מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא למדוד פגוציטוזיס גרנולוציטים ומונוציטים ופעילות פרץ חמצוני בדם מלא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד התערבות תזונתית מסוימת משפיעה על התגובה החיסונית לפעילות גופנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בבדיקה פשוטה ופשוטה הניתנת לשינוי בקלות כדי לקחת בחשבון את משאבי המעבדה הזמינים ותחומי המחקר.

בשני העשורים האחרונים השתמשנו במדד זה של תפקוד חיסוני מולד ברבים מניסויי הפעילות הגופנית שלנו, ונשתף חלק מהנתונים הללו בהמשך הסרטון. לפני תחילת ההליך, השתמש במנתח המטולוגי כדי לבצע ספירת דם מלאה עם ניתוח דיפרנציאלי של תאי דם לבנים על דגימות הדם בהתאם להוראות היצרן. רשום את ספירת תאי הדם הלבנים בתאים למיליליטר ואת אחוז ערכי הנויטרופילים והמונוציטים עבור הדגימות.

לאחר מכן, עבור כל צינור ניסוי ובקרה, השתמש בקצה פיפטה באורך מורחב כדי להעביר 100 מיקרוליטר מכל דגימת דם מלאה מצינור איסוף הדם ליתיום הפרין לתחתית צינור 12 על 75 מילימטר המסומן כראוי. לאחר שכל הדם הועבר, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת העבודה HE לצינורות המסומנים בדיו אדום ו-H, כולל צינור הבקרה HE. פתח את המכסה של הצינורות.

מערבל את הדגימות לזמן קצר, ומעביר את הצינורות לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במדף מתכת פתוח עם ניעור עדין כל חמש דקות. לאחר 15 דקות, העבירו במהירות את המתלה והצינורות לאמבט מי קרח למשך 12 דקות עם ניעור עדין כל חמש דקות. בתום הדגירה, הוסף את הנפח המתאים של תמיסת עבודה S.aureus ללא תווית לצינורות המסומנים בדיו האדום ו-H, כולל צינור הבקרה HE.

מערבל את הצינורות לזמן קצר עם הכובעים. לאחר מכן הוסף את הנפח המתאים של תמיסת העבודה S.aureus המסומנת ב-FITC לצינורות המסומנים בדיו שחור ו-F, כולל צינור הבקרה של FITC, ומערבל בקצרה את הדגימות. לאחר מכן, דגרו את כל הצינורות באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם ניעור כל חמש דקות ואחריו התקררות של דקה במי הקרח.

לאחר הנחת הדגימות בטמפרטורת החדר, השתמש בפיפטה משחזרת כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת מרווה קרה כקרח לכל הצינורות ולמערבל את הדגימות. החזירו את הדגימות לאמבטיית הקרח. לאחר דקה אחת, השתמש בפיפטה המשחזרת כדי להוסיף מילימטר אחד של PBS קר כקרח לכל אחד מהצינורות.

לאחר מכן מערבל את הצינורות והוסף שני מיליליטר נוספים של PBS לדגימות. עכשיו צנטריפוגה את התאים ושואפים את הסופרנטנט. בעזרת פיפטת המשחזר, הוסף 50 מיקרוליטר FBS קר כקרח לצינורות.

לאחר מערבולת, העבירו את כל הצינורות לקרוסלה. השתמש בתחנת עבודה אוטומטית להכנת ליזה של תאים כדי לליז את כדוריות הדם האדומות ולתקן את תאי הדם הלבנים בהתאם להוראות היצרן. כדי לנתח את תוצאות הבדיקה על ידי ציטומטריית זרימה, פתח את תוכנת רכישת מערכת ציטומטריית הזרימה וצור פרוטוקול חדש.

בחר FITC עבור פרמטר FL1 עבור בדיקת הפגוציטוזיס ו-HE עבור פרמטר FL2 עבור בדיקת פעילות פרץ חמצוני. צור תרשים נקודות פיזור קדימה לעומת צד, היסטוגרמה FL1 והיסטוגרמה FL2. לאחר מכן צור אזורים מצולעים עבור אוכלוסיות תאי הדם הלבנים, הגרנולוציטים והמונוציטים בעלילת הפיזור קדימה לעומת הצד וצור אזורים ליניאריים בהיסטוגרמות.

כעת הפעל את דגימת הבקרה השלילית לדם בלבד ואחריה דגימות הבקרה החיוביות של HE ו-FITC, סקירת ההיסטוגרמות והתאמת מתחי צינור מכפיל הפוטו של תעלות FITC ו-PE לפי הצורך. לאחר מכן התחל ברכישת הנתונים עבור דגימות הבקרה. לאחר תקופת שיווי משקל של 15 דקות, טען את דגימות הניסוי לקרוסלה לפי הסדר ברשימת העבודה ולפי ניתוח מדגם המחקר.

