Name: Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte Em situ Hibridização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprenda a técnica de montagem plana de embriões de zebrafish corados por hibridização in situ em montagem total para melhorar a visualização de estruturas embrionárias em biologia do desenvolvimento.

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Este trabalho foi parcialmente financiado através do financiamento para a RAW a partir de cada um dos seguintes: NIH concede K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Iniciado Scholar concessão de uma subvenção n º 5-FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame Faculdade de Ciências e Departamento de Ciências Biológicas. Gostaríamos especialmente de agradecer Elizabeth e Michael Gallagher, junto com toda a família Gallagher, que concedeu uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame para promover investigação em células estaminais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa em Zebrafish Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia de peixe-zebra. Finalmente, agradecemos aos membros de nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e idéias sobre este trabalho, comobem como Marigold (Maripooka) e Zinnia Wingert para fornecer naturalmente derramou bigodes felinos para fazer ferramentas chicote mais excelentes para a nossa pesquisa.

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Os autores não têm nada a revelar.

Zebrafish têm provado ser um organismo modelo extremamente valioso em toda a comunidade de pesquisa nos últimos anos. Zebrafish apresentam um elevado grau de conservação genética com a dos vertebrados superiores e vantagens pertinentes à sua anatomia, reprodução e ciclo de vida desta espécie fazem muito passíveis de análises experimentais. Além disso, o avanço das técnicas moleculares aplicáveis ​​para o peixe-zebra promoveu ainda a utilização deste organismo modelo na pesquisa científica. Por exemplo, uma grande variedade de linhas de zebrafish transgênicos foram gerados para estudar a progressão da doença e para responder a muitas questões fundamentais que estão por trás dos mecanismos-chave do desenvolvimento, incluindo a organogênese. Por conseguinte, com base na utilização dinâmica de peixe-zebra em ambas as doenças e de desenvolvimento da pesquisa, as metodologias de marcação de células e quantificação do sinal é um aspecto importante da análise dos dados. Enquanto os métodos que empregam uma fluorescentetibodies pode ser usado para detectar a expressão da proteína em peixes-zebra transgénicos, os investigadores geralmente dependem de procedimentos padrão como DESEJOS 12-16 para examinar a localização espaço-temporal dos transcritos do gene em uma amostra de peixe-zebra não transgénico fixo. Na verdade, o desejo é uma das técnicas mais utilizadas em biologia 16, e é uma ferramenta vital para caracterizar o fenótipo de mutações genéticas e perturbações genéticas químicos. No entanto, o desejo é associado com um número de potenciais armadilhas e desafios. Para confirmar a especificidade do anti-sentido ribroprobe, ribossondas de sentido pode ser utilizado como um controlo para avaliar a especificidade dos padrões de coloração ribossonda anti-sentido. Enquanto secções 4 e 5 são apresentados na ordem de rotulagem e a detecção de uma sonda marcada com digoxigenina seguido de sonda marcada com f luoresceina, esta ordem pode ser invertida. Tipicamente, os sinais mais fracos (genes com níveis de expressão inferiores) são melhor detectadas com sondas marcadas com digoxigenina e esta manchadesenvolvido pela primeira vez com um substrato roxo, seguido de detecção e coloração do sinal mais forte (mais gene abundantemente expresso), utilizando o substrato vermelho. No entanto, no caso de reacções de duas cores vai ser realizada, recomenda-se que várias combinações de rótulos e substratos são testados para encontrar o procedimento que é mais adequado para a recolha de dados e análise. Além disso, os tempos previstos de bloqueio, incubação do anticorpo e lavagem fornecidas nas seções 4-5 são adaptados para os embriões com menos de 24 horas após a fertilização; longos intervalos de estes mesmos passos com embriões mais velhos pode levar ao acúmulo de sal na amostra. Extensas dicas para solução de problemas DESEJO embrião de peixe-zebra padrão já foram documentados na literatura 12-16. Provavelmente o dilema mais comum é a alta fundo. Recomendamos o aumento do número de lavagens MABT no passo 4,7 para 15-20 lavagens, se necessário, no entanto, em nossa experiência, a adição do MABT overnight &#39;super-lavagem&#39;dá excelentes resultados quando utilizado em conjunto com 10 ou mais lavagens MABT curtos, antes de prosseguir para a etapa 4.8. Outro exemplo dilema é pobre infiltração da sonda, que pode ocorrer com longas ribosondas. Shearing o riboprobe seguinte Passo 3.6 através da hidrólise alcalina pode contrariar esta situação. Em nossa experiência com amostras pequenas, corte sonda não é normalmente necessária. No entanto, deve-se ter em mente que os parâmetros como isso pode ser factores que contribuem para o resultado de um experimento de desejo, e sugerimos exame destas instruções de solução de problemas úteis já disponíveis ao público na Comunidade, conforme necessário para refinar os parâmetros experimentais para DESEJO em seu próprio pesquisa 12. Em adição às técnicas tradicionais DESEJO 12-16, tem havido um surgimento contínuo de avanços nas metodologias de desejo e protocolos alternativos que têm sido formuladas. Estes incluem novos modos de detecção de sinal, tais como através da utilização de fluorescênciacência 17-19, de métodos que permitem a localização de microRNAs 20. Mesmo assim, apesar das muitas melhorias que foram feitas aos métodos de rotulagem celular atuais, a eficácia desses procedimentos são negados se a mancha (s) não pode ser facilmente visualizado dentro da amostra de interesse em um ponto de tempo desejado. Essa