Name: Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprenda a triar peptídeos que ativam o receptor MRGPRX2 usando células HEK293 e ensaio de fluxo de cálcio com Fura-2. Este método permite identificar ligantes específicos para estudos de imunologia e farmacologia de receptores.

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A SR e a LDU gostariam de reconhecer a concessão do Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC e NSERC-Discovery para este projeto.

1. Projeto e desenvolvimento da biblioteca de peptídeos
<ol><li>Para identificar os ligantes do receptor MRGPRX2 da célula de mastro baseado em um ligante conhecido, ou seja, PAMP-1213, siga os passos abaixo.<ol>
<li>Gerar biblioteca de peptídeos truncados truncados truncando os resíduos de aminoácidos n-terminal do ligante, em sucessão, por síntese de peptídeos de fase sólida (SPPS).</li>
		<li>Gerar biblioteca de peptídeos truncados C truncando os resíduos de aminoácidos terminais C do ligante conhecido, sucessivamente, por SPPS.</li>
		<li>Com base nos resultados de 1.1.1 e 1.1.2, gerar uma biblioteca de peptídeos truncado N+C utilizando SPPS truncando os resíduos desejados do terminal N e C, respectivamente.</li>
		<li>Use a síntese de peptídeos de fase sólida para sintetizar os peptídeos13.</li>
		<li>Modifique o terminal N para o grupo acetil (Ac) e o terminal C para o grupo amide.</li>
		<li>Caracterize o peptídeo para sua pureza usando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e para a massa usando um espectrofotômetro de massa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para estudar a significância de aminoácidos específicos dentro da molécula pamp-12 pai, siga os passos abaixo.<ol>
<li>Gere uma biblioteca de peptídeos de varredura alanina substituindo os respectivos resíduos de aminoácidos na molécula de peptídeo por alanina, um de cada vez usando SPPS. Modifique o terminal N para o grupo acetil (Ac) e o terminal C para o grupo amide.</li>
		<li>Caracterize o peptídeo para sua pureza usando cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e para a massa usando um espectrofotômetro de massa. NOTA: Certifique-se de que os peptídeos sintetizados são de alta pureza. Caracterize os peptídeos usando espectroscopia de massa e HPLC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultura celular in vitro
<ol><li>Cultura HEK-X2 e células HEK-WT seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Prepare o meio cultura suplementando dMEM de alta glicose com 10% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-Glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.</li>
		<li>Passagem as células na cultura tecidual (TC) trataram frascos de cultura T-75 e crescem em uma incubadora a 37 °C contendo 5% de CO2, até que sejam 75-80% confluentes.</li>
		<li>Uma vez 75% confluente, lave as células e adicione 2-3 mL de trippsina por 2 - 3 min. Incubar em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 para desprender as células.</li>
		<li>Uma vez que as células se desgrudam, colete as células em trippsina. Adicione 6-9 mL de meio fresco.</li>
		<li>Centrifugar as células a 1620 x g por 3-5 min.</li>
		<li>Após a centrifugação, descarte o sobrenatante para coletar a pelota. Resuspend as células em um novo meio de cultura. Diluir as células de acordo com a concentração desejada. NOTA: As células HEK são células de rápido crescimento e, portanto, otimizam os suplementos médios celulares. As células HEK são células aderentes; passá-los em frascos de cultura tratados com TC para apoiar a adesão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare uma placa de ensaio 96 para o experimento.<ol>
<li>Adicione 200 μL da suspensão celular em cada poço, com uma concentração de 200.000 células/mL, para semear 40.000 células/bem.</li>
		<li>Cresça as células por 24 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2. NOTA: Otimize a densidade celular por poço com base no tamanho da placa e no tipo de tensão celular. Conduza o experimento em triplicados em uma placa de poço tc-tratada com TC preto com fundo transparente plano.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ensaio de cálcio fura-2 AM
<ol><li>Prepare o corante seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Use corante Fura-2 AM para o experimento.</li>
		<li>Prepare o tampão tampão hepes-tyrode (HTB) contendo tampão HEPES de 25 mM, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/mL de glicose, 1 mg/mL de colagem de soro bovino (BSA) e recém-adicionado 1,8 mM CaCl2 em água esterilizada autoclave.</li>
