Name: Um método fácil para a planta polysome Profiling (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a isolar polissomos e monossomos de tecidos vegetais usando Arabidopsis thaliana. Este método permite identificar mRNAs ativamente traduzidos e estudar a regulação da tradução em plantas de forma confiável.

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Este trabalho foi apoiado pela Agência Nacional de Investigação francesa (ANR-14-CE02-0010). Agradecemos Dr. Benjamin Campo e Dr. Elodie Lanet para a leitura crítica do manuscrito. Agradecemos ao Sr. Michel Terese por sua ajuda com edição de vídeo.

1. Preparação de 20 a 50% (p / v) de sacarose Gradientes Nota: Os gradientes são feitos de 4 camadas de sacarose (50%, 35% e 2 camadas de 20%) em 13,2 ml de um tubo de ultracentrífuga. Em nossa experiência, despejando a sacarose 20% em duas camadas separadas melhora muito a qualidade das preparações polissomas. <ol><li> Preparar as soluções de estoque. Certifique-se que todas as soluções são RNAse e DNAse livre. <ol><li> Prepare 10X Solução Salina: Tris-HCl 400 pH 8,4, KCl 200 mM e MgCl 2 100 mM. </li><li> Prepare M de sacarose Solução 2: Para 200 ml, dissolver 137 g de sacarose em 1X solução salina. </li></ol></li><li> Dilui-se a solução de sacarose em solução salina, como descrito na Tabela 1, para preparar os gradientes. Os volumes indicados são para seis gradientes. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Concentração de sacarose final </td><td> sacarose 2H (ml) </td><td> Sal solução 1X (ml) </td><td> Vol final. (ml) </td></tr><tr><td> 50% </td><td> 8,8 </td><td> 3.2 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 35% </td><td> 12,9 </td><td> 12.1 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 7,4 </td><td> 17,6 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 20% </td><td> 5.8 </td><td> 14.2 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. As diluições da solução de sacarose para preparar seis gradientes. <ol start="3"><li> Despeje as camadas conforme Tabela 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> camada de sacarose </td><td> 50% </td><td> 35% </td><td> 20% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> Vol. (Ml) </td><td> 1.85 </td><td> 3.65 </td><td> 3.65 </td><td> 1,35 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Volume de solução de sacarose por camada. <ol start="4"><li> Depois de verter cada camada, manter os tubos num -40 ° C ou -80 ° C até estar completa congelador de congelação antes da adição de sacarose a camada seguinte. A congelação é geralmente alcançada após 2 h a -40 ° C, mas de esperar cerca de 6 h antes de se verter a camada seguinte é recomendado. A última camada de 20% pode ser congelada ou adicionado de fresco no dia da experiência. Nota: Congelamento cada camada antes de adicionar o próximo impede a partir de qualquer mistura ou perturbação das camadas. Os gradientes podem ser mantidos numa -40 ° C ou -80 ° C congelador durante pelo menos seis meses. </li><li> Se ainda não tiver sido feito, adicionar a última camada de 20% para os gradientes no dia da experiência. Então, deixe-os gradientes descongelar em uma sala fria ou um frigorífico. </li></ol> 2. Preparação de Extratos citossólicos Nota: Nós recomendaçãacabar usando dois gradientes por amostra biológica. 