limitação é problemático para os investigadores, especialmente quando se refere aos estágios embrionários iniciais da ontogenia peixe-zebra, o que poderia levar a lacunas em nossa compreensão de vários processos de desenvolvimento que surgem nestes momentos. Durante o desenvolvimento normal de peixe-zebra, o saco vitelino diminui progressivamente em tamanho com a idade do embrião 11. Portanto, nestas fases posteriores de desenvolvimento (&gt; 24 horas após a fertilização), coloração desejo é bastante simples de analisar, porque o embrião é maior em comparação com o seu vizinho saco vitelino. No entanto, este não é o caso de a fase de botão de cauda somitogénese precoce (quando o embriãomassa está posicionada à volta da gema), onde o saco vitelino opaco pode, por vezes, obscurecer a visualização da mancha. Por conseguinte, o método de montagem plana foi concebido para ajudar a aliviar os problemas de imagem e análise de dados associados com a caracterização de amostras de embriões de peixes-zebra precoces (esquematizados na Figura 1 e Figura 2), e tem sido amplamente utilizada desde a fenotipagem sistemática de mutações genéticas isoladas a partir das primeiras telas genéticos grande escala 21. Desde o advento das técnicas de montagem plana, a análise das fases iniciais de desenvolvimento foi significativamente melhorada. Uma vez que a gema é removido do embrião, é possível estabelecer o plano de embriões em uma lâmina de vidro com a orientação desejada para a imagiologia. Esta posição bidimensional permite a visualização de todo o embrião de uma só vez, o que elimina a necessidade de rodar a amostra. Vários tecidos estão localizados em amplos domínios de embrião, tais como oos precursores que formam o sangue e rim. Além disso, pode-se precisar de comparar vários tecidos em desenvolvimento diferentes ao mesmo tempo. Montagem plana permite ao pesquisador visualizar simultaneamente todo o domínio de tais grupos de células, e, portanto, pode ajudar muito quantificações como uma medição da área de um tecido ou de células conta. Esta técnica tem, em última análise ajudou a levar a muitas descobertas a respeito de uma variedade de mecanismos de desenvolvimento importantes subjacentes hematopoiese, neurogênese e organogénese. Assim, uma vez dominado, as aplicações para esta técnica simples para os pesquisadores são bastante consideráveis. Por exemplo, em um estudo sobre a escolha linhagem durante hematopoiese, montagem plana preparações de embriões de peixes-zebra nas fases somito (SS) 14 e 18 foram utilizados para ilustrar as mudanças que ocorreram no padrão do fator de transcrição dedo PU.1 zinco entre a expressão de tipo selvagem e GATA1 morfolino embriões injectados 22.Este método permitiu a detecção de um domínio PU.1 expandida em 18 ss, indicando que GATA1 é mais provável que regula a expressão de PU.1 na massa celular intermediária (ICM) em torno deste ponto de tempo. Embriões plana adicionais montados coradas para diferentes genes eritróides incluindo gtpbp1 e epsin demonstraram uma perda na expressão destes genes mutantes que eram vlt GATA1 - / -. Outras análises mostraram qualquer alteração na expressão de genes, como erythoid biklf e testhymin que eram conhecidos como sendo independente da actividade gata. Portanto, em conjunto com os seus outros resultados experimentais, foi revelado que GATA1 é essencial na regulação da diferenciação de células dentro da linhagem mielo-eritróides. Em um estudo do desenvolvimento da crista neural, montagens planas foram usados ​​para examinar a expressão Crestin em mont blanc (mob M610) mutantes em um estudoexaminar os papéis de mont blanc e função do gene tfap2a 23. Aos 10 e 20 ss, expressão Crestin foi totalmente revogada na cabeça e diminuiu na região do tronco de mutantes M610 mob em comparação com a expressão normal, do tipo selvagem, em última análise, ajudar este grupo a concluir sobre a importância da mont blanc e tfap2a regulação durante a formação da crista neural. Além disso, em termos de organogénese, montagens planas permitiram a descoberta da presença de domínios distintos no campo progenitora renal precoce durante o desenvolvimento do rim embrionário do peixe-zebra, conhecidos como os pronefros. O embrião do peixe-zebra fornece um sistema conservado e ainda anatomicamente simples para estudar como progenitoras renais dar origem a unidades de nefrónios funcionais que compreendem os pronefros, um processo conhecido como nefrogênese 6,7 (Figura 4). Análise de montagem plana tem sido útil para os domínios de documentos de reprogenitores nal e para dissecar o resultado de mudanças na sinalização RA durante pronefros padronização 6,7 (Figura 5), o que era até então desconhecida. Tomados em conjunto, estes exemplos sugerem que há de fato muitas amplas aplicações para esta montagem plana protocolo do estudo de diversos processos que ocorrem durante o desenvolvimento normal e estados doentes. Conceitualmente, este procedimento plana de montagem é bastante simples em geral. No entanto, as manipulações e grau de finesse necessários para dominar este método pode ser bastante difícil de dominar, na ausência de demonstração visual. Portanto, este protocolo foi elaborado para permitir aos investigadores, especialmente aqueles que são novos para o modelo de peixe-zebra, com a oportunidade de entender melhor como executar esta técnica e partilhar o nosso aconselhamento sobre os reagentes que podem otimizar a manipulação de tecidos. Esperamos que este protocolo acabará por permitir que outros na comunidade para refinar as condições da amostra mais ideal para ser used para geração de imagens premium, análise de dados e comunicação dos seus resultados em publicações. Em última análise, isso deve permitir aos investigadores para superar os obstáculos anatômicos do peixe-zebra durante a embriogênese precoce, o que pode obscurecer a apresentação de resultados experimentais, e resolver estes através do uso desta técnica simples, mas significativo.

