Correlativa Luz e Microscopia Eletrônica para estudar interações Microglial com placas de beta-amilóide

O objetivo geral deste procedimento é identificar placas beta-amilóides em seções cerebrais de modelos de camundongos com doença de Alzheimer antes da imunocoloração pré-incorporada e processamento de tecidos para microscopia eletrônica. Este método pode ajudar a responder às questões-chave no campo da neuroimunologia, como a interação da célula microglial com a sinapse perto dos gráficos beta amilóide. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite pré-selecionar seções de tecido cerebral contendo gráficos beta amilóide nas regiões e camadas de interesse.

Embora este método possa ser aplicado à doença de Alzheimer, também pode ser aplicado a quaisquer outras doenças ou tecidos onde a amiloidose esteja presente. Primeiro, prepare uma solução de cinco miligramas por mililitro do composto metoxi X04. Usando uma balança mirco, pesar cinco miligramas do metoxi X04.

Sob uma capela de exaustão, dissolva o metoxi X04 em 100 microlitros de DMSO e mexa até obter uma solução límpida e esverdeada. Adicione sucessivamente 450 microlitros de propilenoglicol e 450 microlitros de solução salina tamponada com fosfato enquanto mexe. Mantenha a solução misturando a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, uma emulsão verde-amarelada deve ser vista. Após injetar metoxi X04, adicione uma dose de 10 miligramas por quilograma de peso corporal e sacrificando o animal no momento desejado de acordo com os métodos aprovados, lave o cérebro fixo para ormaldeído três vezes com PBS resfriado. Em seguida, usando uma lâmina de barbear afiada, remova o bulbo olfatório e corte o cérebro coronalmente em dois a três pedaços de altura aproximadamente igual, todos os quais podem ser seccionados simultaneamente para acelerar o procedimento.

Cole os pedaços de tecido cerebral na placa de amostra presa na bandeja. Certifique-se de que a superfície de corte lisa grude firmemente na placa de amostra. Adicione a solução de PBS à bandeja até que toda a superfície do cérebro esteja completamente submersa.

Coloque a bandeja no vibratomo e ajuste as configurações do vibratomo para produzir seções de 50 mícrons de espessura. Comece a cortar e, se for peneirar, transfira imediatamente as seções para o PBS usando um pincel fino. Alternativamente, as seções podem ser colocadas em frascos de vidro contendo solução crioprotegida para armazenamento a 20 graus Celsius.

Com a ajuda de um atlas cerebral de camundongo estereotáxico, selecione seções cerebrais contendo a região de interesse e coloque cada seção em crioprotetor em um poço de uma placa de cultura de 24 poços. Em seguida, use uma pipeta descartável para adicionar uma gota de PBS em uma lâmina de microscópio e, em seguida, coloque a seção na gota. Examine a seção sob um microscópio fluorescente para identificar regiões contendo placas a-beta marcadas com metoxi X04.

Sem mover a platina do microscópio, capture imagens das regiões de interesse no campo claro, bem como no modo de fluorescência. Cada imagem deve mostrar a mesma região em ambos os campos para correlacionar a placa com a região estrutural da seção de tecido. Salve e nomeie as imagens tiradas de acordo com o número do animal.

Registre também o número do poço na placa e o campo das fotos tiradas. Coloque a seção de volta no poço designado assim que a imagem for concluída. Examine a próxima seção na sequência usando o mesmo procedimento para evitar secar as seções.

Para alinhar as imagens, abra as imagens de campo claro e campo UV para obter o mesmo ROI no ImageJ. Em seguida, use o plug-in MosaicJ para alinhar as bordas das duas imagens. Salve a imagem alinhada e combinada de acordo com o número do poço em uma pasta com o número do animal em particular.

Combine as imagens de diferentes seções do mesmo animal para identificar e localizar as placas na região de interesse. Após a conclusão do processo de triagem, armazene as seções examinadas a 20 graus Celsius em uma placa de cultura de 24 poços contendo crioprotetor até que a imunocoloração ou processamento adicional seja realizado. Primeiro, prepare a solução de tetróxido de ósmio a 1% em tampão fosfato em um frasco de vidro.

Como o tetróxido de ósmio é fotossensível, cubra o frasco de vidro com papel alumínio para proteger a solução da luz. Após a lavagem em tampão fosfato, remova o tampão das seções e espalhe-as com um pincel fino. Certifique-se de achatar as seções imediatamente antes de adicionar tetróxido de ósmio, pois quaisquer dobras nas seções se tornarão permanentes e a tentativa de achatar o tecido após a fixação do ósmio apenas quebrará as seções.

Use uma pipeta de transferência para adicionar tetróxido de ósmio às seções, uma gota de cada vez, até que a seção esteja imersa. Cubra o poço com papel alumínio para proteger as seções da luz e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Durante esta incubação, prepare a resina plástica em um béquer descartável.

Combinar os componentes por ordem e homogeneizar bem com uma pipeta serológica de 10 mililitros até obter uma cor uniforme. Transfira a mistura preparada para pratos de pesagem de alumínio. Estes receberão as seções de tecido assim que forem desidratadas.

Decorrido o tempo de incubação, desidratar as secções em concentrações crescentes de etanol durante dois minutos cada. Transfira as seções desidratadas da placa de cultura de 24 poços para frascos de vidro de 20 mililitros. Em seguida, mergulhe as seções em óxido de propileno três vezes por dois minutos de cada vez para remover o etanol residual.

Em seguida, use uma ponta de pipeta de vidro dobrada ou um pincel fino para transferir as seções da solução de óxido de propileno para a resina plástica e deixe durante a noite para infiltração à temperatura ambiente. Após a infiltração, coloque os pratos de pesagem de alumínio contendo as amostras em um forno de 50 a 60 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Para incorporar seções em folhas de filme de policlorotrifluoretileno, primeiro use um pincel fino para pintar uma fina camada de resina na seção.

Em seguida, mova uma seção de tecido de cada vez de um prato de pesagem de alumínio para a folha de filme PCTFE. Remova o excesso de resina ao redor do tecido, tomando cuidado para não perturbá-lo. Depois de mover todas as seções de um prato de pesagem para a folha de filme PCTFE, coloque uma segunda folha de PCTFE sobre a primeira, criando um sanduíche de tecido e resina entre as duas folhas.

Polimerizar a resina em uma incubadora por três dias a 55 a 60 graus Celsius. O tecido está então pronto para seccionamento ultrafino e exame ultraestrutural. As imagens a seguir mostram imagens duplas de uma seção do hipocampo usando os modos de campo claro e fluorescência.

As regiões e camadas de interesse são visualizadas sob campo claro. Enquanto as placas a-beta são localizadas com sucesso usando um filtro UV em uma faixa de 340 a 380 nanômetros. Esta imagem mostra uma seção do hipocampo antes da imunocoloração pré-incorporada para IBA1.

Uma placa visível é delineada pela linha pontilhada. Esta imagem mostra a mesma seção após a imunomarcação pré-incorporada para IBA1 e o processamento para microscopia eletrônica de transmissão. Observe que a placa circundada por uma linha pontilhada ainda é visível no processamento do tecido para microscopia eletrônica.

Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em uma semana, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todas as etapas devem ser executadas rigorosamente para reduzir a probabilidade de contaminação e outras degradações estruturais que afetarão a qualidade das amostras. Não se esqueça de que trabalhar com ósmio pode ser extremamente perigoso e, portanto, você deve sempre tomar precauções, como usar jaleco e luvas ao realizar este procedimento.

Certifique-se de descartar após o uso no final do experimento, de acordo com as diretrizes da sua instalação.