300 mg é a quantidade óptima de material vegetal para preparar dois gradientes quando se trabalha com 6 dias de idade plântulas de Arabidopsis thaliana. Quando se trabalha com tecidos traducionalmente menos activos, a quantidade de material de planta pode ser aumentada até 600 mg. <ol><li> Colheita de seis dias da germinação cultivadas em ½ Murashige e Skoog 8 meio suplementado com 1% de sacarose ou mídia equivalente a-congelação rápida em azoto líquido </li><li> material vegetal moer num almofariz e pilão pré-arrefecida com azoto líquido. </li><li> Pesar 300 mg de material em pó em um prato de pesagem pré-arrefecido. Execute esta etapa rapidamente para evitar o descongelamento da amostra. Nota: Mantenha as amostras congeladas por mais de uma semana em um C congelador -80 °. </li><li> Adicionar 2,4 ml de tampão pré-arrefecida polissoma (Solução Salina 4X, EGTA 5,26 mM, 0,5% (v / v), octilfenoxi poli (etilenoxi) etanol, ramificadas, 50 μg.ml -1 ciclo-heximida, 50 1 μg.mlcloranfenicol) e homogeneizar por mistura com a ponta da pipeta. Transferir 1,5 ml para dois tubos. Trabalhar rapidamente para impedir que as amostras de aquecimento. </li><li> Centrifuga-se a 16000 xg durante 15 min a 4 ° C numa microcentrífuga para sedimentar os detritos. Nota: Para evitar a degradação do RNA, mantenha sempre as amostras a 4 ° C, utilize RNase / DNase soluções livres e trabalhar em RNase / DNase condições livres. A heparina pode ser adicionado ao tampão de polissoma, a uma concentração final de 300 μg.ml -1, para melhorar a protecção de ARN. No entanto, uma vez que a heparina pode interferir com a análise a jusante, que terá de ser removido durante o passo de precipitação de ARN através da realização de precipitação de cloreto de lítio em vez de precipitação com etanol (nota cf. 4.7). </li></ol> 3. polysome Profiling <ol><li> Cuidadosamente pipeta o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Se fragmentos de plantas foram pipetados, repita o passo 2.5. Carregar o sobrenadante no topo do gradiente por pipettin suavementeg para a parede lateral do tubo num fluxo constante. Use um gradiente para cada tubo de 1,5 ml. </li><li> Transferência para o pré-arref ecido baldes e centrifugar a 175.000 xg durante 2 h 45 min a 4 ° C, em uma ultracentrífuga (por exemplo 32.000 rpm ao utilizar um rotor SW41). </li><li> Configurar o sistema de recolha de gradiente, tal como descrito na Figura 1. A cuveta UV tem um percurso de 1 mm. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig1.jpg" /> Figura 1. Sistema de recolha de inclinação. A cuvete de UV está ligado um tubo de cloreto de polivinilo a um tubo capilar de vidro, que desce para o fundo do gradiente. O gradiente progride através do sistema graças a uma bomba peristáltica. OD 260 é continuamente lido e 2 ml frações são coletadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior</a>esta figura. <ol start="4"><li> Ajustar o colector de fracções para a TA, e definir o carrossel, a uma velocidade que permita a recolha de fracções de 2 mL. Use tubos de coleta pré-arrefecido. </li><li> Recolher as fracções de baixo para cima utilizando um tubo capilar de vidro ligada a um tubo de cloreto de polivinilo para o sistema de recolha de gradiente. Usar um filme de parafina de plástico para assegurar a ligação entre o tubo de cloreto de polivinilo e o tubo capilar de vidro. </li><li> Ler a absorvância a 260 nm a partir do fundo para o topo do gradiente. Quando todo o gradiente é recolhido, coloque os tubos de coleta no gelo antes de extração de RNA. </li></ol> 4. Extracção de ARN <ol><li> Reunir as fracções recolhidas a partir de dois gradientes, em 50 ml tapados tubos de centrifugação, como segue: Polissomas: fracções de 1 a 3 (12 ml) Monosomes: valor correspondente a 4 (4 ml) Sobrenadante: fracções 5 e 6 (8 ml) </li><li> Para cada fracção, adicione 1 vol. Hidrocloreto de guanidina 8M,50 ug transportador acrílico e 1,5 vol. isopropanol. Nota: Acryl transportador é acrilamida linear, usado como um co-precipitante para melhorar a recuperação de ácidos nucleicos durante a precipitação com álcool. </li><li> Misturar por inversão dos tubos e precipitar O / N à temperatura de -20 ° C. </li><li> Centrifugar a 175.000 xg durante 1 h a 4 ° C, em uma ultracentrífuga (32.000 rpm num rotor SW32). Se o passo de precipitação é