		<li>Adicione 50 μL de DMSO em 50 frascos fura-2 AM para preparar a solução de estoque de 1 mM de corante Fura-2 AM. Adicione 1 μL de 1 mM de corante Fura-2 AM por mL de meio fresco para preparar o meio de carregamento de corante com concentração de corante de 1 μM.</li>
		<li>Retire a placa de 96 poços da incubadora e descarte o meio. Substitua o meio por um meio de carregamento de tingimento fresco. Adicione 200 μL de meio de carregamento de corante em cada poço. Incubar as células por 30-40 min em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 .
</li>
		<li>Após 40 minutos de incubação, remova o meio. Lave as células com o tampão HTB. Adicione 100 μL de tampão HTB para leitura de fluorescência. Leve o prato para leitura de fluorescência. NOTA: Otimize a concentração de corante no meio de carregamento de corante. Vazamento de corante e fotobleaching são possíveis preocupações associadas ao corante. Adicione o CaCl2 fresco no buffer HTB para evitar a precipitação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ativação celular e leitura fluorescente
NOTA: Leitor de placa de fluorescência com sistema automatizado de pipetização permite a transferência automática de compostos de uma fonte composta para a placa de ensaio sem tirar a placa do leitor de placas.
<ol><li>Enquanto as células estão sendo incubadas, defina o Leitor de Placas.<ol>
<li>A temperatura é de 37 °C.</li>
		<li>Em Configurações, selecione Flex.</li>
		<li>Defina o modo de leitura para fluorescência e leitura inferior.</li>
		<li>Em Comprimentos de Onda, defina o número de comprimentos de onda para 2. Defina a Excitação para 340 nm e 380 nm. Defina a emissão para 510 nm.</li>
		<li>Deixe a sensibilidade ao padrão.</li>
		<li>Em Tempo, defina o intervalo para 3,9 s. Defina o Tempo de Execução para 94 s para obter 25 leituras.</li>
		<li>Em seguida, selecione o tipo de placa de ensaio.</li>
		<li>Em seguida, selecione os Poços para Ler.</li>
		<li>Em Transferência composta,defina transferências para 1 e volume inicial para 100 μL. Ajuste a altura da pipeta para 100 μL, volume de 50 μL e Ponto de Tempo para 36 s, para adicionar o composto na 10ª leitura.</li>
		<li>Em seguida, selecione o tipo de placa de origem composta. </li>
		<li>Deixe triturate para não utilizado.</li>
		<li>Selecione as dicas no Layout de Dicas de Pipeta.</li>
		<li>Para colunas compostos e pontas,certifique-se de que os compostos a serem transferidos estejam na coluna 1 da placa composta. Defina a Coluna de Ponta para 1 e Coluna composta para 1.</li>
		<li>Deixe o Autocalibrate como ON.</li>
		<li>Clique em OK.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando a temperatura atingir 37 °C, carregue as placas no Leitor de Placas.<ol>
<li>Pressione a Câmara de Leitura para colocar a placa de ensaio no leitor de placasde fluorescência .</li>
		<li>Pressione a Fonte para colocar a placa composta. Prepare a Placa Composta adicionando 200 μL de peptídeos respectivos, ionomicina e etileno glycol-bis (β-aminoetil ether)-N,N',N′,N′-tetraacético (EGTA)-Triton X-100.</li>
		<li>Pressione o rack de ponta para colocar a caixa de ponta. Use uma ponta preta para evitar a autofluorescência da ponta.</li>
		<li>Uma vez que as placas estejam carregadas, revise as configurações do software e pressione Read.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análise de dados
<ol><li>Determine a concentração de cálcio da razão de fluorescência pela equação de Grynkiewicz - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62448/62448eq01.jpg"> onde, Kd é a constante de dissociação de Fura-2 AM, R é a razão de emissão após excitação em 340 nm e 380 nm (F340/F380) para os respectivos peptídeos, Rmax é a relação máxima de fluorescência observada pela adição de 50 μL de 30 μM ionomicina, Rmin é a fluorescência mínima observada pela adição de 50 μL de 100 mM EGTA/2,5%Tritão X-100, e F380min e F380max são a intensidade absoluta de fluorescência de Fura-2 AM em estado livre de cálcio e vinculado, respectivamente. NOTA: A máquina dispensa o líquido com alguma força. Não ajuste a altura de distribuição de peptídeo muito perto da parte inferior da placa; pode desprender as células. Use pontas de pipeta pretas para evitar autofluorescência. Leia a fluorescência máxima e a fluorescência mínima para cada placa para cada experimento.</li>
</ol>