O peixe-zebra, Danio rerio, tornou-se um organismo largamente utilizado no estudo da biologia do desenvolvimento. Zebrafish estão tropicais, espécies de vertebrados de água doce pertencente à família Cyprinidae. Zebrafish foram originalmente usado para a pesquisa ambiental para obter informações sobre os riscos potenciais de poluentes da água, como eram facilmente obtidos, barato e fácil de manter um. Ao longo dos últimos trinta anos, o peixe-zebra tornou-se reconhecido como um sistema modelo de vertebrados geneticamente tratável por uma série de razões. Zebrafish mostram um alto grau de conservação anatômica e fisiológica com vertebrados superiores, incluindo mamíferos 2,3. Anotação recente sequência do genoma revelou que aproximadamente 70% dos genes humanos têm, pelo menos, um peixe-zebra contraparte 4. Por exemplo, muitos genes ortólogos que desempenham um papel importante durante o desenvolvimento do rim foram identificados entre estas espécies 5-7. Este dramatic grau de conservação no que diz respeito à biologia celular e molecular tem possibilitado aos pesquisadores para criar modelos para uma ampla gama de doenças humanas no peixe-zebra 8 e zebrafish tornaram-se uma ferramenta valiosa para identificar potenciais terapias medicamentosas usando telas genéticos químicas 9. Além disso, o modelo de zebrafish não só é capaz de recapitular uma variedade de processos de desenvolvimento complexos e estados de doença que são vistos em humanos, mas vários atributos adicionais também aumentam o seu apelo como um organismo modelo para estudos de embriologia. Zebrafish são ovíparos e se reproduzir através de desova de transmissão, o que fornece aos pesquisadores, com fácil acesso aos embriões desde o início da fertilização 10. Outras vantagens incluem o tamanho do embrião, transparência e desenvolvimento rápido, externo 10. Além disso, o peixe-zebra adultos possuem alta fecundidade e normalmente produzem relativamente grandes tamanhos de embreagem que pode variar entre 200-500por semana, em última análise, permitindo aos pesquisadores a realização de experimentos de alto rendimento, como telas químicas fenótipo base, com facilidade 9. Mesmo assim, apesar da infinidade de vantagens que são exibidos pelo modelo peixe-zebra, há desafios que dizem respeito à análise e comunicação dos resultados experimentais obtidos a partir de estágios iniciais de desenvolvimento. Em alguns casos, a anatomia inerente do embrião do peixe-zebra pode obscurecer a visualização de um dos dados. Após a fecundação, a célula inicial passa por vários eventos de clivagem como o desenvolvimento progride 11. Seguindo a gastrulação, o eixo embrionário surge na fase tailbud (10 CGA) tal que ele é enrolado à volta da gema 11. Como desenvolvimento posterior avança ao longo do período de segmentação, o tronco vai crescer em massa e também prolongar por alongamento axial de tal modo que uma cauda, ​​juntamente com uma porção do saco vitelino em si estendem para fora a partir do centro de massa de gema11. Entre o tailbud e 20 fase somito (hpf 19), as tentativas para observar características específicas do desenvolvimento, após a utilização de vários protocolos de coloração, como desejar, pode ser um desafio, tanto para visualizar e fotografia, devido à geometria do embrião e opacidade o saco vitelino. Uma maneira de eliminar esses desafios é retirar a gema e depois achatar o embrião para uma amostra de duas dimensões que pode ser analisada de uma forma mais simples. Os seguintes recursos de protocolo e de vídeo fornecem um guia para saber como deyolk sucesso e plana montar um embrião após fixação e coloração, usando o exemplo de uma ou duas cores DESEJO coloração. Desejo é uma técnica amplamente utilizada que permite a detecção de ácidos nucleicos específicos em amostras conservadas e, portanto, permite que o sítio (s) de expressão do gene a ser detectado nos tecidos. DESEJO técnicas têm sido extensivamente descritas, e pode ser realizada com vários substratos de cores, bem como a gripeOs sistemas de detecção orescent 12-20. Aqui nós fornecemos o nosso protocolo DESEJO modificado usado para embriões de peixe-zebra entre os tailbud e segmentação estágios de desenvolvimento. Protocolos alternativos DESEJO, no entanto, são compatíveis com o processo de montagem descrito aqui plana, como se referiu no início do protocolo abaixo. Além disso, a montagem plana pode ser utilizado em conjunção com qualquer número de técnicas de visualização existentes, como por exemplo imuno-histoquímica conjunto de montagem, ou etiquetas de rastreamento de linhagem celular, que não são descritos neste protocolo. No geral, a técnica de montagem plana pode permitir uma melhor análise superior e apresentação dos dados obtidos a partir de experimentos com os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário no peixe-zebra.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 em água destilada. Suplemento com azul de metileno (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) para inibir a contaminação.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Diluir 50 X E3 em água destilada.</td></tr><tr><td>Coador de chá</td><td>de malha English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Prato de incubação de embriões</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de fundo plano</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>Detergente Tween-20 a 0,1% em 1x PBS, feito pela diluição de 10x PBS em água destilada.