realizada de um tubo, o qual não é compatível com a ultracentrifugação, transferir para um tubo adequado. </li><li> Elimine o sobrenadante e dissolve-se o sedimento em 200 de tampão TE isento de ARNase ul (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5-1 mM de EDTA). Transferir para um novo tubo de 1,5 ml. </li><li> Extrair ARN por adição de 1 vol. fenol saturado de água (pH 6,6) e 1 vol. clorofórmio: álcool isoamílico (24: 1). Misturar energicamente. Centrifuga-se a 15000 xg durante 20 min a 4 ° C. Transferir a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 mL. Nota: ácido fenol (pH 4,5) pode ser utilizado a fim de minimizar a contaminação do ADN. </li><li>Precipitar o ARN por adição de 1/10 vol. M de acetato de sódio 3 e 3 vol. 100% de etanol. Permitir a precipitação a -80 ° C durante 20 min ou O / N à temperatura de -20 ° C. Centrifuga-se a 15000 xg durante 15 min a 4 ° C. Nota: Se estiver usando heparina no tampão polysome (nota cf. 2.5), execute um cloreto de lítio precipitação (LiCl) em vez de precipitação de etanol para remover adequadamente qualquer vestígio de heparina que possa interferir com a análise a jusante 9. Após extracção, adicionar LiCl até uma concentração final de 2,5 M. permitir a precipitação durante 30 minutos à temperatura de -20 ° C ou O / N a 4 ° C. Centrifuga-se a 15000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar o sedimento com 500 ul de etanol a 75%. Ar secar o sedimento e dissolvem-se em 30 ul de tampão TE. Avaliar a qualidade do ARN por electroforese num ARNase livre de 1,2% em gel de agarose (100V, 15 min) ou por métodos de electroforese capilar. </li></ol> Análise 5. Os dados <ol><li> Exportação de dados brutos para um software gráfico e de análise de dados. Nota: Como mostrado na Figura 2A e B, os perfis de matérias dar informação qualitativa: o número de picos polissomas que pode ser visto, a altura do pico monosome, e a presença de um ombro correspondente para as subunidades de ribossomas livres. </li><li> Mesclar perfis para permitir a comparação dos perfis entre as amostras. Utilizar a ferramenta de leitor de tela para determinar o valor de X do pico monosome para cada amostra e alinhar os picos monosome removendo pontos de dados adicionais no início das curvas. Identificar o ponto mais baixo da curva e determinar seu valor Y (utilizando a ferramenta de leitor de tela). Defina o valor mais baixo Y ponto a 0 usando a função &quot;valor definido colunas&quot;. </li><li> Determinar a proporção polissomas / monosomes por integração da área sob a curva de perfis em bruto (Figura 3C). Utilizar a ferramenta selector de dados para definir a fronteira da área a ser integrados. Em seguida, use a função de integrar (Análise-Matemática). </li><li> Normalizaras curvas para o pico monosome dividindo todos os pontos de dados de uma curva pelo valor Y da cimeira do pico monosome (determinado utilizando a ferramenta de leitor de tela). Selecione a coluna, então sob análise em Matemática, selecione Normalize e escolher os &quot;dividido por um valor especificado&quot; métodos. Este passo permite a comparação do nível relativo de polissomas (Figura 3D). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54231/54231fig2.jpg" /> Figura 2. Perfis polissomas representativos. Arabidopsis thaliana de tipo selvagem (wt, ecotipo Col-0) e mudas mutantes foram cultivadas durante seis dias em ½ Murashige e Skoog sob fotoperíodos o dia (luz 16 horas, 8 horas escuro). A: perfis polissomas brutos de mudas wt. B: perfis polissomas brutos de mudas mutantes. C: Determinação da percentagem de polissomas e monosomes por integração da área sob a curva D: profi polissomales normalizados para o pico monosome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54231/54231fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

