Um método fácil para a planta polysome Profiling

Olá, sou Cecile. Eu trabalho no LGBP em Marselha. O protocolo que vamos descrever neste vídeo é um método simples para isolar polissomas e monossomas de vários tecidos vegetais, a fim de identificar mRNAs que são traduzidos ativamente e estudar a regulação da tradução.

Como exemplo, vamos mostrar o isolamento de polissomos de mudas de Arabidopsis thaliana com seis dias de idade, posterior isolamento de RNA e a análise dos resultados. Semeie as sementes no prato e deixe-as dois dias a quatro graus. Em seguida, cultive as plantas durante seis dias.

Colha as mudas e triture-as em nitrogênio líquido. Pese 300 miligramas de pó vegetal e adicione 2,4 mililitros de tampão polissômico. Centrifugue para coletar fragmentos de plantas e carregar o sobrenadante no topo de um gradiente de sacarose.

gradiente de ultracentrífuga então colete-o de baixo para cima com leitura contínua do OD. Puxe a fração para um polissomo, um monossomo e uma fração sobrenadante e precipite o RNA durante a noite. Ultracentrifugar, ressuspender o pellet e extrair o RNA para análise posterior. Alguns dias antes de realizar o perfil de polissomos, prepare o gradiente de sacarose.

Prepare a solução de sacarose a 50, 35 e 20% e mantenha-as a quatro graus. Despeje a camada de 50% de sacarose. Congele-o em um freezer de menos 40.

Após seis horas, adicione a camada de 35% e congele em um freezer de menos 40 durante a noite. Despeje a primeira camada de 20% e congele. No dia do experimento, remova o número necessário de gradientes do freezer.

Adicione a última camada de 20% de sacarose e deixe os gradientes descongelarem em uma câmara fria. Prepare a amostra que acabamos de coletar planta. Aqui, estamos usando mudas de Arabidopsis thaliana com seis dias de idade.

Colha as plantas congeladas com nitrogênio líquido e triture-as bem. Peso 300 miligramas de pó vegetal. Adicione rapidamente 2,4 mililitros de tampão polissômico fresco e homogeneize.

Pipete a solução em dois tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar o extracto citosólico. Pipetar o sobrenadante.

Tenha cuidado para evitar fragmentos de plantas. Eles estragariam o perfil na próxima etapa. Carregar o sobrenadante no gradiente de sacarose sem perturbar o gradiente.

Coloque o gradiente em uma caçamba de rotor SW 41. Centrifuga. Para visualizar o perfil do polissoma e recolher a fração, utilizamos um sistema simples constituído por um tubo capilar que mergulha no gradiente. Está ligado a uma cubeta UV.

É auto-conectado a uma bomba peristáltica. Um espectrofotômetro UV registra continuamente o OD à medida que o gradiente progride através da cubeta. O coletor de frações permite a coleta de frações de dois mililitros.

Limpe a cubeta e coloque-a no espectrofotômetro. Remova o gradiente do balde sem perturbá-lo. As clorofilas devem ser concentradas no topo do gradiente.

Mergulhe os tubos capilares até o fundo do gradiente. Ligue a bomba peristáltica. O gradiente é coletado de baixo para cima e o OD é lido continuamente.

Duas frações de mililitros são coletadas. Aqui está a forma de um perfil clássico. A precipitação do RNA é realizada usando cloridrato de guanidínio e isopropanol.

Primeiro, despeje um volume de cloridrato de guanidínio em um tubo de 50 mililitros e adicione a fração. Em seguida, adicione 1,5 volume de isopropanol e 50 microgramas de correio igual. Precipite o RNA durante a noite a menos 20 graus.

Transferir as fracções para tubos de ultracentrífuga de 40 mililitros e equilibrar o tubo com isopropanol. Centrifuga. Remova o sobrenadante e seque o pellet ao ar. Ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão TE quente.

Extraia ainda mais o RNA realizando uma extração clássica de fenol clorofórmio. Um perfil representativo do extrato de polissomos de Arabidopsis com seis dias de idade é mostrado aqui. O pico principal corresponde ao monossoma, o mRNA que está associado a um único ribossomo.

A primeira parte do perfil corresponde às frações polissomais, ou seja, o mRNA associado a muitos ribossomos. Cada pico corresponde à associação do novo ribossomo ao mRNA. A última parte do perfil corresponde à chamada fração sobrenadante que contém as subunidades ribossômicas livres e o RNA.

Grande quantidade de subunidade 60S forma um ombro próximo ao pico do monossoma. Para avaliar sua integridade, os RNAs extraídos das frações podem ser executados em um gel de Aragose clássico antes de serem usados para experimentos posteriores. Usamos este protocolo para isolar polissomos de mudas de Arabidopsis thaliana, mas também de rosetas jovens e velhas, bem como de Nicotiana benthamiana, tomate e folhas de arroz, por isso deve funcionar com uma ampla variedade de plantas e tecidos.

Os RNAs purificados são compatíveis com a análise de micro array, bem como para a identificação de pequenos RNAs associados a frações polissomais.