<ol><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Mas-related+G+protein-coupled+receptor+X2+on+mast+cell-mediated+host+defense%2C+pseudoallergic+drug+reactions%2C+and+chronic+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).</li>
<li>Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+isolation%2C+and+maintenance+of+human+mast+cells+and+mast+cell+lines+derived+from+peripheral+blood+or+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood.</a> Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53568(2015).</li>
<li>Occhiuto, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+entry+via+STIM1+contributes+to+MRGPRX2+induced+mast+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions.</a> Frontiers in Immunology. 10, 3143(2020).</li>
<li>Baba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+for+the+calcium+sensor+STIM1+in+mast+cell+activation+and+anaphylactic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses.</a> Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).</li>
<li>Hoth, M., Penner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+calcium+stores+activates+a+calcium+current+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells.</a> Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).</li>
<li>Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+method+to+quantify+intraplatelet+calcium+dynamics+by+ratiometric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry.</a> PLoS One. 10 (4), 0122527(2015).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+measurement+of+cytosolic+free+Ca2%2B+in+monolayers+and+suspensions+of+various+types+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Generation+of+Ca2+%2B+Indicators+with+Greatly+Improved+Fluorescence+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+nanoscaffold+that+activates+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).</li>
<li>Lansu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+design+of+novel+probes+for+the+atypical+opioid+receptor+MRGPRX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).</li>
<li>Navinés-Ferrer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRGPRX2-mediated+mast+cell+response+to+drugs+used+in+perioperative+procedures+and+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11628(2018).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+store-operated+calcium+%28Ca+2%2B%29+entry+%28SOCE%29+in+HEK293+cells+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2.</a> Calcium Signalling. , 163-172 (2019).</li>
<li>Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+340%2F380+nm+light-emitting+diode+illuminator+for+Fura-2+AM+ratiometric+Ca2%2B+imaging+of+live+cells+with+better+than+5+nM+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).</li>
</ol>

Os autores declaram que não há interesses concorrentes.

A sinalização de cálcio é central para a degranulação de células de mastro e tem sido amplamente utilizada no estudo de interações receptor-ligantes, identificação de ligantes e descoberta de medicamentos14. MRGPRX2 é um receptor de células de mastro recentemente descoberto que tem sido encontrado para desempenhar um papel fundamental em muitas doenças inflamatórias como coceira, asma e dermatite atópica, entre outras2. Além disso, vários medicamentos aprovados têm sido mos...

