Name: טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: למדו להעריך פונקציית גרנולוציטים באמצעות ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה. שיטה זו מאפשרת זיהוי של שלוש תת-אוכלוסיות שונות של גרנולוציטים מופעלים ומסייעת בחקר תפקוד המערכת החיסונית במחקר קליני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר הנוכחי מומן בחלקו על ידי מענק ייזום מחקר (RIG) מאוניברסיטת צפון טקסס לד"ר מקפרלין. המחברים לא קיבלו מימון ישיר להשלמת מחקר זה ולא דיווחו על ניגוד עניינים.

הערה: כל נהלי איסוף דם מתוארים בשיטה זו נערכו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי המועצה לביקורת המוסדית UNT (IRB) לבני אדם. כל הנבדקים נתנו הסכמה בכתב לאיסוף דם, אשר היה בשימוש בשיטה הנוכחית כדי להבטיח שהם היו בריאים לכאורה, של משקל גוף תקין, וללא מחלה. 1. מגיב מקור והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש CD66b-APC (# G10F5 שיבוט; DF = 1: 50) וCD45-APCeFluor780 (שיבוט # 2D1; DF = 1: 50) עבור assay זה. הערה: לפני המחקר, נוגדני CD45 וCD66b היו titered כדי לקבוע את הדילול האופטימלי שגרנולוציטים בבירור נפתרו (+ CD45 + / 66b) מכדוריות דם לבנות אחרים (CD45 + / 66b-) 11. על התוספת של הנוגדן המדולל למכתימים את הדילול הסופי בצינור היה 875. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ולהפשיר מניית S. aureus bioparticles שכותרתו עם צבע אדום pHrodo. להשעות בריכוז של 1 מ 'גרם של bioparticles לכל מיליליטר ב PBS סטרילי. bioparticles לדלל aliquot וחנות קפוא ב -20 ° C עד בשימוש assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dihydroethidium (DHE), אשר מומר ברומיד ethidium ניאון בנוכחותם של רדיקלים חופשיים של חמצן (כלומר, פרץ חמצוני), בDMSO לריכוז סופי של 10 g / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים N-ethylmaleimide (המשמש למניעת phagocytosis נוסף הבא משך הדגירה assay צוין) עם PBS סטרילי בדילול 2 צעד של 200 מ"ג / מיליליטר ו -17.5 מ"ג / מיליליטר בהתאמה. בassay, להשתמש ריכוז סופי של 15 מ"מ. כאשר מפשיר N-ethylmaleimide, להשתמש גוש חום 37 מעלות צלזיוס, כמו N-ethylmaleimide לא יישאר בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב הקיבוע הסופי, להשתמש 7AAD להכתים DNA הגרעיני. לפני בנוסף, לדלל 7AAD מניית 1:10 עם PBS סטרילי. </li></ol> אוסף דוגמאות 2. דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאל נושאים להגיע למעבדה הבאה O / N (&gt; 8hr) המהיר וabstentiמפעילות גופנית (&gt; 12 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניקוי העור עם כרית הכנת אלכוהול, להכניס מחט סטרילית איסוף דם לוריד זרוע היקפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם לתוך צינורות פונו כי הם מלאים באופן מסחרי עם הפרין סודיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף, להחיל תחבושת דבק לזרועו של הנושא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך צינורות דם לערבב 10 פעמים ולאחר מכן למקם על כיסא נדנדה עד לניתוח. </li></ol> טכניקת 3. phagocytosis Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> bioparticles ההפשרה S.aureus (RT), DHE (RT), ו- N-ethylmaleimide (37 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 L של bioparticles S.aureus 4 1.2 מיליליטר צינורות בודדים בעת שעבדה בשכונה סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 L של DHE לכל צינור המכיל את bioparticles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את הצינורות על משטח הספסל כדי לאסוף את חומרים כימיים בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של כל דם מעורב 100 L על צינור אחד שכבר מלא בbioparticles וDHE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">נגב את הקצה הפנימי של הצינורות עם המוליך כותנה שקצהו כדי להסיר כל דם מזהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הדם וחומרים כימיים עם pipet אלקטרוני להגדיר לערבב את הדם וחומרים כימיים לשלושה מחזורים לאחר תוספת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות assay בדלי קרח ולכסות כדי להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות assay 10, 20, ו -40 דקות. התחל עם צינור 40-דקות כדי להבטיח את כל צינורות assay לסיים באותו הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה N-ethylmaleimide באמבטיה חרוז 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 15 L של N-ethylmaleimide (שתואר לעיל ב1.4) לתוך צינור אחד assay, דגירה במשך 30 דקות-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 10 L של CD66b-APC ו -10 L של CD45-APCeFluor780 נוגדנים מדוללים (שתוארו לעיל בסעיף 1.1), דגירה של 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 750 L של תיקון פתרון lyse / RBC WBC לתוך צינור אחד assay, דגירה של 60-דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (10 דקות ב 400 XG) צינורות assay כדי לאסוף את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבק לשאוב את פתרון lyse WBC / תיקון RBC, עוזב fl שיירנפח uid (100 ליטר) מעל התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 10 L של פתרון המדולל 7AAD (שתואר לעיל ב 1.5) ו -50 ליטר של PBS לתוך צינור אחד assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של חרוזים כיול (~ 25 L) על צינור אחד assay, כובעי מקום בצינורות assay, צינורות לעטוף בנייר כסף, ומכניס למקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צינור המדגם לתוך הזרם מבוסס תמונת cytometer ולאסוף מינימום של 3,000 אירועי granulocyte באמצעות