כדי להעריך את הפעילות הפגוציטית של הדגימות, תחילה אחד את כל הדגימות עם תווית F וקבצי הנתונים של מצב רשימת הבקרה לתיקיה אחת וגרור את הקבצים לחלל הדגימה בתוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה. לחץ פעמיים על דגימת בקרה והשתמש בבורר שער המצולע כדי להגדיר שער עבור אוכלוסיית תאי הדם הלבנים הכוללת, תוך הקפדה לכלול את כל התאים בקצוות התרשים. סמן את השער הזה WBC.

לחץ פעמיים על שער WBC והשתמש בבורר השער האליפטי כדי להגדיר את שער הלימפוציטים. סמן את השער בהתאם וגרור את אחוז נתוני השער הצידה כך שהתאים יוצגו בקלות. לאחר מכן השתמש בבורר שער המצולע כדי להגדיר את שער הגרנולוציטים ושער המונוציטים.

סמן כל שער בהתאם וגרור את אחוז נתוני השער הצידה. לחץ פעמיים על דגימת הבקרה של FITC ואחריה שער הגרנולוציטים והשתמש בתפריטים הנפתחים כדי להגדיר את ציר ה-X ל-FL1 ואת ציר ה-Y לפיזור צדדי, או SS. השתמש בבורר השער המרובע כדי להגדיר שער שלילי של פגוציטוזיס ושער חיובי של פגוציטוזיס. הדגש את השער החיובי של פגוציטוזיס של אוכלוסיית הגרנולוציטים.

לאחר מכן לחץ על סביבת עבודה והוסף סטטיסטיקה. הדגש ממוצע גיאומטרי ו-FL1 כדי ליצור את עוצמת הקרינה של הגרנולוציטים החיוביים של פגוציטוזיס ולחץ על הוסף. לאחר מכן בחר את תדירות סטטיסטיקת האב ולחץ על הוסף כדי ליצור את אחוז הגרנולוציטים החיוביים לפגוציטוזיס.

כדי להחיל הגדרות אלה על כל דגימות המחקר, סמן את כל השערים והסטטיסטיקות שנוצרו במדגם הבקרה של FITC, וגרור אותם לאזור כל הדגימות בלוח הקבוצתי. שמור את העבודה כקובץ WSP באותה תיקיה המכילה את תיקיית הנתונים של מצב הרשימה. כעת לחץ על הדגימה הניסיונית הראשונה במערך הנתונים ואשר ששער תאי הדם הלבנים מתאים כראוי להתפלגות התאים בכל אחת מהדגימות, תוך התאמת קצוות השער לפי הצורך.

כעת לחץ על שער תאי הדם הלבנים בדגימת הניסוי הראשונה ואשר כי שערי הגרנולוציטים, המונוציטים והלימפוציטים מתאימים להתפלגות התאים בכל אחת מהדגימות, תוך התאמת השערים לפי הצורך. לאחר שמירת הקובץ, לחץ על סמל עורך הטבלאות וגרור כל סטטיסטיקה מעניינת לטבלה. לחץ על צור טבלה כדי להציג את הנתונים בתבנית גיליון אלקטרוני ולשמור את העבודה כקובץ XLSX.

לאחר מכן חזור על הניתוח עבור דגימות פעילות פרץ חמצוני עם תווית H וקבצי נתונים של מצב רשימת בקרה כפי שהודגם זה עתה. כפי שהודגם בניסוי מייצג זה, הפגוציטוזיס בתיווך גרנולוציטים של S.aureus מוגבר מיד ו-1.5 שעות לאחר סיבוב רכיבה של 75 קילומטרים, וחוזר לקדמותו למחרת בבוקר. פעילות פרץ חמצוני גרנולוציטים פוחתת לפחות 21 שעות לאחר רמת פעילות זו.

יתר על כן, קיים מתאם צנוע בין פגוציטוזיס גרנולוציטים לרמות חלבון מגיב C בסרום, כפי שנצפה בניתוח זה של 106 נשים הסובלות מעודף משקל או השמנת יתר, מה שמצביע על כך שפגוציטוזיס גבוה של גרנולוציטים ומונוציטים בנבדקים במנוחה עשוי להעיד על דלקת מערכתית. לאחר השליטה, ניתן להשלים טכניקה זו עבור כ-30 דגימות בשבע שעות אם מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לקרר לחלוטין את הדגימות לפני הוספת החיידקים כדי לעזור למזער כל שונות בלתי מוסברת בין הדגימות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו כימות ציטוקינים, כדי לקבוע את השפעת ההתערבות שלך על התגובה הדלקתית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את ההשפעות של מגוון שינויים באורח החיים ותפקוד חיסוני מולד בבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד פגוציטוזיס גרנולוציטים ומונוציטים ופעילות פרץ חמצוני באמצעות ציטומטר זרימה.

אל תשכח שעבודה עם דם אנושי עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ה-PPE המתאים, בעת ביצוע הליך זה.