As células de mastro são parte integrante do sistema imunológico e desempenham um papel crucial nas respostas imunes inatas e adaptativas. As células de mastro são ativadas principalmente pela ligação de um antígeno à imunoglobulina E (IgE) - Complexo receptor fcεRI, ou pelo receptor de proteína G recentemente descoberto- X2 (MRGPRX2)1. A ativação mrGPRX2 tem sido associada a diversas doenças imunológicas e inflamatórias e, portanto, é importante compreender o mecanismo de ligação do receptor aos seus ligantes2. Para isso, uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos foi desenvolvida e rastreada contra receptores MRGPRX2 que foram superexpressos em células HEK. No estudo, a biblioteca de peptídeos foi construída utilizando-se técnicas simples e versáteis de escaneamento de alanina e truncação de aminoácidos. A varredura alanina envolve a substituição de aminoácidos específicos por um resíduo de alanina. Alanina sendo pequena e neutra, tira o peptídeo das propriedades específicas conferidas pelo resíduo substituído e destaca consecutivamente a significância das respectivas propriedades fisioquímicas do aminoácido nas interações receptoras. Pelo contrário, na truncação de aminoácidos, são projetadas sequências de peptídeos de tal forma que faltam um ou mais resíduos de aminoácidos do terminal N, terminal C, ou ambos. Este conjunto de peptídeos foi utilizado para identificar as sequências de aminoácidos cruciais para a ligação MRGPRX2.
A experiência com linhas de células de mastro humanos (LAD-2) mostrou que essas células são difíceis de cultivar e manter in vitro: um tempo de duplicação de duas semanas, suplementos médios caros e atenção direta necessária durante a passagem3. Esses atributos tornam as células inadequadas para a triagem em larga escala de ligantes potenciais. Aqui, células HEK transfectadas com estalagem expressando receptor MRGPRX2 (HEK-X2) foram usadas para tela da biblioteca de peptídeos1. As células HEK-293 são amplamente utilizadas e estudadas para a expressão heteróloga dos receptores superficiais devido à sua alta eficiência de transfecção, taxa de duplicação mais rápida e a necessidade de suplementos médios não caros para serem cultivados em laboratório4. O protocolo para transfetar a linha celular HEK-293 foi demonstrado e está bem estabelecido5. As células HEK-293 expressando o receptor MRGPRX2 (passagem 13-19) foram ativadas com os peptídeos gerados através de N-truncation, C-truncation, N+C-truncation e alanina scaning1. As células HEK do tipo selvagem (HEK-WT) (passagem 16-21) foram utilizadas como controle. A liberação intracelular de cálcio após a ativação foi monitorada para estudar a ativação baseada em MRGPRX2.
A ativação celular pelo MRGPRX2 é seguida por uma mobilização citosolítica de cálcio. Esta liberação de cálcio intracelular regulada em células de mastro é regulada pela entrada de cálcio operada na loja (SOCE), coordenada pela molécula de interação estromal 1 (STIM1); e é central para a cascata de resposta imune6,7. Vários métodos têm sido utilizados para detectar concentração intracelular de cálcio, incluindo grampos de remendo e corantes fluorescentes8. De todas as técnicas disponíveis, corantes fluorométricos de cálcio em conjugação com várias técnicas de detecção estão sendo amplamente utilizados9. Dois tipos de corantes fluorométricos que ganharam interesses são: corantes de comprimento de onda único como Fluo-4, e corantes complexos de comprimento de onda duplos como Indo -1 e Fura-2. A vantagem que os corantes de comprimento de onda duplo trazem sobre corantes de comprimento de onda único é que os corantes ratiométricos corretos para erros experimentais como carregamento de corante, branqueamento de fotos e foco10,11.
Fura-2 acetoximethyl ester (Fura-2 AM) é uma célula permeada, corante verde-fluorescente cuja excitação muda para um comprimento de onda mais baixo sobre a ligação de cálcio. Experimentalmente, a Fura-2 está animada em 340 e 380 nm, enquanto a emissão é registrada em 510 nm. Após a ligação de cálcio, a intensidade fluorescente a 340 nm aumenta enquanto a de 380 nm diminui, como mostra a Figura 1. Os dados são representados como uma razão de intensidade de fluorescência após excitação em 340 nm (F340) para a intensidade após excitação em 380 nm (F380) ou seja, F340/F380. A razão F340/F380 é proporcional ao cálcio intracelular, o valor pode ser calculado pela equação de Grynkiewicz12. Uma vez que o sinal de fluorescência é obtido a partir da excitação do corante em dois comprimentos de onda (340 nm e 380 nm), a razão dos sinais de fluorescência corrige para fatores experimentais como carregamento de corante, vazamento de corante, fotobleaching e densidades celulares.

