Dissecção e pay-per-montagem do Threespine Stickleback branquial Skeleton

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e montar em lâmina o esqueleto branquial de peixes stickleback. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais nas áreas de desenvolvimento, genética e evolução, como, por exemplo, como os animais se adaptam a novos ambientes e como surge a variação na morfologia adulta durante o desenvolvimento.

A principal vantagem dessa técnica é que, ao dissecar e montar em plano o esqueleto branquial, pode-se visualizar uma variedade de características tróficas que não podem ser estudadas em preparações inteiras. Na preparação, revise a morfologia esquelética relevante da cabeça do espinhel de três espinhos. Após preparar o peixe para a dissecação, comece inserindo uma pinça fina número cinco na lateral do olho, em um ângulo de 45 graus, para perfurar a membrana que recobre o olho.

Em seguida, retire a membrana do olho, como se fosse a tampa de um recipiente de iogurte. Depois, insira a pinça aberta por trás do olho, segure o nervo óptico e remova o olho. Tenha cuidado para não perfurar o olho, pois ele vazará melanina.

Repita este processo com o olho do lado oposto. Em seguida, posicione a lâmina de uma tesoura pequena sob a parte posterior da aba do opérculo e corte o tecido mole dorsalmente acima do opérculo, em direção à órbita ocular. A seguir, corte o osso frontal, que está localizado dorsalmente à órbita ocular.

Em seguida, corte ao longo do osso parasfenóide na linha mediana, ao redor do centro da órbita ocular. Repita o corte no opérculo no lado oposto. Para os próximos passos, as espinhas pélvicas podem ser usadas como alças.

Eles se desdobram, puxando-os suavemente diretamente para longe do corpo. Agora, insira a pinça sob o opérculo e retire lentamente a face do corpo, aparando qualquer tecido mole que ainda esteja aderido no processo.

Tenha cuidado em torno dos filamentos branquiais e tome cuidado para não perturbá-los. É fácil pegar acidentalmente o primeiro osso ceratobranquial junto com o Percoll ao remover o esqueleto facial. Olhe sob o Percoll enquanto o puxa para frente para ter certeza de que não está segurando qualquer estrutura adicional.

Agora, com pinças, solte os ceratohiais de ambos os lados do basihiálio mediano, removendo e destacando o esqueleto facial craniano anterior. Repita no lado oposto. O esqueleto facial craniano anterior inclui toda a mandíbula, todo o esqueleto hióideo, os elementos dorsais e endocondrais subjacentes e a parte anterior do crânio.

Em seguida, insira uma pinça fechada logo abaixo do tubo digestivo e arraste-a anteriormente, separando cuidadosamente os músculos e ligamentos remanescentes ligados ao esqueleto branquial no processo. Depois, use a ponta da pinça fechada para raspar os músculos que fixam o esqueleto branquial dorsal à caixa craniana ventral.

Realize a raspagem com um movimento de trás para frente. Repita o processo de remoção muscular no lado oposto do espinhalho. Em seguida, remova o esqueleto branquial, segurando a base do tubo intestinal e puxando anteriormente.

Seccione o tubo digestivo com um corte perpendicular, posterior à quinta ceratobranquial. Um erro comum é segurar o tubo digestivo muito anteriormente, deixando o tubo frontal ventral para trás. Certifique-se de segurar profundamente na região posterior da cavidade torácica e você sempre poderá remover o excesso do tubo digestivo posteriormente.

Após remover quaisquer fragmentos ósseos remanescentes da caixa craniana no lado dorsal do esqueleto branquial. Insira a tesoura na cesta branquial e faça um corte dorsal entre os conjuntos bilaterais de placas dentárias dorsais. Mantenha esse corte centralizado para evitar danificar as placas dentárias dorsais.

Em seguida, faça dois cortes laterais rasos na luz intestinal elástica na extremidade posterior do esqueleto branquial. Na extremidade anterior do tubo intestinal, para auxiliar na abertura do esqueleto branquial.

Agora, transfira o esqueleto para um tubo de microcentrífuga contendo glicerol a 50 por cento e hidróxido de potássio a zero vírgula vinte e cinco por cento para clareamento suave. Ou, em vez disso, transfira-o para glicerol puro se nenhum clareamento adicional for necessário. Se for necessário restanização, os detalhes estão descritos no protocolo textual.

Para se preparar para a montagem, troque a solução por glicerol puro e agite o tubo por pelo menos cinco minutos. Em seguida, remova o esqueleto branquial e coloque-o próximo à base de uma lamínula de vidro de 22 por 60 milímetros, com o lado dorsal voltado para cima. Agora, transfira algumas gotas de glicerol para cima do esqueleto.

Em seguida, modele duas pequenas bolas de argila plástica e coloque uma em cada extremidade da lamínula; elas funcionam como espaçadores. Depois, posicione vagamente uma segunda lamínula sobre a preparação, com pressão suficiente para aplainar o esqueleto branquial anterior. Agora, levante a aba dorsal esquerda, incluindo as placas dentárias dorsais, e deslize a aba entre as lamínulas.

Em seguida, faça o mesmo com o retalho dorsal direito. E empurre todo o esqueleto branquial para longe da borda da lamínula. Para concluir o procedimento, pressione levemente a lamínula superior para achatá-las bolas de argila.

Suficiente apenas para manter o esqueleto branquial montado em posição plana. Porém, não tanto a ponto de esmagá-lo. Se durante o processo uma fileira de cerdas ficar obscurecida, deslize a pinça entre as lamínulas e reoriente o ceratobranquial ou toda a preparação.

Quando montado planamente em glicerol puro, o preparo pode ser armazenado em posição plana à temperatura ambiente por pelo menos uma década. Este protocolo resulta em um esqueleto branquial dissecado e montado planamente, onde uma variedade de características tróficas importantes pode ser cronificada.

Em vista dorsal, todas as fileiras de cerdas branquiais, todas as placas dentárias faringeanas e quase todos os ossos branquiais podem ser facilmente visualizados e cronificados. O vermelho de alizarina S também fluoresce com filtro ródamina ou outro filtro vermelho semelhante, permitindo marcação dupla com outros marcadores e métodos alternativos de visualização. Nesta imagem, as cerdas branquiais são marcadas com acentos circunflexos.

Os dentes são marcados com cabeças de seta e os ossos são marcados com asteriscos. Uma vez dominada, a dissecação pode ser realizada em poucos minutos e executada em centenas de animais de forma relativamente rápida. E embora tenhamos demonstrado uma dissecação do esqueleto branquial de espinhel, esperamos que este procedimento possa ser usado como guia para diversas espécies de peixes.

Ao dissecar o esqueleto branquial, podemos visualizar rapidamente e com facilidade uma variedade de características tróficas importantes, não visíveis em preparações inteiras, permitindo uma melhor compreensão do desenvolvimento e da evolução do esqueleto craniofacial.