O protocolo que apresentamos aqui é um método fácil e barato para gerar perfis de polissomos e isolar mRNAs associados a polissomos, ribossomos únicos ou livres de ribossomos. Uma ampla gama de diferentes métodos de fracionamento de polissomos é descrita na literatura. O método que descrevemos aqui foi otimizado para manter apenas os compostos necessários e foi adaptado para material vegetal. Em particular, reduzimos a quantidade de detergente11 e adicionamos cloranfenicol ao tampão para fixar os ribossomos cl...

A síntese de proteínas é um processo essencial e dispendiosa energeticamente em todas as células 1. Em primeiro lugar, as células devem investir energia na produção da maquinaria de tradução, os ribossomas. Por exemplo, uma célula de levedura dividindo ativamente produz tanto quanto 2.000 ribossomas por minuto. Essa produção exige até 60% da actividade de transcrição total e até 90% da actividade total de splicing da célula 2. Além disso, é necessária energia para a síntese de aminoácidos, aminoacil-ARNt e ligações peptídicas. Nas plantas, a adição de um aminoácido a uma cadeia peptídica custos de 4,5 a 5,9 moléculas de ATP 3. Portanto, não é surpreendente que a tradução do mRNA para a proteína é um importante local de regulação, especialmente quando se trata de lidar com a mudança de condições ambientais. A etapa de iniciação da tradução, que é a associação de um mRNA com o ribossoma, é o principal alvo da regulamentação dosTradução 4. Como uma consequência da regulação da tradução, bem como outros passos de regulação pós-transcricional, apenas 40% das variações na concentração de proteína pode ser explicada por ARNm de abundância 5,6. Assim, o estudo de mRNA total fornece relativamente pouca informação sobre a abundância de proteínas. Por outro lado, a associação de mRNA com ribossomos dá melhor visão sobre a abundância de proteínas, dando acesso a esses mRNAs envolvidos na tradução. mRNAs activamente traduzida estão associados com vários ribossomas em estruturas chamadas polissomas. Por outro lado, mRNAs mal traduzidas será associado a apenas um ribossomo (monosome). Por conseguinte, o status translacional de um ARNm pode ser avaliado por monitorização da sua associação com ribossomas 7. Este protocolo descreve o isolamento de polissomas a partir de seis dias de idade plântulas de Arabidopsis thaliana, o subsequente isolamento do ARN e a análise dos resultados. Polysomes monosomes e são separadas através de um gradiente de densidade de sacarose. Gradientes são coletados em seis fracções. Algumas das fracções são reunidas para obter três fracções bem separados: polissomos, monosomes ea fração leve (doravante denominado sobrenadante), que contém os 60 e 40S subunidades ribossomais livres e mRNAs que não estão associados a ribossomas. actividade de tradução global pode ser estimada através da geração de uma relação de polissoma / monosome, que é determinada por integração da área sob a curva, e por comparação dos perfis de polissomas. ARNm e as proteínas são, em seguida, extraiu-se a partir das diferentes fracções e utilizado para análise por RT-PCR, qRT-PCR, Northern blot, microarray, Western blot ou proteómica. Este protocolo foi validado para outras plantas e tecidos. Os equipamentos necessários para realizar este protocolo são comumente encontrados na maioria dos laboratórios: Não há necessidade de uma máquina de inclinação. Congelação cada camada antes de adicionar o próximo prevenirs de qualquer mistura ou perturbação das camadas. Nenhuma perfurador tubo é utilizado para a recolha de inclinação que pode ser obtida por imersão de um tubo capilar de vidro no gradiente. Por conseguinte, os tubos de ultracentrífuga dispendiosos não ficam danificadas e podem ser re-utilizada várias vezes. Coletivamente, isso faz com que o presente protocolo de um método fácil e barato para profiling polysome.

<table><tbody><tr><td>Tubo de ultracentrífuga, parede fina, polialômero - 13,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga, parede fina, polialômero - 38,5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidro</td><td>Ultracentrífuga Drummond Scientific</td><td>1-000-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Rotor Ultracentrífugo <td>Beckman Coulter</td><td>Optima series</td><td></td></tr><tr><td>SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Ultracentrífugo SW32</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubo de cloreto de polivinila Tygon R3607&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>070534-22</td><td>Tubo de cloreto de polivinila, 2,29 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Coletor de frações Modelo 2110</td><td>Bio-Rad</td><td>731-8120</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta UV</td><td>Hellma</td><td>170.700-QS</td><td>Cubeta de quartzo de fluxo</td></tr><tr><td>através Espectrofotômetro UV</td><td>Varian</td><td>Cary50</td><td>Leia a cada 0,0125 seg</td></tr><tr><td>Todos os produtos químicos</td><td>Qualquer</td><td></td><td>uso apenas Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>Murashige e Skoog Mistura de Sal Basal (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de rnase</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>10083251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol, ramificado (Nonidet P40)</td><td>Euromedex</td><td>UN3500</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida linear (transportador de acrílico)</td><td>ThermoFischer scientific</td><td>AM9520</td><td>RNA transportador de precipitação</td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Software de análise</td></tr></tbody></table>

