Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte Em situ Hibridização

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

O objetivo geral deste procedimento é visualizar melhor os embriões de peixe-zebra fixos corados em pontos iniciais do desenvolvimento. Isso é feito primeiro colorindo o embrião de peixe-zebra usando montagem doméstica em hibridização C dois. Em seguida, um embrião é selecionado para montagem plana e uma incisão central é feita na gema Com um par de pinças finas, as ferramentas de cílios são usadas para raspar e remover suavemente os grânulos de gema restantes.

Finalmente, o embrião é montado em glicerol em uma lâmina para permitir a imagem apropriada da amostra. Em última análise, a montagem plana permite uma melhor visualização dos embriões corados a partir de uma visão dorsal, removendo a gema e posicionando o embrião em uma preparação bidimensional. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a imagem de embriões intactos em estágios de desenvolvimento mais jovens, é que a montagem plana remove o saco vitelino, permitindo que todo o embrião seja visualizado.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento, como caracterizar o domínio do campo pré-gênero renal em um embrião. Geralmente, os indivíduos novos nesse método lutam porque essa técnica requer um manuseio delicado do embrião e também porque aprender a quantidade apropriada de pressão necessária para remover o saco vitelino pode levar tempo. Demonstrando esse procedimento estaremos eu, Zoe e Amanda, que somos estudantes de pós-graduação no laboratório de wingers.

Após coletar, fixar e colorir os embriões, de acordo com o protocolo de texto, selecione um embrião para montagem plana com um X-P-B-S-T. Transfira o embrião para uma placa de Petri de plástico ou vidro. Em seguida, com o prato sob um microscópio estéreo, use uma pinça fina para rolar o embrião de modo que uma visão lateral seja obtida com as extremidades da cabeça e da cauda visíveis.

Em seguida, use uma pinça fina para manter o embrião estável e um segundo conjunto para fazer uma incisão na gema em uma posição localizada centralmente entre a cabeça e a cauda do embrião. Em seguida, com uma pinça fina, retire a gema da cavidade da célula do carvalho. Use um X-P-B-S-T para enxaguar a gema perdida do embrião usando uma a duas gotas de um XPBS.

Transfira o embrião para uma lâmina de vidro plana. Arraste o embrião para a borda do tampão para que ele permaneça em uma posição plana contra a lâmina de vidro. Ao ancorar o embrião, use uma ferramenta de cílios para raspar suavemente a superfície ventral para remover os grânulos vitelinos.

Se a solução de PBST ficar confusa com excesso de gema ou começar a evaporar, adicione uma a duas gotas frescas e arraste o embrião para esse tampão fresco. Depois que a gema for removida satisfatoriamente, transfira suavemente o embrião de volta para uma placa de Petri de PBST para um enxágue final. Em seguida, transfira o embrião para uma placa de Petri contendo 100% de glicerol e incube por cinco minutos.

Para montar o embrião em uma lâmina de vidro, transfira-o para um copo limpo. Deslize uma a duas gotas de glicerol a 100% e posicione-o com o lado ventral da gema voltado para a lâmina de vidro. Usando uma ferramenta de cílios, arraste o embrião até a borda da gota de glicerol para que ele permaneça em uma posição plana contra o slide.

Se o eixo embrionário for curvo, use a pinça fina para fazer pequenas incisões suavemente na gema restante para aliviar a tensão e posicioná-la plana. No slide. Coloque pequenos pedaços de massa de modelar nos quatro cantos de uma lamínula de vidro de 18 por 18

Coloque lentamente a lamínula no embrião, inclinando a lamínula para minimizar as bolhas de ar no glicerol. Finalmente, adicione uma gota adicional de 100% de glicerol na lateral da lamínula para preencher o espaço entre o vidro e eliminar a deriva, use um microscópio estéreo ou composto para a imagem mostrada aqui. Uma combinação de sondas foi usada junto com dois desejos de cores para rotular os progenitores renais em desenvolvimento que dão origem ao rim e os embriões foram montados no início.

Assim, os estágios dos ácaros, os progenitores renais são demarcados em um padrão em forma de U por sua expressão de PAX dois transcritos A ao redor do mesoderma parial que expressa concomitantemente o delta C mostrado em vermelho. Quando o delta C foi comarcado com C crox 20, foi revelado um subdomínio rostral dos progenitores renais que expressa delta C analisando a expressão de PAX dois a, SLC quatro A quatro, SLC 12 A três e S-M-Y-H-C um no 14. Portanto, o estágio do ácaro permite o mapeamento de todo o domínio progenitor renal com PAX dois A e revelou que um subconjunto de células no subdomínio rostral expressou SLC quatro A quatro.

Isso não se sobrepôs ao subdomínio coddle dos progenitores renais que expressaram SLC 12 A três. Nesta figura embriões com mutações no gene Retin Retinaldeído desidrogenase dois necessários para a biossíntese de ácido retinóico ou embriões tratados com inibidor de DEAB e ALD H desenvolvidos com expressão reduzida ou ab-rogada respectivamente de WT um A, demonstrando que o desejo de duas cores com a preparação de montagem plana é valioso para o estudo de domínios celulares durante a organogênese. Em peixe-zebra com mutações genéticas ou quando quimicamente exposto a pequenas moléculas Uma vez dominada, essa técnica pode levar de 10 a 15 minutos se executada corretamente.

Após esse procedimento, outros métodos, como imagens, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como onde estão localizados os limites dos segmentos renais. Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar um embrião de peixe-zebra corado para visualizar melhor as estruturas desejadas pela remoção da gema.