<table><tbody><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793939</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Poço</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de poliestireno preto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fischer</td><td>11995065</td><td>Alta glicose</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fischer</td><td>D12345</td><td>Estéril, grau biológico</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Thermo Fischer</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Flexstation 3</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>FV06060</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Thermo Fischer</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Thermo Fischer</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamina</td><td>Thermo Fischer</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Caneta Strep</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeos</td><td>RS Syntehsis</td><td>Custom</td><td>&ge; 95% puro; terminal N - grupo acetil terminal C - grupo amida</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>DOW Chemical</td><td>166704</td><td></td></tr></tbody></table>

peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células hek projetadas

Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells

Identificar ligantes específicos para receptores celulares terapeuticamente significativos é crucial para muitas aplicações, incluindo o projeto e o desenvolvimento de novas terapêuticas. O receptor de proteína G-X2 (MRGPRX2) é um receptor importante que regula a ativação de células de mastro e, portanto, direciona a resposta imune geral. Numerosos ligantes para MRGPRX2 foram identificados e incluem peptídeos endógenos como PAMPs, defensinas, LL-37 e outros fragmentos de proteína (ou seja, albumina degradada). A identificação adicional de ligantes específicos MRGPRX2 requer a triagem de um grande número de peptídeos (ou seja, biblioteca de peptídeos); no entanto, as células de mastro são difíceis e caras de manter in vitro e, portanto, não são econômicas de usar para triagem de grandes números de moléculas. O presente artigo demonstra um método para projetar, desenvolver e selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos usando mrGPRX2 expressando células HEK. Esta linha celular é relativamente fácil e barata de manter e pode ser usada para análise in vitro de alto rendimento. Um corante fluorescente Fura-2 sensível ao cálcio para marcar o fluxo de cálcio intracelular após a ativação foi usado para monitorar a ativação. A razão de intensidade de fluorescência de Fura-2 a 510 nm contra comprimentos de onda de excitação de 340 e 380 nm foi usada para calcular a concentração de cálcio. A biblioteca de peptídeos utilizada para verificar este sistema foi baseada no endogeno proadrenomedullin N-terminal 12 (PAMP-12), que é conhecido por ligar MRGPRX2 com alta especificidade e afinidade. Peptídeos subsequentes foram gerados através de truncação de aminoácidos e técnicas de escaneamento de alanina aplicadas ao PAMP-12. O método descrito aqui é simples e barato, mas robusto para a triagem de uma grande biblioteca de compostos para identificar domínios de ligação e outros parâmetros importantes que desempenham um papel importante na ativação do receptor.

A tabela 1 contém as sequências de peptídeos geradas através da truncação de aminoácidos terminais e da varredura alanina. Como mostrado na Tabela 1,a sequência de peptídeos RKKWNKWALSR carece de fenilalanina n-terminal (F) em relação ao seu pamp-12 pai e, portanto, é um peptídeo representativo na biblioteca N-truncada. Da mesma forma, em FRKKWNKWALS, a serina terminal PAMP-12 foi removida, representando uma biblioteca de peptídeos truncado c derivado do PAMP-12. Na biblioteca de peptíde...

São descritas técnicas para a geração de uma biblioteca de peptídeos curtos que podem ativar células de mastro através do receptor MRGPRX2. As técnicas associadas são fáceis, baratas e podem ser estendidas a outros receptores celulares.

Peptídeos de triagem que ativam mrgprx2 usando células HEK projetadas

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new ...

