Concepção e desenvolvimento de aptâmero-nanopartículas de ouro Baseadas colorimétricos Ensaios para Aplicações In-the-campo

O objetivo geral é fornecer uma abordagem geral para o desenvolvimento de um ensaio colorimétrico baseado em nanopartículas de aptamer-gold para a detecção de moléculas-alvo, além de fornecer abordagens para melhorar o armazenamento a longo prazo e reduzir as taxas de resposta falso-positiva. Esse método responde a questões-chave no campo dos ensaios colorimétricos de nanopartículas de ouro com aptamer, como a reprodutibilidade dos ensaios no campo para armazenamento a longo prazo e a redução da taxa de resposta falso-positiva. Esses ensaios podem ser propensos a problemas com a vida útil e respostas falsas positivas.

Neste trabalho, aprimoramos ambas as questões. Limpe um frasco Erlenmeyer de 500 mililitros e uma grande barra de agitação com cinco mililitros de ácido nítrico concentrado e 15 mililitros de ácido clorídrico concentrado em um capuz de segurança química. Molhar toda a superfície do frasco com a lavagem ácida.

Depois, enxágue o frasco com água sem nuclease e deixe secar o frasco. Adicione 100 mililitros de um milimolar de ouro três cloreto. Use uma folha de papel alumínio para cobrir a parte superior do frasco Erlenmeyer limpo com ácido e aqueça mexendo continuamente em uma chapa quente até ferver.

Em seguida, adicione 10 mililitros de citrato de sódio 38,8 milimolares. A cor muda de clara ou cinza para azul escura ou preta, e finalmente de escura para vermelha ao longo de vários minutos. Continue mexendo com o fogo desligado por 10 minutos.

Deixe a suspensão de nanopartículas de ouro esfriar até a temperatura ambiente e adicione 110 microlitros de DEPC com agitação contínua. Cubra todo o frasco com papel alumínio e deixe o tratamento DEPC incubar durante a noite. No dia seguinte, autoclave da suspensão de nanopartículas de ouro.

Depois, esfrie até a temperatura ambiente e filtre através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 micron. Armazene a solução de nanopartículas de ouro filtrada e autoclavada no escuro a quatro graus Celsius. Calcule a concentração de nanopartículas de ouro conforme descrito no protocolo de texto.

Aqui, a concentração foi calculada em 10 nanomolares com tamanho de 15 nanômetros, conforme determinado por espalhamento dinâmico da luz. Compre ou sintetize as sequências de aptamers que se ligam à cocaína usando a química padrão de fosforamidita. Após purificar os aptameros usando dessalinização padrão, reconstitua os oligonucleotídeos em água sem nucleases, em soluções de estoque de 100 micromolares ou de um milimolar.

Aptamers purificados aliquotados podem ser armazenados a 20 graus Celsius por vários meses. Combine o DNA com a solução de nanopartículas de ouro de 10 nanomolares, variando o volume de nanopartículas de ouro conforme desejado, para fornecer amostra suficiente para que o teste seja realizado. Incube a mistura por três a quatro horas em temperatura ambiente e proteja-se da luz.

Adicione um volume igual de 20 milimolares de HEPES, dois milimolares de cloreto de magnésio e um tampão de pH 7,4, e coloque a amostra a quatro graus Celsius no escuro durante a noite. A concentração inicial de sal necessária para induzir a resposta de cor do ensaio por meio da titulação do sal é determinada com o blank do ensaio. Adicione 20 microlitros de metanol a alíquotas de 180 microlitros do ensaio de aptamer-cloreto de ouro em uma placa de 96 poços.

Uma etapa crítica no desempenho desses ensaios é determinar a concentração de cloreto de sódio para desestabilizar as nanopartículas de ouro após a adição do alvo. Titule as amostras com volumes crescentes de solução de cloreto de sódio e determine o ponto de equivalência. Aqui, determine o volume de cloreto de sódio necessário para causar a menor mudança de cor por observação visual.

Otimizando a resposta do ensaio, adicione 20 microlitros de moléculas de analito diluídas em metanol a alíquotas de 180 microlitros de ensaio de nanopartículas aptamer-ouro em uma placa de 96 poços à temperatura ambiente. Imediatamente, adicione a concentração de cloreto de sódio determinada na etapa anterior para iniciar a resposta de cor do ensaio. Obtenha a maior mudança de cor possível aumentando ou diminuindo a concentração de cloreto de sódio e comparando a resposta alvo com a resposta em branco.

Use a concentração de cloreto de sódio que proporciona a maior diferença de resposta. Observe ou meça a resposta do ensaio 150 segundos após a adição de cloreto de sódio. Analise a absorção em 650 nanômetros e 530 nanômetros, usando um espectrofotômetro.

Plote os resultados como a razão de absorção obtida em 650 nanômetros e 530 nanômetros em função da concentração do analito. Normalize a resposta do ensaio ao sinal em branco. Prepare os componentes do ensaio de nanopartículas de aptamer-ouro conforme descrito anteriormente no vídeo.

Faça soluções separadas contendo um grama por mililitro de trehalose e um grama por mililitro de sacarose em água sem nuclease para produzir a solução criogênica. Portanto, uma etapa crítica para congelar esses ensaios é determinar quanta trealose e soluções de sacarose adicionar às amostras para garantir o congelamento total e uniforme. Faça uma solução que contenha 19,2 miligramas por mililitro de trealose e 4,8 miligramas por mililitro de sacarose com o ensaio de 60 MN4 DNA por nanopartícula de ouro em um volume final de 200 microlitros em tubos microcentrífugas de 1,5 mililitros.

As concentrações finais da solução criogênica variarão conforme a cobertura de DNA. Congele rapidamente as amostras usando um freezer de 146 graus Celsius ou em nitrogênio líquido. Armazene as amostras congeladas até o uso.

Para esse trabalho, deixe as amostras no freezer de 146 graus Celsius durante a noite e depois transfira para um freezer de 20 graus Celsius para armazenamento a longo prazo. Aqui estão apresentados resultados representativos das curvas de titulação de cloreto de sódio para nanopartículas de ouro não tratadas e tratadas com aptamero com DNA. A concentração inicial de cloreto de sódio usada no ensaio foi determinada por titulação.

Resultados representativos do ensaio colorimétrico de nanopartículas aptamer-ouro para cocaína e moléculas de controle são apresentados aqui. Os gráficos revelam o efeito que o aumento da densidade de cobertura de DNA tem na taxa de resposta falsamente positiva do teste de cocaína. Aqui estão mostrados os gráficos da curva de calibração obtidos a partir da análise fotoimagem do ensaio colorimétrico de cocaína.

Fotos obtidas usando smartphones. Resultados representativos da resposta ao ensaio do ensaio colorimétrico de nanopartículas aptamer-ouro para cocaína e moléculas de controle são apresentados aqui. Os dados comparam amostras recém-preparadas com amostras armazenadas congeladas até quatro semanas.

Ao tentar esse procedimento, é muito importante determinar a concentração adequada de cloreto de sódio para desestabilizar as nanopartículas de ouro e promover a mudança típica de cor ao adicionar o alvo. Então, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver ensaios colorimétricos de nanopartículas de ouro aptamer, para a detecção de alvos de interesse. Você pode usar as abordagens descritas aqui para reduzir as taxas de resposta de falsos positivos e manter seus ensaios viáveis por mais de um mês.