um método fácil para a planta polysome profiling

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

A tradução de mRNA em proteína é um processo biológico fundamental e altamente regulado. O perfil polissômico é considerado um padrão-ouro para a análise da regulação translacional. O método descrito aqui é uma maneira fácil e econômica de fracionar polissomos de vários tecidos vegetais. Um gradiente de sacarose é feito sem a necessidade de um criador de gradiente, congelando sequencialmente cada camada. Os extratos citosólicos são então preparados em um tampão contendo cicloheximida e cloranfenicol para imobilizar os ribossomos citosólicos e cloroplásticos em mRNA e são carregados no gradiente de sacarose. Após a centrifugação, seis frações são coletadas diretamente da parte inferior para a parte superior do gradiente, sem perfurar o tubo de ultracentrifugação. Durante a coleta, a absorbância a 260 nm é lida continuamente para gerar um perfil polissômico que fornece um instantâneo da atividade translacional global. As frações são então agrupadas para preparar três populações diferentes de mRNA: os polissomos, mRNAs ligados a vários ribossomos; os monossomos, mRNAs ligados a um ribossomo; e mRNAs que não estão ligados aos ribossomos. Os mRNAs são então extraídos. Este protocolo foi validado para diferentes plantas e tecidos, incluindo mudas de Arabidopsis thaliana e plantas adultas, folhas de Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum e Oryza sativa.

Na literatura, os perfis de polissomas são mostrados frequentemente a partir da fracção de luz para a fracção pesada como um resultado da forma como os gradientes são recolhidos, ou seja, a partir do topo para o fundo. Uma vez que no protocolo aqui descrito os gradientes são recolhidos a partir da base para o topo, os perfis que mostram começar com a fração pesada (as polissomos) e vá para a fração de luz (subunidades de ribossomas livres e RNAs) (Figura 2A). Em seguida,...

Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Olá, eu sou a Cecile. Trabalho no LGBP em Marselha. O protocolo que vamos descrever neste vídeo é um método simples para isolar polissomos e monossomos de diversos tecidos vegetais, com o objetivo de identificar RNAs mensageiros que estão sendo ativamente traduzidos e estudar a regulação da tradução.Como exemplo, vamos mostrar o isolamento de polissomos de plântulas de Arabidopsis thaliana com seis dias de idade, seguido pelo isolamento de RNA e pela análise dos resultados. Semee as sementes em placa e deixe-as por dois dias a quatro graus. Em seguida, cultive as plantas por seis dias.Colete a plântula e triture-a em nitrogênio líquido. Pese 300 miligramas de pó vegetal e adicione 2,4 mililitro de tampão de polissomos. Centrifugue para coletar os fragmentos vegetais e carregue o sobrenadante no topo de um gradiente de sacarose.Realize um gradiente em ultracentrífuga e, em seguida, colete-o de baixo para cima com leitura contínua da DO. Separe a fração em polissoma, monossoma e fração do sobrenadante e precipite o RNA durante a noite. Realize uma ultracentrifugação, re-suspenda o pellet e extraia o RNA para análises subsequentes. Alguns dias antes de realizar o fracionamento de polissomas, prepare o gradiente de sacarose.Prepare uma solução de sacarose a 50, 35 e 20% e mantenha-as a quatro graus. Despeje a camada de sacarose a 50%. Congele-a em um congelador a menos 40.Após seis horas, adicione a camada de 35% e congele-a durante a noite em um congelador a menos 40. Despeje a primeira camada de 20% e congele-a. No dia do experimento, retire do congelador o número necessário de gradientes.Adicione a última camada de sacarose a 20% e deixe os gradientes descongelarem em uma câmara fria. Prepare a amostra a partir da planta recém-coletada. Aqui, estamos utilizando plântulas de seis dias de Arabidopsis thaliana.Colete as plantas congeladas com nitrogênio líquido e triture-as completamente. Pese 300 miligramas de pó vegetal. Adicione rapidamente 2,4 mililitro de tampão de polissomos fresco e homogeneíze.Pipete a solução em dois tubos de 1,5 mililitro. Centrifugue o extrato citosólico. Pipete o sobrenadante.Tenha cuidado para evitar fragmentos vegetais. Eles comprometeriam o perfil na próxima etapa. Carregue o sobrenadante no gradiente de sacarose sem perturbar o gradiente.Coloque o gradiente em um rotor SW 41. Centrifugue. Para visualizar o perfil de polissomos e coletar a fração, utilizamos um sistema simples composto por um tubo capilar que mergulha no gradiente. Ele está ligado a uma cubeta de UV.Está conectado a uma bomba peristáltica. Um espectrofotômetro UV registra continuamente a DO à medida que o gradiente avança pela cubeta. O coletor de frações permite a coleta de frações de dois mililitros.Limpe a cubeta e coloque-a no espectrofotômetro. Remova o gradiente do balde sem perturbá-lo. Os clorofilas precisam estar concentrados na parte superior do gradiente.Introduza os tubos capilares até o fundo do gradiente. Inicie a bomba peristáltica. O gradiente é coletado de baixo para cima e a DO é lida continuamente.São coletadas frações de dois mililitros. Este é o formato de um perfil clássico. A precipitação de RNA é realizada utilizando cloreto de guanidínio e isopropanol.Primeiro, despeje um volume de guanidina hidroclorida em um tubo de 50 mililitros e, em seguida, adicione a fração. Em seguida, adicione 1,5 volume de isopropanol e 50 microgramas de portador equivalente. Precipite o RNA durante a noite a menos 20 graus.Transfira as frações para tubos de ultracentrífuga de 40 mililitros e equilibre o tubo com isopropanol. Centrifugue. Remova o sobrenadante e seque o pellet ao ar. Re-suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão TE morno.Extraia ainda mais o RNA realizando uma extração clássica com fenol-clorofórmio. Aqui é mostrado um perfil representativo de extrato de polissomos de plântula de Arabidopsis com seis dias de idade. O pico principal corresponde ao monossomo, os mRNA associados a um único ribossomo.A primeira parte do perfil corresponde às frações polissomais, ou seja, ao mRNA associado a muitos ribossomos. Cada pico corresponde à associação de um novo ribossomo ao mRNA. A última parte do perfil corresponde à chamada fração do sobrenadante, que contém os subunidades ribossomais livres e o RNA.Uma grande quantidade de subunidade 60S forma um ombro ao lado do pico do monossomo. Para avaliar sua integridade, os RNAs extraídos das frações podem ser submetidos a uma eletroforese em gel de agarose clássico antes de serem utilizados em experimentos adicionais. Utilizamos este protocolo para isolar polissomos de plântulas de Arabidopsis thaliana, bem como de rosetas jovens e velhas, e também de folhas de Nicotiana benthamiana, tomate e arroz, de modo que ele deve funcionar com uma ampla variedade de plantas e tecidos.Os RNAs purificados são compatíveis com análise em microarranjos, bem como com a identificação de RNAs pequenos associados a frações polissomais.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

