Um método fácil para a planta polysome Profiling
28 de agosto de 2016
Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.
Olá, eu sou a Cecile. Trabalho no LGBP em Marselha. O protocolo que vamos descrever neste vídeo é um método simples para isolar polissomos e monossomos de diversos tecidos vegetais, com o objetivo de identificar RNAs mensageiros que estão sendo ativamente traduzidos e estudar a regulação da tradução.
Como exemplo, vamos mostrar o isolamento de polissomos de plântulas de Arabidopsis thaliana com seis dias de idade, seguido pelo isolamento de RNA e pela análise dos resultados. Semee as sementes em placa e deixe-as por dois dias a quatro graus. Em seguida, cultive as plantas por seis dias.
Colete a plântula e triture-a em nitrogênio líquido. Pese 300 miligramas de pó vegetal e adicione 2,4 mililitro de tampão de polissomos. Centrifugue para coletar os fragmentos vegetais e carregue o sobrenadante no topo de um gradiente de sacarose.
Realize um gradiente em ultracentrífuga e, em seguida, colete-o de baixo para cima com leitura contínua da DO. Separe a fração em polissoma, monossoma e fração do sobrenadante e precipite o RNA durante a noite. Realize uma ultracentrifugação, re-suspenda o pellet e extraia o RNA para análises subsequentes. Alguns dias antes de realizar o fracionamento de polissomas, prepare o gradiente de sacarose.
Prepare uma solução de sacarose a 50, 35 e 20% e mantenha-as a quatro graus. Despeje a camada de sacarose a 50%. Congele-a em um congelador a menos 40.
Após seis horas, adicione a camada de 35% e congele-a durante a noite em um congelador a menos 40. Despeje a primeira camada de 20% e congele-a. No dia do experimento, retire do congelador o número necessário de gradientes.
Adicione a última camada de sacarose a 20% e deixe os gradientes descongelarem em uma câmara fria. Prepare a amostra a partir da planta recém-coletada. Aqui, estamos utilizando plântulas de seis dias de Arabidopsis thaliana.
Colete as plantas congeladas com nitrogênio líquido e triture-as completamente. Pese 300 miligramas de pó vegetal. Adicione rapidamente 2,4 mililitro de tampão de polissomos fresco e homogeneíze.
Pipete a solução em dois tubos de 1,5 mililitro. Centrifugue o extrato citosólico. Pipete o sobrenadante.
Tenha cuidado para evitar fragmentos vegetais. Eles comprometeriam o perfil na próxima etapa. Carregue o sobrenadante no gradiente de sacarose sem perturbar o gradiente.
Coloque o gradiente em um rotor SW 41. Centrifugue. Para visualizar o perfil de polissomos e coletar a fração, utilizamos um sistema simples composto por um tubo capilar que mergulha no gradiente. Ele está ligado a uma cubeta de UV.
Está conectado a uma bomba peristáltica. Um espectrofotômetro UV registra continuamente a DO à medida que o gradiente avança pela cubeta. O coletor de frações permite a coleta de frações de dois mililitros.
Limpe a cubeta e coloque-a no espectrofotômetro. Remova o gradiente do balde sem perturbá-lo. Os clorofilas precisam estar concentrados na parte superior do gradiente.
Introduza os tubos capilares até o fundo do gradiente. Inicie a bomba peristáltica. O gradiente é coletado de baixo para cima e a DO é lida continuamente.
São coletadas frações de dois mililitros. Este é o formato de um perfil clássico. A precipitação de RNA é realizada utilizando cloreto de guanidínio e isopropanol.
Primeiro, despeje um volume de guanidina hidroclorida em um tubo de 50 mililitros e, em seguida, adicione a fração. Em seguida, adicione 1,5 volume de isopropanol e 50 microgramas de portador equivalente. Precipite o RNA durante a noite a menos 20 graus.
Transfira as frações para tubos de ultracentrífuga de 40 mililitros e equilibre o tubo com isopropanol. Centrifugue. Remova o sobrenadante e seque o pellet ao ar. Re-suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão TE morno.
Extraia ainda mais o RNA realizando uma extração clássica com fenol-clorofórmio. Aqui é mostrado um perfil representativo de extrato de polissomos de plântula de Arabidopsis com seis dias de idade. O pico principal corresponde ao monossomo, os mRNA associados a um único ribossomo.
A primeira parte do perfil corresponde às frações polissomais, ou seja, ao mRNA associado a muitos ribossomos. Cada pico corresponde à associação de um novo ribossomo ao mRNA. A última parte do perfil corresponde à chamada fração do sobrenadante, que contém os subunidades ribossomais livres e o RNA.
