal é um percurso válido de infecção e tem sido utilizado em estudos anteriores 10, mas verificou-se esta menos reprodutível do que a via intravenosa. </li><li> Randomize camundongos infectados e gaiola em grupos de 3 em gaiolas SPF-ventilados. Como controle, injetar camundongos fêmeas CD1 com tipo selvagem parasita não bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3). </li><li> Monitorar a infecção através do sangue Film Microscopia <ol><li> Spot 5 ul de sangue de punção venosa ou venesection sobre uma lâmina de vidro e efectuar um esfregaço de sangue (utilizando uma segunda lâmina de vidro empurrar suavemente a gota de sangue através da corrediça para produzir uma película fina). Deixar as lâminas secar ao ar. </li><li> Fixar o esfregaço de sangue com 100% de metanol e mancha com Giemsa durante 10 min antes de enxaguar com dH2O e deixar secar ao ar. No âmbito do objectivo 100X contar o número de tripanossomas em 10 campos de visão (FOV). Nota: as filmagens de sangue é realizada juntamente com toda animais imagem não invasivos mais cedo um dia após a infecção. Quando o processamento de um número de animais, este método de quantificação tripanossoma é preferível a contagem em hemocitómetro que as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente e contadas mais tarde. </li></ol></li></ol> 3. A bioluminescência Imaging para Rastrear Infection Nota: Para controlar a infecção, anim todaal imagem não invasiva pode ser usado. <ol><li> Prepara-se uma solução stock de D-luciferina, o substrato da luciferase do pirilampo, em Dulbecco Salina Tamponada com Fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro de esterilizar e congelar em alíquotas a -20 ° C. Nota: D-luciferina é sensível à luz, portanto, proteger da luz por envolvimento em folha de alíquotas. Não repetidamente congelamento-descongelamento luciferina, pois ele pode afetar a atividade 11. </li><li> Aquecer-se uma alíquota de D-luciferina à temperatura ambiente. Remover cada ratinho a partir da gaiola (incluindo ratinhos de controlo infectadas com o tipo selvagem estirpe nonbioluminescent parasita) e injectar 150 mg / kg de D-luciferina aquecido (diluídas em DPBS) por via intraperitoneal com uma agulha 25 G. Colocar os ratos dentro de uma câmara de isofluorano durante aproximadamente 5 min para induzir a anestesia com 2% de isoflurano / O2 mistura em 2,5 L / min. Nota: Os ratos tornam-se imóvel quando eles estão sob anestesia. Para o gerador de imagens usado aqui, 3 ratinhos pode ser processado de cada vez. Se os ratos são anesthetzado por mais de 30 min, pomada oftálmica lágrima artificial pode ser aplicada para evitar os olhos dos ratos de secar. </li><li> Para o gerador de imagens descrito aqui, abra o software e inicializar a máquina usando o software de acordo com as instruções do fabricante. Adquirir imagens depois da câmera e placa aquecida ter atingido a temperatura. Nota: Este instrumento não é normalmente desligado, permitindo que a máquina para realizar calibrações de fundo durante a noite. No caso em que ele precisa para reiniciar, ele deve executar uma verificação de calibração em primeiro lugar. </li><li> Coloque os ratos anestesiados para o gerador de imagens (ver 3.5). Use grandes separadores negros entre os ratos para minimizar a sangrar através de qualquer sinal bioluminescente brilhante. camundongos de imagem usando um conjunto de tempos de exposição; 1, 3, 10, 30, 60 e 180 segundos, com binning médio, 1 f / stop e um filtro aberto, eo campo de visão E (12,5 x 12,5 cm2). Nota: Os ratinhos de controlo infectadas com o tipo selvagem parasitas GVR35 nonbioluminescent fornecer um backgrvalor bioluminescência ound. A partir de uma experiência cinética de luciferina (Figura 6) com este modelo, verificou-se que os picos do sinal de bioluminescência em 10 minutos após a administração e de imagem demora aproximadamente 5 minutos para 3 ratinhos. Tome este prazo em consideração quando anestesiar e de imagem dos camundongos. </li><li> Para garantir a imagem completa dos ratos, gire para obter um ventral, dorsal e lateral. Manter a consistência da ordem de orientação para a imagem