Hoje, vamos demonstrar um método para tela de uma biblioteca de peptídeos, contra um receptor mestre recentemente descoberto, que é o receptor de proteína G X2, também conhecido como receptor MRGPRX2. As células de mastro são parte integrante do sistema imunológico, e desempenham um papel crucial nas respostas imunes inatas e adaptativas. As células de mastro são ativadas pelo receptor Fc epsilon R1 ligado ao antígeno, ou pelo receptor X2 recentemente descoberto.Ativação do receptor X2 ligado à superfície, tem sido ligado a várias doenças imunológicas e inflamadas e, portanto, é importante entender o mecanismo de ligação deste receptor aos seus ligantes. Para isso, desenvolvemos uma biblioteca de pequenas moléculas de peptídeos, e as examinamos contra receptores X2 super-expressos sobre hexis. No estudo, uma biblioteca de peptídeos foi construída utilizando técnicas simples e versáteis de escaneamento alanino, e truncações de aminoácidos.Heck293 diz que, expressando receptores X2 quando ativados com os peptídeos e hexis de tipo largo foram usados como controle. Na liberação de truncação após a ativação foi monitorado para estudar a ativação baseada em X2. Experimentalmente, o Corante Sensível ao Cálcio Fura-2 AM é animado em 340 e 380 nanômetros, enquanto a emissão é registrada em 510 nanômetros.Após a ligação de cálcio, a intensidade da fluorescência em 340 aumenta, enquanto a de 380 nanômetros, diminui. O corante é então depositado na proporção da intensidade da fluorescência em 340, para o de 380 nanômetros. O 340 de uma razão de 380, é proporcional ao cálcio intracelular, o valor dele, pode ser calculado, pela Equação de Grynkiewicz.A razão de tabbing de duas intensidades de fluorescência, efeito de fatores experimentais como diluição, fotobleaching, vazamento de corante e densidades de aroma são detectadas. Então, sem mais atrasos, vamos começar o experimento. Para identificar os ligantes do receptor MRGPR X2 da célula de mastro, o gerador N-Truncado, C-Truncado e a biblioteca de peptídeos N+C-Truncados, truncando os aminoácidos N-terminal, C-terminal e N+C-terminal de má procividade pam-12.Use síntese de peptídeos de fase sólida para sintetizar os peptídeos. Modifique o terminal final para um grupo de marés definidas, e o terminal C para o grupo amide. Gerar e alaninas podem a biblioteca de peptídeos, substituindo os respectivos aminoácidos de pam-12 por Alanine, um de cada vez.Modifique o terminal final para um grupo setide e o terminal C para o grupo amide. Prepare o meio de cultura suplementando dMEM de alta glicose, com soro bovino 10% fetal, dois milimônios L-Glutamina, cem unidades por ml de penicilina, e cem microgramas, por ml de estreptomicina. Além das células da cultura tee sue traited, 375 frascos de cultura a 37 graus Celsius, 5%CO2, até que sejam 75 a 80% confluentes.Uma vez 75% confluente, lave as células e adicione de dois a três ml de Prova-C, para desprender as células. Uma vez que as células se despem, colete as células em Proof-C. Adicione seis a nove ml de meio fresco.Centrifugar as células a 1620g por três a cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenatante para coletar a pelota. Resuspend as células em meio de cultura fresca.Diluir as células, conforme a concentração desejada. Com 200 microlitadores da suspensão celular com a concentração de 200.000 células, despeje o ambon em cada poço para buscar 40.000 células por poço. Guarde as células por 24 horas nos 37 graus Celsius, incubadora de 5% de CO2.Use corante Fura-2 AM para o experimento. Adicione 50 microliter DMSO em 50 microgramas Fura-2 AM, para preparar uma solução milimiliar de corante Fura-2 AM. Adicione um microliter de um corante Fura-2 AM mililitro por ml de meio fresco para preparar o meio de diluição de uma concentração de corante micromolar.Retire a placa de 96 poços da incubadora e descarte o meio. Substitua o meio por meio de diluição fresco. Adicione 200 microliters de meio de diluição em cada poço.Incubar as células por 30-40 minutos em 37 graus Celsius, incubadora de 5% de CO2. Enquanto as células estão sendo incubadas, defina o leitor de placas. Coloque a temperatura em 37 graus Celsius.Nas configurações, selecione Flex. Defina o modo de leitura como fluorescência e leitura inferior. Em Comprimentos de Onda, defina o número de comprimentos de onda para dois.Coloque a Excitação em 340 