</td></tr><tr><td>Tween-20 estoque</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Microscopia Serviços</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolva 4% PFA (p/v) em 1x PBS, leve para ferver em uma placa quente em um exaustor. Resfrie e congele alíquotas para armazenamento a -20 ° C. Descongele imediatamente antes de usar e não congele novamente os estoques.</td></tr><tr><td>Unidade de esterilização de filtro</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>sistema de filtro de 1 L, 0,45 &mu; m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Dissolva em água destilada para fazer estoque de proteinase K (10 mg / ml) e armazene alíquotas a -20 ° C.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% formamida, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/ml de RNA torula de levedura, 50 &mu; g/&mu; l heparina</td></tr><tr><td>DIG/FLU marcada com ribossonda in vitro reagentes de reação de transcrição</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Consulte as instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>SP6 RNA polimerase</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerase</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polimerase</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de RNase 1</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de DNase 1, 10x DNase 1 tampão</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Alíquota de etanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Alíquotas de 50 ml de EtOH a 100% e EtOH a 70% (diluídas com água de qualidade molecular) e armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Água destilada de grau molecular</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>Modelo 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>Armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L fórmula: Em 1,5 L de água destilada, misture 23,2 g de ácido maleico, 17,5 g de NaCl, 55,0 g de base Trisma, adicione 8 ml de 1M Tris-HCl pH 9,5 e encha até 2 L. Autoclave.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0,1% (v/v) Solução em bloco</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Tween-20 <td>Fazemos alíquotas frescas de 50 ml: 10 ml de BSA (de 10% de estoque de laboratório), 5 ml de FCS (de estoque) e 35 ml de MABT. Salve o bloco não utilizado em 4 > C para usar para solução de anticorpos. Nota: Descongele os estoques BSA e FCS em 37 & C&ndash; Se você descongelar em uma temperatura mais alta, eles se tornam um gel espesso (não use).</td></tr><tr><td>FCS (soro fetal de bezerro) estocar</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Alíquota em porções de 5 ou 10 ml e armazenar a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Estoque de BSA (albumina de soro bovino)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00448</td><td>Faça um estoque de 10% diluído em MAB dissolvendo os flocos de BSA à temperatura ambiente com agitação rápida e, em seguida, armazene alíquotas de 10 ml a -20 ° C. Armazene os flocos de BSA não dissolvidos a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-digoxigenina</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Anticorpo antifluoresceína</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Armazenar a 4 °C.</td></tr><tr><td>Placa de coloração de 12 poços</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr>Tampão <td></td><td></td><td>de pré-coloração</td><td>100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20. Sempre faça fresco: ele vai precipitar no decorrer de alguns dias.</td></tr><tr><td>Solução de coloração-roxo</td><td></td><td></td><td>Para cada 10 ml necessários: adicione 45 &#956; l de NBT e 35 &# 956; l de BCIP para tampão de pré-coloração fresco (não usado em amostras de embriões).</td></tr><tr><td>Solução de coloração vermelha</td><td></td><td></td><td>Para cada 10 ml necessários: adicionar 31,5 &#956; l de INT e 35 &#956; l de BCIP para tampão de pré-coloração fresco (não usado em amostras de embriões).</td></tr><tr><td>Estoque NBT</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Armazenado em -20 &deg; C; pó diluído 50 mg/ml em 70% de DMF, 30% de água.</td></tr><tr><td>Estoque INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Armazenado em -20 &deg; C; pó diluído 55 mg/ml em 70% de DMF, 35% de água.</td></tr><tr><td>Estoque BCIP</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Armazenado a -20 &deg; C; pó diluído 50 mg/ml em DMF 100%.</td></tr><tr><td>DMF (dimetilformaldeído)</td> <td>American Bioanalytical</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0,1 M glicina, pH 2,2</td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico pequena</td><td>Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinça Padrão # 55</td></tr><tr>Ferramenta <td></td> de<td>cílios</td><td></td><td>Construído afixando um chicote adequado a uma ponta de pipeta (tamanhos que variam de P10-P1000 podem ser usados) usando supercola. Usamos um cílio humano naturalmente derramado, um bigode de animal naturalmente derramado ou um cabelo de casaco de pele crespo, ou um cílio natural ou sintético comprado no departamento de beleza de uma loja farmacêutica ou de varejo (cílios extra longos são mais passíveis de montagem estável na ponta da pipeta). A ponta da pipeta é afixada em uma haste reta (8-10 cm de comprimento), como um porta-agulha (por exemplo, Fisher 08-965-A) para facilitar o manuseio. Consulte Figura 3 para obter imagens dessas ferramentas caseiras.</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost</td></tr><tr><td>Lamínula de vidro</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Argila de modelar</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Outros produtos de massa de modelar artesanais podem ser substituídos.</td></tr><tr><td>Suporte de slides</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Bandeja de papelão para armazenar slides planos.</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio composto</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