latente entre animais sequenciais. </li><li> Depois de imagem, permitem que os ratos se recuperar da anestesia sob observação antes de retornar a SPF-gaiola. </li><li> Continue imagiologia ratos a cada 7 dias até o dia 21 pós-infecção. Deveria haver um aumento constante no sinal de bioluminescência ao longo de todo o animal. </li><li> No D21, imagem e filme de sangue dos ratos, como descrito acima, e dose de ratos com 40 mg / kg diminazeno aceturate intraperitoneal. Esta droga irá limpar a parasitemia periférica, mas não vai atravessar a barreira sangue-braibarreira n, e, portanto, permite uma melhor visualização da infecção do SNC. Nota: Diminazena aceturate é uma droga bem estabelecida usados ​​para tratar em estágio inicial tripanossomíase animal. </li><li> Continue imagem e monitoramento em D28 e D35. </li></ol> 4. Confirmando CNS Infection <ol><li> No D35, os ratinhos da imagem, como especificado acima (passos 3,1-3,4). </li><li> Após a imagiologia, permitir que os ratinhos recuperar da anestesia e ratinhos desangrar como detalhado no passo 1,6-1,8, recolha de sangue para posterior análise. </li><li> Após a punção cardíaca, perfundir ratos com 20 ml de PBS (opcional: adicionar 3 mg / ml de luciferina a solução de perfusão) através do coração para limpar o sangue dos órgãos e para reintroduzir etiqueta luciferina que pode ter afastada da região do cérebro ao longo do intervalo de tempo a partir do passo 4.1. </li><li> Suavemente remover o cérebro, usando tesoura curva, cortando a partir da base à volta da circunferência do crânio, e levantando a parte superior do crânio, para permitir que o cérebropara ser suavemente retirado com pinças curvas. </li><li> Colocar o cérebro excisada para uma secção de plástico preto e pipeta 50 ul de 15 mg / ml de luciferina sobre o órgão antes da imagem, para garantir luciferina adequada foi adicionado à cerebral excisado. Imagem usando as configurações acima. Isto irá demonstrar a localização da infecção para os hemisférios cerebrais. Nota: A jusante quantificação da parasitemia no cérebro excisado pode ser levada a cabo por qPCR como anteriormente descrito 8. Outras aplicações a jusante alternativos podem incluir histologia ou imuno-histoquímica para identificar parasitas no tecido cerebral após a fixação. </li></ol> 5. A quantificação de bioluminescência de imagem Nota: A bioluminescência pode ser quantificada utilizando-se a região de interesse (ROI) com o software de imagem e corrigido para o fundo bioluminescência. <ol><li> Usando a ferramenta de ROI, criar um ROI rectangular para toda animais quantificação umand posicioná-lo sobre a imagem do mouse para cobrir ponta do nariz à base da cauda do rato. Usar a mesma caixa de tamanho para cada animal e cada ponto de tempo. Ao olhar para o ROI para o cérebro, use um ROI circular da mesma forma, posicionando-o sobre a região da cabeça do rato na imagem. </li><li> Se desejar, ajuste as imagens apareçam no mesmo espectro para uma representação visual da infecção. Nota: O software utilizado aqui gera um mapa de cores para cada imagem ajustada automaticamente para a contagem mínima e máxima de fótons. Para permitir a comparação visual entre uma série de imagens, a escala de cores deve ser ajustado para os mesmos valores para todas as imagens. <ol><li> Usando a imagem com a maior bioluminescência e na guia &#39;Ajuste de imagem &quot;na paleta de ferramentas, selecione uma escala logarítmica e um mínimo de escala de cores adequado e máximo (a ser determinado empiricamente). Aplicar esta escala a todas as imagens durante todo o experimento. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O desenvolvimento de um T. bioluminescente b. brucei GVR35 estirpe permite a visualização de uma infecção por tripanossoma do início ao final de estágio. Modelos de infecção anteriores não foram capazes de detectar a fase tardia, quando os parasitas estão no cérebro, em tempo real, a partir de microscopia de esfregaço de sangue, e exigia o abate e remoção dos cérebros dos ratos infectados para determinar a carga parasitária 12. A bioluminescência reduz a variabilidade inter-rato como um únic...