nanômetros e 380 nanômetros. Defina a emissão para 510 nanômetros. Deixe a sensibilidade para padrão.Em Tempo, defina o intervalo para 3,9 segundos. Defina o tempo de execução para 94 segundos para obter 25 números de leituras. Em seguida, selecione o tipo placa de ensaio.Em seguida, selecione os Poços para Ler. Em Transferência composta, ajuste as transferências para um e volume inicial para cem microliters. Ajuste a altura da pipeta para cem microliters, Volume para 50 microliters e Ponto de Tempo para 36 segundos para adicionar o composto, e para atender a leitura.Em seguida, selecione o tipo de placa de origem composta. Deixe triturate para não ser usado. Selecione o Layout de Dicas e Dicas de Pipeta.Para colunas compostas e pontas, o composto será transferido na coluna um da placa composta. Defina a Coluna de Ponta para uma e a Coluna do Composto para uma. Deixe AutoCalibrate para On.Click OK. Após 40 minutos de incubação, remova o meio.Lave as células com o buffer XDB. Adicione cem microliters de tampão XDB para leitura de fluorescência. Leve o prato para leitura de fluorescência.Quando pritchett atingir 37 graus Celsius, pressione a câmara de leitura, para colocar a placa de ensaio no leitor de placas de fluorescência. Pressione a fonte para colocar a placa composta. Prepare a placa composta adicionando 200 microliters de peptídeos respeitados ionomysin e EGTA para girar soluções X.Pressione a ponta pratt para colocar a caixa de gorjetas. Use a ponta preta para evitar a autofluorescência da ponta. Uma vez que as placas tenham sido mantidas, e se você usar as configurações do software e pressionar Leia.Determine a concentração de cálcio da razão de fluorescência pela Equação de Grynkiewicz. Mostrado são os dados de fluorescência de pam bom peptídeo. Como se pode ver, após a adição de peptídeos em 36 segundos, a fluorescência em 340 nanômetros que é mais mordaz aumenta em 380 nanômetros o recorde diminui.Os dados são representados como a razão de 340, para o de 380 sinal. Eles mostram que os sinais aumentam após a adição de peptídeos. Este número são os dados representativos para um peptídeo ativador.A Figura A mostra os sinais de fluorescência para um peptídeo ativador. Os dados representativos correspondem ao cram12 Peptide foi adicionado após a criação de uma linha de base para ciclos de licitação, como mostrado pelo ado. A Figura B mostra a razão de emissão de fluorescência após excitação em 340 nanômetros, para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nanômetros.Este número são os dados do Representante para o branco. A Figura A mostra os sinais de fluorescência para o vazio. O HTB foi adicionado após diluir uma linha de base para 10 ciclos de alimentação, como mostrado pelo ado.A Figura B mostra a ração da emissão de fluorescência após excitação em 340 nanômetros para a de emissão de floresnce após excitação em 380 nanômetros. Este número são os dados representativos para as normas de calibração de corantes. A Figura A mostra que a ionomicina foi adicionada na décima leitura, como mostrado pelo ado para obter fluorescência máxima em estado vinculado ao cashem.EGPA Triton X cem foi adicionado após 20 leituras, como mostrado pelo ado que recebe sinal mínimo. A Figura B mostra a razão de emissão de fluorescência após excitação em 340 nanômetros para a de emissão de fluorescência após excitação em 380 nanômetros. Esses valores são ainda colocados na Equação de Grynkiewicz para obter o cache intracelular de concentração.Esta figura mostra a caracterização de um Peptídeo Representativo para Confirmar a Sequência e a Pureza. A Figura A mostra que a massa vertical da sequência de peptídeos representativo WNK WAL foi de 857,90 diluir tingimento. O que é mostrado pela razão N sobre Zed na Espectroscopia de Massa.A Figura B mostra uma pureza de peptídeo de 99%, confirmada pelo HPLC. Este peptídeo pertence à biblioteca de peptídeos truncados N+C. Em conclusão, o método descrito aqui é um fácil e versátil que pode ser eficiente e brilhante para a triagem baseada em cálcio em última escala.No entanto, existem vários fatores que determinam a qualidade dos dados e, portanto, a maquiagem precisa ser otimizada para um determinado sistema de instrumentos celulares. Obrigado.

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Research

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