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Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

O embrião de peixe-zebra agora é comumente usado para a pesquisa básica e biomédica para investigar o controle genético dos processos de desenvolvimento e modelar anomalias congênitas. Durante o primeiro dia de vida, o embrião do peixe-zebra progride através de vários estágios de desenvolvimento, incluindo a fertilização, clivagem, a gastrulação, segmentação, e a organogénese de estruturas, tais como o rim, coração e sistema nervoso central. A anatomia de um jovem embrião de peixe-zebra apresenta vários desafios para a visualização e análise dos tecidos envolvidos em muitos desses eventos porque o embrião se desenvolve em associação com uma massa de gema rodada. Assim, para uma análise precisa e imagem de fenótipos experimentais em amostras embrionárias fixadas entre o tailbud e 20 somite fase (10 e 19 horas após a fertilização (hpf), respectivamente), como as coradas utilizando toda montagem de hibridização in situ (desejo), ele é muitas vezes desejável remover o embrião da gema btodos e para posicioná-la plana sobre uma lâmina de vidro. No entanto, a realização de um procedimento de montagem plana pode ser tedioso. Portanto, bem-sucedido e eficiente plano de montagem de preparação é muito facilitada através da demonstração visual da técnica de dissecação, e também ajudou usando reagentes que auxiliam no tratamento de tecido ideal. Aqui, nós fornecemos o nosso protocolo DESEJO para a detecção de uma ou duas cores da expressão do gene no embrião de peixe-zebra, e demonstrar como o processo de montagem plana pode ser realizada neste exemplo de um espécime fixos manchadas. Este protocolo de montagem plana é amplamente aplicável ao estudo de muitas estruturas embrionárias que surgem durante o desenvolvimento precoce de peixe-zebra, e pode ser implementada em conjunto com outros métodos de coloração realizados em amostras de embrião fixos.

O procedimento de montagem plana protocolo envolve a transformação do embrião do peixe-zebra a partir de sua anatomia normal, em que o eixo do corpo é enrolado em torno de uma esfera de gema localizado centralmente, numa bidimensional preparação (Figura 1A). Toda a montagem de imagem do jovem embrião do peixe-zebra é limitada pela natureza da forma como o eixo embrionário é enrolado à volta da gema. Como resultado, vistas laterais ou dorsais de montar todo espécimes embriões corados apenas podem captar uma porção do eixo ou tecidos particulares obscuros (Figura 1B). Por comparação, deyolking e achatamento do embrião permite que todo o eixo embrionário deve ser visualizados de uma só vez (Figura 1B). Estas limitações são demonstradas por análise de um embrião DESEJOS corado que foi marcado com ribossondas anti-sentido para detectar irx3b (roxo), o que constitui um subconjunto das células progenitoras renais localizados adjacentes aos somitos 7 a 13, e myod1 (vermelho) que rotula osomitos (Figura 1B). O campo de irx3b + renais progenitores é obscurecida no conjunto de montagem lateral, vista por transcritos irx3b são abundantes no sistema nervoso central, fazendo com que o campo renal praticamente impossível visualizar com o ângulo da câmara lateral; além disso, o campo de irx3b + progenitoras renais é apenas parcialmente visível, quando o embrião está rodado para uma câmara de vista dorsal porque o campo é enrolado à volta da gema (Figura 1B). No entanto, uma vista dorsal do mesmo embrião seguinte montagem plana permite que a totalidade do campo de irx3b + progenitoras renais ser analisadas de uma forma simples, em relação aos somitos ao longo do tronco e outras estruturas embrionárias (Figura 1B). Assim, os domínios espaciais elaboradas podem ser idealmente documentado com este método. Vários grandes passos estão envolvidos na execução bem-sucedida do processo de montagem plana. Para executar esta technique, a gema de bola deve ser destacada do primeiro embrião propriamente dito (figura 2A), o que pode ser feito com instrumentos finos, tais como um par de fórceps finos enquanto o embrião é visualizada usando um estereomicroscópio. Após a remoção do produto em bruto da bola gema, uma ferramenta de chicote fino é utilizado para raspar grânulos de vitelo que permaneceram ligados ao embrião (figura 2B). A remoção dos grânulos de vitelo restantes ajuda a facilitar a visualização dos tecidos embrionários. Finalmente, o embrião deyolked é manipulada para posicionar de forma estável sobre uma lâmina de vidro (Figura 2C), que permite a observação