A tripanossomíase africana humana (THA), ou doença do sono, é causada pelos protozoários parasitas transportados por vetores do Trypanosoma brucei spp1. O número estimado de casos atuais é inferior a 7 mil a cada ano, com quase 70 milhões de pessoas expostas ao risco de infecção do parasita no continente africano. A doença, que é mais frequentemente letal se não tratada, compreende um estágio hemolinfático inicial em que os parasitas estão presentes no sangue, progredindo para o estágio tardio, quando os parasitas invadem o sistema nervoso central (SNC) e não são mais suscetíveis ao tratamento com drogas tripanossômicas em estágio inicial2. As terapias medicamentosas atuais para HAT em estágio avançado têm regimes de tratamento complexos e prolongados e efeitos adversos graves, bem como resistência relatada, portanto, a pesquisa de novas terapias medicamentosas é imperativa3,4. 
O estudo da tripanossomíase africana humana (HAT) em estágio avançado em modelos tradicionais de camundongos é longo e complexo, com a remoção do tecido cerebral sendo necessária para monitorar a carga parasitária5. A cepa infectante animal T. b. brucei é usada como modelo de estudo da tripanossomíase, com o estágio tardio aparecendo 21 dias após a infecção (dpi). Para monitorar a infecção por parasitas não bioluminescentes do tipo selvagem no modelo de camundongo, esfregaços de sangue periférico ou PCR quantitativo são os únicos métodos para determinar a carga parasitária. Para a carga do parasita no cérebro, o camundongo precisa ser abatido, excisado no cérebro e qPCR realizado nos tecidos, tornando impossível rastrear parasitas em vários pontos de tempo no estágio final da infecção. Isso resulta na incapacidade de acompanhar infecções em tempo real no sistema nervoso central (SNC). 
A imagem de bioluminescência in vivo (BLI) pode fornecer detecção altamente sensível e não invasiva da disseminação do parasita e progressão da doença em um modelo de camundongo que pode ser seguido em um único animal durante todo o experimento6. O BLI é baseado na emissão de luz no espectro visível produzida por uma reação catalisada por luciferase. Os fótons emitidos são então detectados por uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD)7. Para isso, o patógeno é geneticamente modificado para expressar uma proteína luciferase e o substrato, luciferina, é introduzido em pontos de tempo de interesse por injeção. A principal vantagem desse método é a capacidade de realizar estudos longitudinais, nos quais o mesmo animal pode ser visualizado várias vezes com efeitos adversos mínimos. O sinal de bioluminescência adquirido pode ser quantificado, indicando assim a carga do patógeno.
A otimização e validação de um T. b. brucei bioluminescente com desvio para o vermelho permitiu a investigação da infecção em estágio avançado por meio de procedimentos não invasivos, detectando parasitas mais precocemente do que a microscopia de esfregaço sanguíneo e reduzindo muito o tempo, o custo e o número de animais necessários para estudar a infecção do SNC e a triagem de drogas na tripanossomíase em estágio tardio8,9. Neste protocolo demonstramos a infecção de camundongos com tripanossomas bioluminescentes e como então visualizar os parasitas in vivo para quantificação da progressão da doença e penetração no SNC.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma, Reino Unido</td><td>P4417</td><td>comprimidos pH 7,4</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma, Reino Unido</td><td>G8270</td><td>99,5% (molecular) grau</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Sigma, Reino Unido</td><td>A9434</td><td>99,5% (molecular) grau</td></tr><tr><td>Heparina (sal de lítio)</td><td>Sigma, Reino Unido</td><td>H0878</td><td></td></tr><tr><td>Hi-FCS</td><td>Gibco, Life Technologies, Reino Unido</td><td>10500-064</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma, Reino Unido</td><td>D4031</td><td>Estéril filtrado</td></tr><tr><td>Sr. Frosty</td><td>Nalgene, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Sigma, Reino Unido</td><td>G5637</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina</td><td>Perkin Elmer, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma, Reino Unido</td><td>115144-35-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diminazene aceturato</td><td>Sigma, Reino Unido</td><td>D7770</td><td>Grau analítico</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Perkin Elmer, Reino Unido</td><td></td><td>outros bioimagers disponíveis por exemplo da Bruker, Kodak</td></tr><tr><td>Living Image v. 4.2</td><td>Perkin Elmer, Reino Unido</td><td></td><td>software proprietário para instrumentos Perkin Elmer IVIS; outros instrumentos podem ter sua própria</td></tr><tr><td>seringa de 1 ml</td><td>Fisher Scientific, Reino Unido</td><td>10142104</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 20 ml</td><td>Fisher Scientific, Reino Unido</td><td>10743785</td><td></td></tr><tr><td>agulhas</td> <td>de 25 gGreiner Bio-one</td><td>N2516</td><td></td></tr><tr><td>21 G Agulhas</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2138</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio de fosco duplo</td><td>VWR, UK</td><td>631-0117</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>StarLab, UK</td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Bijou de 7 ml</td><td>StarLab, UK</td><td>E1412-0710</td><td></td></tr><tr><td>Limitador de rato</td><td>Sigma, UK</td><td>Z756903</td><td>Nosso limitador foi feito internamente, este é um modelo similar</td></tr></tbody></table>

bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia africano tripanossomíase

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

A tripanossomíase africana humana (THA) é uma doença de múltiplos estágios que se manifesta em dois estágios; um estágio sanguíneo inicial e um estágio tardio, quando o parasita invade o sistema nervoso central (SNC). O estudo in vivo do estágio tardio tem sido limitado, pois as metodologias tradicionais exigem a remoção do cérebro para determinar a presença dos parasitas.
A imagem de bioluminescência é uma forma não invasiva e altamente sensível de imagem óptica que permite a visualização de um patógeno transfectado com luciferase em tempo real. Usando uma cepa de tripanossomo transfectada que tem a capacidade de produzir doença em estágio avançado em camundongos, podemos estudar a cinética de uma infecção do SNC em um único animal durante o curso da infecção, bem como observar o movimento e a disseminação de uma infecção sistêmica.
Aqui descrevemos um protocolo robusto para estudar infecções do SNC usando um modelo de bioluminescência de tripanossomíase africana, fornecendo observações não invasivas em tempo real que podem ser analisadas posteriormente com abordagens opcionais a jusante.

Este protocolo demonstra como seguir a progressão da doença após a infecção de camundongos com T. b. brucei, um modelo para a tripanossomíase humana Africano. A Figura 1 mostra a linha do tempo do protocolo experimental, demonstrando o calendário de tratamento e de imagem etapas. A Figura 2 mostra um típico campo de visão em um esfregaço de sangue Giemsa-manchadas fixa usada para quantificar parasitemia periférica, com tripanossomas e células ve...

Este manuscrito descreve o uso de uma cepa bioluminescente de tripanossomas africanos para permitir o rastreamento de infecções em estágio avançado e demonstra como imagens ao vivo in vivo podem ser usadas para visualizar infecções no sistema nervoso central em tempo real.