Uma grande quantidade de subunidade 60S forma um ombro ao lado do pico do monossomo. Para avaliar sua integridade, os RNAs extraídos das frações podem ser submetidos a uma eletroforese em gel de agarose clássico antes de serem utilizados em experimentos adicionais. Utilizamos este protocolo para isolar polissomos de plântulas de Arabidopsis thaliana, bem como de rosetas jovens e velhas, e também de folhas de Nicotiana benthamiana, tomate e arroz, de modo que ele deve funcionar com uma ampla variedade de plantas e tecidos.
Os RNAs purificados são compatíveis com análise em microarranjos, bem como com a identificação de RNAs pequenos associados a frações polissomais.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método simples para isolar polissomos e monossomos de tecidos vegetais, permitindo a identificação de RNAs mensageiros ativamente traduzidos e o estudo da regulação da tradução. O exemplo fornecido concentra-se na isolção de polissomos de plântulas de Arabidopsis thaliana com seis dias de idade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Regulação da tradução
- Análise de mRNA
Contexto
- Compreender a atividade de tradução é essencial para estudar a expressão gênica.
- Polissomos são aglomerados de ribossomos que traduzem mRNA, enquanto monossomos são ribossomos individuais.
- Este método fornece informações sobre o estado traducional de mRNAs específicos.
- Arabidopsis thaliana serve como organismo modelo na pesquisa vegetal.
Objetivo do Estudo
- Isolar polissomos e monossomos de tecidos vegetais.
- Identificar RNAs mensageiros que estão sendo ativamente traduzidos.
- Estudar a regulação da tradução em plantas.
Métodos Utilizados
- Plantar sementes em placas e realizar estratificação a frio por dois dias.
- Crescer plântulas por seis dias em condições ideais.
- Isolar polissomos e monossomos dos tecidos vegetais.
- Analisar o RNA para determinar a atividade de tradução.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de polissomos de plântulas de Arabidopsis thaliana.
- Identificação de RNAs mensageiros ativamente traduzidos.
- Compreensão da regulação da tradução em tecidos vegetais.
- Demonstração da eficácia do método para o estudo da tradução.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para estudar a tradução em plantas.
- Ele aprimora a compreensão da regulação da expressão gênica.
- A abordagem pode ser aplicada a diversas espécies vegetais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O perfilamento de polissomos fornece uma imagem direta da atividade traducional, permitindo a redução mecanicista de riscos em hipóteses de alvos na descoberta de biofármacos baseados em plantas. Ao distinguir pools de mRNA ativamente traduzidos, o método apoia a validação de alvos e a triagem fenotípica em sistemas relevantes para a agricultura. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva ao priorizar candidatos para melhoramento de culturas ou aplicações em agricultura molecular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas ao associar a abundância de mRNA à produção traducional.
- Valor Operacional: Esclarece a atividade da via por meio de métricas de engajamento de ribossomos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar alvos com engajamento traducional sustentado.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em plataformas de expressão vegetal.
- Valor Operacional: Permite a padronização de ensaios por meio do perfil quantitativo de OD260 e reprodutibilidade de frações.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em tecidos de Arabidopsis, Nicotiana, tomate e arroz.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a validação de alvos na fase de descoberta à avaliação de biomarcadores pré-clínicos em sistemas vegetais.
- Redução de Riscos Mecanística: Foca no valor preditivo ao isolar populações de mRNA definidas pela carga de ribossomos.
- Sistema Relevante para Doenças: Aplicável a modelos de culturas utilizados na agricultura molecular e na produção de biofármacos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, apoiando a verificação de hipóteses antes da identificação de compostos líderes e permitindo continuidade translacional para avaliação pré-clínica em sistemas à base de plantas.
- Biologia da Descoberta: Testa o engajamento do alvo medindo alterações nas razões polissoma/monossoma sob condições experimentais.
- Triagem: Fornece leituras de perfilagem de ribossomos que ajudam a comparar os efeitos de compostos ou perturbações genéticas.
- Análises: Gera traçados quantitativos de OD260 e rendimentos de RNA fracionado para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se à descoberta de biomarcadores em pipelines de agricultura molecular de plantas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de fracionamento aplicável a diversos tecidos e espécies vegetais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao resolver os estados traducionais de RNAs mensageiros-alvo.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da fracionação padronizada em gradiente de sacarose e monitoramento contínuo de DO.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer evidência direta da modulação do alvo no nível traducional.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em dados de atividade traducional.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecidos vegetais e na preparação de tampão de polissomos.
- Depende de equipamentos de ultracentrifugação e sistemas de coleta de frações com monitoramento por UV.
- Necessita de padronização entre equipes para protocolos de preparação de gradientes e agrupamento de frações.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a sistemas vegetais não modelo.
- Envolve limitações práticas relacionadas à integridade do RNA durante as etapas de fracionamento e extração.