e auxiliares de documentação da amostra, utilizando o software de imagem e uma câmara ligada a um microscópio. As ferramentas do chicote são dispositivos caseiros que podem ser construídos através da aposição de um chicote adequado para uma ponteira usando supercola, que podem ser montados em uma alça, se desejar (Figura 3A, mesa Materiais). Amostras chicote diferentes podem ser adquiridos para produzirchicotear ferramentas com características ligeiramente diferentes em termos de comprimento e conicidade (Figura 3B), o que cada usuário pode ter diferentes predileções para uma vez que eles começam a experimentar com o processo de montagem plana. Exemplos de amostras chicote incluem naturalmente derramou cílios humanos, naturalmente, galpão cabelo duro animal ou bigodes, e, finalmente, de variedades sintéticas de cílios disponíveis comercialmente encontrado em departamentos de cosméticos de varejo. A área local circundante e que contém a amostra (s) posicionada sobre uma lâmina de vidro (Figura 4A) pode ser convertido em imagem para análise de alta resolução. Uma combinação de sondas foram usadas para rotular os progenitores renal em desenvolvimento que dão origem ao rim no embrião do tipo selvagem em estágios precoces de desenvolvimento com duas cores desejadas e, em seguida, fixa montagem preparações foram realizadas para ver as amostras (Figura 4B, 4C ). Durante os estágios iniciais somito, progenitores renais são demarcados em um padrão em forma de U por diaeir expressão de transcritos (roxos) pax2a cercam a mesoderme paraxial que expressa concomitantemente delta C (dlc) (vermelho) (coluna da esquerda, a Figura 4B) 6,7. Em comparação, quando foram detectados transcritos de DLC com um substrato de púrpura, e foram marcadas em combinação com o marcador krox20 rombencéfalo (vermelha), um subdomínio rostral dos progenitores renais foi visualizado que expressa dlc (coluna da direita, a Figura 4B), como observado anteriormente 6,7. Montagem preparações planas pode ser utilizado de forma semelhante para estudar as fases somitogenesis posteriores. Na fase de somito 14, foi analisada a expressão de marcadores renais pax2a, slc4a4, e slc12a3 (roxo), juntamente com smyhc1 (vermelho), que marca as somitos (Figura 4C). Estas combinações de permitir o mapeamento do domínio inteiro progenitoras renais com pax2a, enquanto revelando que um subconjunto de células numa expr subdomínio rostralEssed slc4a4a e foram distinguidos por um subdomínio caudal não sobreposição de progenitores renais que expressavam slc12a3. DESEJOS duas cores e a preparação de montagem plana também são valiosas para o estudo de domínios celulares durante a organogénese em peixes-zebra com mutações genéticas ou de outras perturbações da exposição ambiental a pequenas moléculas de 6,7 (Figura 5). Os NLS e mutantes de peixe-zebra lib abrigar mutações em aldeído desidrogenase 1a2 (ALDH1A2, anteriormente conhecido como RALDH2), que codifica uma enzima necessária para a biossíntese do ácido retinóico (RA). RA é essencial para o desenvolvimento correcto de muitos tipos de células renais, incluindo a formação de células podocyte que contribuem para tornar o filtro de sangue do rim embrionário, conhecido como o glomérulo 6,7. DESEJO foi realizada para identificar os progenitores podocyte com wt1a concomitantemente com demarcação de tele desenvolvimento somitos com smyhc1 e rombencéfalo com krox20 em embriões de tipo selvagem, mutantes nls embriões, os embriões mutantes lib e os embriões tratados com um inibidor químico de enzima ALDH, DEAB (Figura 5). Os embriões com expressão deficiente ALDH1A2 mostrou reduzida expressão wt1a comparado com embriões de tipo selvagem, enquanto que os embriões tratados com DEAB mostrou uma revogação dos transcritos wt1a (Figura 5, coluna da direita). Tomados em conjunto, estes resultados representativos demonstrar como a técnica de montagem plana pode ser usada para analisar e documentar as diferenças anatômicas com precisão no embrião precoce, e, assim, ser implementadas para estudos de desenvolvimento valiosos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral da montagem preparação planaração para os embriões de peixe-zebra. A) O procedimento de montagem plana permite a visualização simultânea de tecidos ao longo do eixo embrionário, pois a massa de gema central é removido eo embrião estavelmente posicionado sobre uma superfície plana. B) As imagens de toda uma montagem DESEJA embrião manchado em vista lateral e dorsal, e depois de uma preparação plana montagem foi realizada. O embrião foi corado com sondas antisense para detectar transcritos do gene que codifica irx3b (roxo) e myod1 (vermelho). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figura 2. Esquemática do procedimento plana de montagem para embriões de peixe-zebra. A) O embrião é primeiro grosseiramente deyolked para remover a maior parte da massa de gema, em seguida, (B), a superfície ventral é finamente deyolked para remover restantes grânulos de vitelo, edepois de lavar o embrião é (C) montados lado dorsal em uma lâmina de vidro para análise visual e / ou imagem fotográfica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figura 3. Fotografias de exemplo, ferramentas de chicote em comparação com uma pinça fina. A) ferramentas chicote caseiros foram fotografadas ao lado de um par normal de uma pinça fina, posicionado ao lado de uma régua métrica para fornecer uma referência. B) vista ampliada de ferramentas chicote ao lado dos pinça fina, com a referência milímetro fornecido ao longo da parte superior da visualização . Duas ferramentas chicote diferentes são mostrados, com o asterisco (*) usado para marcar o chicote obtido a partir de um galpão de cílios naturalmente humana, e dois asteriscos (**) usado para marcar um chicote que foi obtido a partir de um bigode naturalmente derramou felina e aparado para fazer um final um tanto brusco. Em cada casi só, o chicote foi enfiada através da ponta da pipeta e afixada com várias camadas de supercola para criar progressivamente um forte selo para estabilizar / ancorar o chicote para a pipeta ligado a um dispositivo de manipulação. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figura 4. Caracterização das mudanças de desenvolvimento no campo progenitora renal no embrião do peixe-zebra de tipo selvagem. A) Deslize esquemático indicando a zona trabalhada para análise em (B, C). B) embriões de tipo selvagem nas posições 1, 3, 5 e fase somito foram coradas com duas cores por pretendam avaliar a composição do campo progenitora renal que dá subir para o rim embrionário, ou pronefros. (Coluna da esquerda) Transcrições que codificam o fator de transcrição pax2a (coradas em roxo) marcam várias populações no embrião, incluindo o p renalcampo rogenitor que emerge a partir da mesoderme intermediária. Transcrições que codificam o ligante dlc Notch marcar somitos que se formam a partir da mesoderme paraxial (coradas em vermelho). (Coluna da direita) Quando a expressão de transcritos de DLC (coradas de púrpura) e a parte posterior do cérebro rhombomere marcador krox20 (manchado de vermelho) são examinados nos mesmos embriões, dlc expressão pode ser observada em um subdomínio rostral dos progenitores renais localizados adjacentes aos somitos 1-5, que foi obscurecido durante a co-coloração de DLC com pax2a. C) de embriões de tipo selvagem, na fase 14 somito foram duplo ou triplo-corados com uma combinação de um marcador renal (roxo), o marcador smyhc1 somito (vermelho) , e a parte posterior do cérebro rhombomere marcador krox20 (também vermelho). (Painel superior) Nesta fase, as transcrições pax2a continuar a demarcar os progenitores renais. (Média, painéis inferiores) No território progenitor renal, um subdomínio rostral é marcadopor slc4a4 e transcritos que codificam slc12a3 marcar um subdomínio caudal. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figura 5. A utilização de preparações montadas planas para caracterizar os fenótipos causadas por mutações genéticas ou perturbações genéticas químicos que modulam a biossíntese do ácido retinóico. DESEJOS O padrão de expressão, na fase de 15 somito wt1a (roxo) e smyhc1/krox20 (vermelho) foi comparada entre os tipos selvagens e embriões com deficiências na produção de ácido retinóico (AR) devido a defeitos de aldeído desidrogenase 1a2 (NLS e mutações lib) ou inibição química da retinaldehyde atividade desidrogenase com dietilaminobenzaldeído (DEAB). A redução da produção de AR em lib é ligeiramente mais intensa do que o NLS, taisque os embriões lib expressar coloração ligeiramente reduzida de transcrições wt1a que semelhante encenado nls embriões mutantes, enquanto o tratamento DEAB de tipos selvagens está associada a revogação completa da expressão wt1a.

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a visualização de embriões de peixe-zebra corados e fixados em estágios iniciais de desenvolvimento. Isso é conseguido primeiramente corando o embrião de peixe-zebra usando montagem em lâmina com hibridização C dois. Em seguida, seleciona-se um embrião para montagem plana e faz-se uma incisão central na gema com um par de pinças finas; então, utilizam-se ferramentas de aplicação para suavemente raspar e remover os grânulos remanescentes de gema.Por fim, o embrião é montado em glicerol sobre uma lâmina para permitir a obtenção de imagens adequadas do espécime. Em última análise, o montagem plana permite uma melhor visualização de embriões corados em vista dorsal, removendo a gema e posicionando o embrião em uma preparação bidimensional. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a obtenção de imagens de embriões intactos em estágios mais jovens de desenvolvimento, é que o montagem plana remove o saco vitelino, permitindo a visualização completa do embrião.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento, como a caracterização do domínio do campo pré-renal no embrião. Em geral, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades, pois o procedimento exige manipulação delicada do embrião e, além disso, aprender a quantidade adequada de pressão necessária para remover o saco vitelino pode levar algum tempo. A demonstração deste procedimento será feita por mim, Zoe, e Amanda, que somos estudantes de pós-graduação no laboratório Winger.Após coletar, fixar e corar os embriões, de acordo com o protocolo descrito, selecione um embrião para montagem plana com uma X-P-B-S-T. Transfira o embrião para uma placa de Petri de plástico ou vidro. Em seguida, com a placa sob um microscópio estereoscópico, use pinças finas para rolar o embrião de modo a obter uma visão lateral com as extremidades da cabeça e da cauda visíveis.Em seguida, use pinças