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

O objetivo geral deste protocolo é utilizar o imageamento in vivo em tempo real para acompanhar uma infecção por tripanossomos, visualizando desde os estágios iniciais da infecção no sangue até os estágios tardios no cérebro do camundongo, imitando a progressão clínica da doença do sono. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia dos tripanossomos, identificando potenciais novos tratamentos terapêuticos e avaliando sua eficácia contra a infecção. A principal vantagem desta técnica é que a avaliação de fármacos pode ser concluída em 90 dias, em contraste com os 180 dias necessários no modelo anterior do tipo controle.Este protocolo pode fornecer informações sobre a tripanossomíase africana humana, mas também é aplicável a outros modelos de doenças infecciosas, como tuberculose ou doença de Chagas. Comece colocando camundongos fêmeas CD1 de 21 a 25 gramas em uma caixa aquecida para dilatar as veias da cauda. Em seguida, coloque os camundongos aquecidos individualmente em um dispositivo plástico de contenção e use uma agulha de 25 gauge para injetar 0,2 mililitros de inóculo diluído de Trypanosome brucei GVR35VSL2 por via intravenosa na veia da cauda, aplicando pressão imediatamente no local da injeção para conter o sangramento.Para monitorar a infecção por meio de microscopia em lâmina de sangue, coloque cinco microlitros de sangue em uma lâmina de vidro. Use uma segunda lâmina de vidro para espalhar suavemente a gota sobre a primeira lâmina, produzindo uma película fina. Deixe as lâminas secarem ao ar e, em seguida, fixe o sangue em metanol 100%, seguido por 10 minutos em Giemsa.No final da incubação, lave as lâminas com água destilada e deixe secar ao ar. Em seguida, conte o número de tripanossomos em 10 campos de visão sob uma objetiva de 100x. Para acompanhar a infecção por imagem de bioluminescência, aqueça uma alíquota de D-luciferina até a temperatura ambiente.Em seguida, utilize uma agulha de 25 mm para injetar intraperitonealmente 150 miligramas por quilograma de luciferina aquecida por animal. Depois, inicialize o equipamento utilizando o software do imageador de acordo com as instruções do fabricante. Então, quando a câmera e a placa aquecida atingirem as temperaturas apropriadas, coloque separadores pretos grandes entre os animais anestesiados para minimizar a passagem de qualquer sinal bioluminescente intenso.Image os camundongos utilizando uma série de tempos de exposição com agrupamento médio, um F-stop e um filtro aberto e um campo de visão E de 12,5 vezes 12,5 centímetros. Para garantir uma imagemagem completa dos camundongos, rotacione os animais para obter vistas ventral, dorsal e lateral. No dia 21, realize a imagemagem e a extensão sanguínea dos camundongos conforme demonstrado.Em seguida, administre aos animais 40 miligramas por quilograma de diminazina aceturato por via intraperitoneal para eliminar a parasitemia periférica. Após a aquisição de imagens dos animais no dia 35, coloque os cérebros removidos sobre um pedaço de plástico preto e adicione 50 microlitros de 15 miligramas por mililitro de luciferina sobre os tecidos. Em seguida, adquira imagens do cérebro utilizando as mesmas configurações demonstradas para a aquisição de imagens do animal inteiro.Para quantificar o grau de bioluminescência em regiões específicas de interesse, ou ROIs, selecione a ferramenta de ROI no software de imagem e crie uma ROI retangular para a quantificação do animal inteiro. Posicione a ROI sobre a imagem do camundongo, desde a ponta do nariz até a base da cauda, e, utilizando uma caixa do mesmo tamanho para cada animal e em cada ponto temporal, meça o fluxo total. Para avaliar a ROI somente do cérebro, crie uma ROI circular e posicione-a sobre a região da cabeça do animal.Repita o procedimento para cada animal e meça o fluxo total. Em seguida, utilizando a imagem com a maior bioluminescência e a aba de ajuste de imagem na paleta de ferramentas, selecione uma escala logarítmica e valores mínimo e máximo apropriados para a escala de cores da imagem, aplicando essa escala a todas as imagens do experimento. O desenvolvimento da infecção pode ser acompanhado in vivo por meio de medições sequenciais da bioluminescência para determinar o grau de infecção nos animais ao longo do experimento.À medida que a infecção progride, um aumento na bioluminescência pode ser observado em todos os animais ao longo dos primeiros 21 dias, à medida que o sinal se torna mais disseminado e intenso, com as regiões de maior bioluminescência aparentes na área do baço. No dia 21, os camundongos são tratados com diminazina aceturato após a aquisição de imagens, como acabou de ser demonstrado, resultando em apenas baixos níveis de bioluminescência presentes no cérebro até o dia 28, à medida que a infecção periférica é eliminada. No dia 35, o sinal não apenas permanece presente na região da cabeça, mas também se tornou mais intenso, indicando uma possível infecção cerebral.A quantificação da parasitemia periférica e da bioluminescência permite a avaliação da cinética da doença. Por exemplo, neste experimento, no dia 7, observou-se um alto sinal de bioluminescência de um vezes 10 à oitava potência fótons por segundo, enquanto a parasitemia observada foi muito baixa nos esfregaços sanguíneos gerados no mesmo dia. No dia 28, a parasitemia tornou-se indetectável nos esfregaços sanguíneos devido ao tratamento com diminazeno aceturato administrado no dia 21, enquanto a bioluminescência continuou acima dos níveis de fundo até o dia 35, representando a bioluminescência observada na região da cabeça e confirmando a maior sensibilidade da análise de bioluminescência em comparação com os esfregaços sanguíneos.A imagem de bioluminescência do cérebro revela diferenças na carga de infecção entre os animais, que não parece se localizar em regiões anatômicas específicas do tecido. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de obter uma boa faixa de tempos de exposição para garantir dados de imagem de qualidade, pois a superexposição, por exemplo, afeta negativamente detalhes importantes de localização. Após este procedimento, outros métodos complementares, como PCR quantitativa e imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a carga parasitária no cérebro e a localização do parasita.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia dos tripanossomos realizarem a avaliação de fármacos dentro de 90 dias após a infecção, devido à melhoria na sensibilidade na detecção de recaídas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a imagem de bioluminescência da infecção por T. brucei para acompanhar a progressão da doença, desde o sangue até a infecção avançada do cérebro.

bioluminescence-imaging-to-detect-late-stage-infection-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Este artigo descreve a administração...

