Dissecção e pay-per-montagem do Threespine Stickleback branquial Skeleton

O objetivo geral deste procedimento é dissecar e montar o esqueleto branquial do esgana-gata. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos do desenvolvimento, genética e evolução. Por exemplo, como os animais se adaptam a novos ambientes e como a variação na morfologia adulta surge durante o desenvolvimento.

A principal vantagem dessa técnica é que, ao dissecar e montar o esqueleto branquial, é possível visualizar uma variedade de características tróficas que não podem ser estudadas em toda a montagem. Em preparação, revise a morfologia esquelética da cabeça relevante dos três esgana-gata da coluna. Depois de preparar o peixe para a dissecação, comece inserindo uma pinça afiada número cinco na lateral do olho, em um ângulo de 45 graus para perfurar a membrana que cobre o olho.

Em seguida, retire a membrana do olho, como a tampa de um recipiente de iogurte. Em seguida, insira uma pinça aberta atrás do olho, segure o nervo óptico e remova o olho. Tenha cuidado para evitar perfurar o olho, ou ele vazará melanina.

Repita esse processo com o olho no lado oposto. Em seguida, coloque a lâmina de uma pequena tesoura sob o lado posterior do retalho do opérculo e corte o tecido mole dorsalmente acima do opérculo, em direção à órbita ocular. Em seguida, corte o osso frontal, que é dorsal à órbita ocular.

Em seguida, corte o osso paraesfenóide da linha média, ao redor do centro da órbita ocular. Repita o corte do opérculo no lado oposto. Para as próximas etapas, as espinhas pélvicas podem ser usadas como alças.

Eles se dobram, puxando-os suavemente para longe do corpo. Agora, insira a pinça sob o opérculo e retire lentamente o rosto do corpo. Aparar qualquer tecido mole que ainda esteja preso no processo.

Tenha cuidado com os rakers branquiais e tome cuidado para não perturbá-los. É fácil agarrar acidentalmente o primeiro osso ceratobranquial, junto com o percoll ao remover o esqueleto facial. Olhe sob o percoll enquanto o descasca para a frente para ter certeza de que não tem nada a mais.

Agora, com uma pinça, desprenda os cerato-hiais de ambos os lados da linha média basihyal, enquanto descasca e remove o esqueleto facial craniano anterior. Repita no lado oposto. O esqueleto facial craniano anterior inclui toda a mandíbula, todo o esqueleto hióide, os elementos dorsais e endocondriais subjacentes e a parte anterior do crânio.

Em seguida, insira uma pinça fechada logo abaixo do tubo intestinal e arraste-a anteriormente. Separando os músculos e ligamentos restantes ligados ao esqueleto branquial no processo. Em seguida, use a ponta da pinça fechada para raspar os músculos que prendem o esqueleto branquial dorsal à caixa ventral do cérebro.

Raspe com um movimento posterior para anterior. Repita o processo de remoção muscular no lado oposto do esgana-gata. Em seguida, remova o esqueleto branquial, segurando a base do tubo intestinal e puxando anteriormente.

Separe o tubo intestinal usando um corte perpendicular, posterior ao quinto ceratobranquial. Um erro comum é agarrar o tubo intestinal muito anterior, o que deixa o tubo frontal ventral para trás. Certifique-se de agarrar profundamente na parte posterior da cavidade torácica e você sempre pode remover o excesso de tubo intestinal mais tarde.

Depois de remover quaisquer fragmentos ósseos restantes da caixa cerebral no lado dorsal do esqueleto branquial. Insira uma tesoura na cesta branquial e faça um corte dorsal entre os conjuntos bilaterais de placas dentárias dorsais. Mantenha este corte centralizado para evitar danos às placas dorsais dos dentes.

Em seguida, faça dois cortes laterais rasos no lúmen do intestino emborrachado na extremidade posterior do esqueleto branquial. Na extremidade antieror do tubo intestinal. Para ajudar na abertura do esqueleto branquial.

Agora, transfira o esqueleto para um tubo de microsentrifuge carregado com 50 por cento de glicerol, zero vírgula dois cinco por cento de hidróxido de potássio para uma limpeza suave. Ou, em vez disso, transfira-o para glicerol puro se não for necessária mais limpeza. Se for necessária uma nova coloração, os detalhes são fornecidos no protocolo de texto.

Para se preparar para a montagem, troque a solução por glicerol puro e agite o tubo por pelo menos cinco minutos. Em seguida, remova o esqueleto branquial e coloque-o perto do fundo de uma lamínula de vidro de 22 por 60 milímetros com o lado dorsal para cima. Agora, transfira algumas gotas de glicerol para o esqueleto.

Em seguida, estenda duas pequenas bolas de massa de modelar e jogue uma em cada extremidade da lamínula, elas funcionam como espaçadores. Em seguida, coloque frouxamente uma segunda lamínula sobre a preparação, com pressão suficiente para achatar o esqueleto branquial anterior. Agora, abra o retalho dorsal esquerdo, incluindo as placas dentárias dorsais, e deslize o retalho entre as lamínulas.

Em seguida, faça o mesmo com o retalho dorsal direito. E empurre todo o esqueleto branquial para longe da borda da lamínula. Para concluir o procedimento, pressione levemente a lamínula superior para achatar as bolas de argila.

Apenas o suficiente para que eles mantenham o esqueleto branquial montado plano. Mas, não tanto que seja esmagado. Se durante o processo, uma fileira de rakers for obscurecida, deslize uma pinça entre as lamínulas e reoriente o ceratobranquial ou toda a preparação.

Quando montada em glicerol puro, a preparação pode ser armazenada em temperatura ambiente por pelo menos uma década. Este protocolo resulta em um esqueleto branquial dissecado e plano. Onde uma variedade de características tróficas importantes pode ser cronificada.

De uma visão dorsal, todas as fileiras de rastros branquiais, todas as placas dentárias faríngeas e quase todos os ossos branquiais podem ser facilmente visualizados e cronificados. O vermelho de alizarina S, também fluoresa em uma rodamina ou filtro vermelho semelhante, permitindo a dupla rotulagem com outros marcadores e métodos alternativos de visualização. Nesta imagem, os rakers branquiais são marcados com quilates.

Os dentes são marcados com pontas de flecha e os ossos são marcados com asteriscos. Uma vez dominada, a dissecação pode ser feita em poucos minutos e ser realizada em centenas de animais com relativa rapidez. E embora tenhamos demonstrado uma dissecção do esqueleto branquial esgana-gata, esperamos que esse procedimento possa ser usado como um guia para uma variedade de espécies de peixes.

Ao dissecar o esqueleto branquial, podemos visualizar rápida e facilmente uma variedade de características tróficas importantes, não visíveis em montagens inteiras. Permitindo uma melhor compreensão do desenvolvimento e evolução do esqueleto craniano-facial.