A capacidade das células de se adaptarem ao estresse é crucial para sua sobrevivência. A regulação da tradução do mRNA é uma dessas estratégias de adaptação, proporcionando uma regulação rápida do proteoma. Aqui, fornecemos um protocolo padronizado de perfil de polissoma para identificar mRNAs específicos que são traduzidos seletivamente sob condições de estresse.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Traduzir purificação de afinidade costela (TRAP) oferece a possibilidade de dissecar programas de desenvolvimento com processamento mínimo de órgãos e tecidos. O protocolo produz RNA de alta qualidade a partir de células direcionadas com uma subunidade ribossômica rotulada como proteína fluorescente verde (GFP). Ferramentas de análise a jusante, como qRT-PCR ou RNA-seq, revelam perfis de expressão específicos de tecido e célula.

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

Este protocolo descreve um método de purificação de pórsome eucariótico a partir de nódulos de soja intactos. Após o sequenciamento, os dutos padrão para análise de expressão genética podem ser usados para identificar genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e translatome.

Purificação polissóbica de nódulos simbióticos de soja

O protocolo aqui apresentado envolve o perfil polissômico para isolar translatome, mRNAs associados a ribossomos, em RNAs não polissomais e polissomais de Arabidopsis por meio de centrifugação por gradiente de densidade de sacarose. Este método demonstra a eficiência de tradução de Arabidopsis estressada pelo calor.

Teste de eficiência de tradução usando perfis polissômicos sob estresse térmico

Aprenda a isolar polissomos e monossomos de tecidos vegetais usando Arabidopsis thaliana. Este método permite identificar mRNAs ativamente traduzidos e estudar a regulação da tradução em plantas de forma confiável.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

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