Imagem bacteriana Bioluminescent<em&gt; Em Vivo</em

Utilizando luciferase e sistemas de imagem in vivo (IVIS) como um novo meio de identificar objectivos de doença antes de desenvolvimentos clínicos ocorrer. IVIS nos permitiu visualizar em tempo real a invasão de vírus encefalíticas durante vários dias, fornecendo um modelo de doença mais precisa para o estudo futuro. Também permitiu-nos identificar as características potenciais de proteção de antivirais e de vacinas mais rápido do que os modelos animais atualmente utilizados. A capacidade de...

In Vivo Imaging Systems Detecção (IVIS) de um vírus de Neuro-invasiva encefalítico

Fonte: de Vries, C. R., et al., Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de feridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra uma técnica de imagem bioluminescente para monitorar a progressão da infecção bacteriana em um modelo de camundongos vivo. Bactérias patogênicas modificadas com o sistema repórter luxABCDE emitem luz no local da infecção, permitindo a visualização de bactérias metabolicamente ativas. Ao imagear o camundongo ao longo do tempo, os...

Imagem por Bioluminescência de Infecções Bacterianas em Camundongos

A dinâmica dos glicossomos em tripanossomas africanos é difícil de estudar por técnicas tradicionais de biologia celular, como microscopia eletrônica e fluorescência.  Como meio de observar o comportamento dinâmico das organelas, um sistema repórter de organelas fluorescentes tem sido usado em conjunto com a citometria de fluxo para monitorar a dinâmica dos glicossomos em tempo real em parasitas vivos.

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo do rato do tumor-rolamento para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência.

Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese

O protocolo aqui fornecido descreve as etapas detalhadas para a realização de estudos de eficácia de medicamentos em um modelo bioluminescente da infecção por Trypanosoma cruzi , com foco na aquisição, análise e interpretação de dados. Procedimentos de solução de problemas e controle de qualidade para minimizar problemas técnicos também são fornecidos.

Desmistificando imagens de bioluminescência in vivo de um modelo de camundongo com doença de Chagas para estudos de eficácia de medicamentos

Aqui apresentamos uma avaliação longitudinal de hamsters dourados infectados intraperitonealmente (IP) ou via intragengival (IG) com L. infantum-Luc por imagem bioluminescente e por PCR. Os hamsters foram avaliados 1 dia após a infecção (1 dpi), 1 semana após a infecção (8 dpi) e 3 semanas após a infecção (22 dpi) e eutanasiados aos 50dpi e 8 meses após a infecção.

In vivo Imagem de hamsters infectados por Leishmania infantum por inoculação gengival de amastigotas axênicas expressando luciferase

Terapia anti-retroviral para o tratamento de HIV / AIDS é monitorado na África do Sul em grande escala. Citometria de fluxo é combinado para hematologia (CD45), imunologia (CD4) e carga viral-CD38 ligado ensaio. Gravado no LNH-SA laboratórios, Johannesburg, estes métodos modernos são custo-eficiente com controle de qualidade elevada locais internos, servindo como modelos para recursos limitados de diagnósticos.

Monitoramento Laboratório abrangente e Custo Efetivo de HIV / AIDS: um Modelo de Papel Africano

NADPH oxidase é a principal fonte de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em fagócitos. Por causa da natureza efêmera de ROS, é difícil de medir e monitorar os níveis de ROS em animais vivos. Um método minimamente invasivo para quantificação de série de ROS em ratos vivos é descrito.

Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

Aprenda a usar imagem bioluminescente in vivo para rastrear infecção por Trypanosoma brucei em camundongos, visualizando estágios tardios no sistema nervoso central. Este método reduz o tempo de avaliação de fármacos de 180 para 90 dias.

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

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