finas para segurar o embrião firmemente e um segundo par para fazer uma incisão na gema em uma posição centralmente localizada entre a cabeça e a cauda do embrião. Então, com pinças finas, retire a gema da cavidade da célula de carvalho. Use um X-P-B-S-T para enxaguar resíduos de gema do embrião, utilizando uma a duas gotas de um XPBS.Transfira o embrião para uma lâmina de vidro plana. Arraste o embrião até a borda do tampão para que permaneça em uma posição plana contra a lâmina de vidro. Enquanto fixa o embrião, use uma ferramenta de cílios para raspar suavemente a superfície ventral e remover os grânulos de vitelo.Se a solução de PBST ficar cheia de excesso de vitelo ou começar a evaporar, adicione uma a duas gotas frescas e arraste o embrião para este tampão novo. Após a remoção satisfatória do vitelo, transfira suavemente o embrião de volta para uma placa de Petri com PBST para uma lavagem final. Em seguida, transfira o embrião para uma placa de Petri contendo glicerol a 100% e incube por cinco minutos.Para montar o embrião em uma lâmina de vidro, transfira-o para uma lâmina limpa. Coloque uma a duas gotas de glicerol a 100% e posicione-o com o lado ventral do vitelo voltado para a lâmina. Usando uma ferramenta de cílios, arraste o embrião até a borda da gota de glicerol para que permaneça em uma posição plana contra a lâmina.Se o eixo embrionário estiver curvado, use a pinça fina para fazer pequenas incisões suaves no vitelo remanescente a fim de aliviar a tensão, permitindo que ele seja posicionado plano. No lâmina. Coloque pequenas porções de massa de modelar nas quatro bordas de um lamínula de vidro de 18 por 18.Coloque lentamente a lamínula sobre o embrião, inclinando-a para minimizar bolhas de ar na glicerina. Por fim, adicione uma gota adicional de glicerina a 100% na lateral da lamínula para preencher o espaço entre o vidro e eliminar deslocamentos; utilize um microscópio estereoscópico ou composto para obter a imagem mostrada aqui. Uma combinação de sondas foi utilizada juntamente com marcação de dois cores para identificar progenitores renais em desenvolvimento que darão origem ao rim, e os embriões foram montados planos no estágio inicial.Assim, nos estágios de ácaro, os progenitores renais são delimitados em um padrão em forma de U pela expressão dos transcritos de PAX dois A ao redor do mesoderma parial que, concomitantemente, expressa delta C mostrado em vermelho. Quando delta C foi marcado em conjunto com C crox 20, revelou-se um subdomínio rostral dos progenitores renais que expressa delta C; analisando a expressão de PAX dois A, SLC quatro A quatro, SLC 12 A três e S-M-Y-H-C um no estágio de 14. O estágio de ácaro permite o mapeamento de todo o domínio dos progenitores renais com PAX dois A e revelou que um subconjunto de células no subdomínio rostral expressava SLC quatro A quatro.Que não se sobrepunha ao subdomínio coddle dos progenitores renais que expressavam SLC12A3. Nesta figura, embriões com mutações no gene Retinol desidrogenase 2, necessário para a biossíntese do ácido retinóico, ou embriões tratados com DEAB, inibidor de ALDH, desenvolveram com expressão reduzida ou abrogada, respectivamente, de WT1A, demonstrando que a técnica de hibridização in situ em duas cores com preparação em monta inteira é valiosa para o estudo de domínios celulares durante a organogênese. Em peixes-zebra com mutações genéticas ou quando expostos quimicamente a moléculas pequenas, uma vez dominada, esta técnica pode levar de 10 a 15 minutos, se realizada corretamente.Após seguir este procedimento, outros métodos, como o imageamento, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como onde estão localizados os limites dos segmentos renais. Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar planamente um embrião de peixe-zebra corado para melhor visualizar as estruturas desejadas mediante a remoção da gema.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

O desenvolvimento do peixe-zebra pode ser seguido ao longo de dias com microscopia folha de luz quando os embriões estão embutidos em tubos de polímero opticamente clara com agarose de baixa concentração.

Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish

Aqui, apresentamos um método de montagem versátil que permite a imagem de lapso de tempo de longo prazo do desenvolvimento posterior do corpo de embriões vivos de peixe-zebra sem perturbar o desenvolvimento normal.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Uma estratégia de preparação de amostras para imagens de embriões iniciais de peixe-zebra dentro de um córion intacto usando um microscópio de folha de luz é descrita. Ele analisa as diferentes orientações que os embriões adquirem dentro do córion nos estágios de 70% de epibólia e gema e detalha estratégias de imagem para obter resolução em escala celular em todo o embrião usando o sistema de folha de luz.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Aprenda a técnica de montagem plana de embriões de zebrafish corados por hibridização in situ em montagem total para melhorar a visualização de estruturas embrionárias em biologia do desenvolvimento.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte Em situ Hibridização (Vídeo) | JoVE Journal

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte

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