פרמטרים שהוגדרו מראש: autosampler, הכחול (ננומטר 488; 60 mW), אדום (640 ננומטר; 100 NW), SSC (ננומטר 785; 8.5 לייזרי mW) (איור 1). </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg"> איור 1. רכישת שיטה ותבנית. דוגמאות נרכשו על זרימה מבוססת תמונה cytometer (). במהלך רכישה, מגרשי נקודה של יחס ממדים מואר שדה לעומת CD66b-APC נוצרו לגרנולוציטים הופרדו מחרוזי כיול ממוסמר using INSPIRE v. 100.2.292.0 תוכנה (B). מינימום של 5,000 גרנולוציטים נרכש עבור כל דגימות באמצעות autosampler, כחולה (488 ננומטר; 60 mW), אדום (640 ננומטר; 100 NW), SSC (785 ננומטר; 8.5 mW) לייזרים. אנא שים לב כי מספר היסטוגרמות נמצא במהלך הרכישה לפקח הגדרות לייזר והיבטים אחרים של נתונים לאסוף. כל היסטוגרמות אלה הם אופציונליים ונחוצים רק אם נהלי עבודה במעבדה מחייבים אותם כבקרת איכות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 4. לדוגמא רכישה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באשף פיצוי תוכנה האוטומטי של תוכנת הרעיונות ליישם מטריצת פיצויים לקבצי גלם תמונה (RIF) וליצור לפצות קבצי הדמיה (CIF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון קבצי CIF בודדים בתוכנת רעיונות וליצור החלקות הבאות כדי לזהות את תת granulocyte: </li> הקמת שערים ראשוניים לזהות תאים שנחשבו להיות בפוקוס באמצעות היסטוגרמה לRMS הבהיר שיפוע שדה (איור 2 א). לקבוע זאת עבור כל דגימת מטופל באמצעות שליטת unstimulated כסטנדרט התייחסות. <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במגרשים משניים לתאי גופייה נפרדים מפסולת וכפילויות באמצעות עלילת נקודה של יחס בהיר היבט שדה (יחס בין גובה תא לעומת רוחב) לעומת אזור שדה הבהיר (איור 2). לקבוע זאת עבור כל דגימת מטופל באמצעות שליטת unstimulated כסטנדרט התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאוכלוסייה נקייה של תאים שזוהתה, להקים עלילת נקודה של CD45 לעומת CD66b (איור 2 ג) כדי לזהות באופן חיובי גרנולוציטים (+ CD45 + / 66b). צור עלילת בת (איור 3) בעוצמה פירוט בהירה לS. aureus (ציר x) לעומת עוצמת פירוט בהירה לפרץ חמצוני (DHE, ציר y) לזהות תת קבוצות של גרנולוציטים הופעלו. לאסוף brתמונות שדה ight בערוץ 1 ו -9, bioparticles בערוץ 2, בערוץ 4 DHE, 7AAD בערוץ 5, CD66b בערוץ 11, וCD45 בערוץ 12. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg"> איור 2. ניתוח תבנית. נתון זה הסדרה של מגרשים שנוצרו כדי לזהות תאים שהיו בפוקוס (), תאים בודדים (B), גרנולוציטים (C). חלקות נוספות המשמשות לזיהוי שלוש תת קבוצות של גרנולוציטים הופעלו נגד גרנולוציטים לא פעילים. כל הניתוח של קבצי תמונה שנרכשו הושלם באמצעות תוכנת v.6 רעיונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol><li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li>
<li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li>
<li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis%2C+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li>
<li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Hematol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li>
<li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li>
<li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-year+school-based+diet%2Fexercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children%5BTitle%5D)+AND+%22Matern.+Child+Nutr%22%5BJournal%5D)">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li>
<li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate-intensity%2C+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Physiol.+Nutr.+Metab%22%5BJournal%5D)">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li>
<li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise%3A+implications+for+infection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li>
<li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li>
<li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li>
<li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis%3A+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatology%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold%2FFlu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diet.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה הנוכחית מייצגת עידון של שיטות קיימות להערכת תפקוד granulocyte באמצעות זרימת cytometry 1,3,4,12-14. השלבים הקריטיים של assay זה נוטים להיות קשור לערבוב נכון של דגימת הדם עם bioparticles וDHE. ערבוב שלם יביא לתוצאות לא מדויקות. בעוד ערבוב מלא הוא קריטי, שיטת הערבוב צריכה להיות עדינה בטבע. הוא הציע כי הערבוב להתבצע באמצעות pipet אלקטרוני עם פונקצית ערבוב ולא מיקסר מערבולת. עוד צעד קריטי בassay הוא תמיד כדי להבטיח שאין דם מזהם את חיצו העליון של צינור assay. דם שיורית זו ניתן להסיר באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי. הסרה מלאה היא חשובה משום שכישלון לעשות זאת עלולה לזהם את הכנת assay הסופית עם תאי דם אדום-lysed un. לפני השימוש בשיטה זו בקרות פיצוי הולמות יש להוסיף לשלוט על spחפיפה בין ectral חומרים כימיים המשמשים לזיהוי ההיבטים השונים של תפקוד granulocyte. לשיטה זו, בקרות פיצוי כרוכות לאסוף דגימות דם שהוצעו הדגירה assay 40 דקות ולאחר מכן תיוג עם סמן יחיד (כלומר, E. coli, DHE, וכו &#39;). לאחר תיוג, אירועים חיוביים יחידים נאספים ומטריצת פיצוי מופקת באמצעות אשף אוטומטי בתוכנת ניתוח רעיונות. זה קריטי, כי אם נעשה שימוש assay זה, בקרות פיצוי הולמות הושלמו כדי להבטיח ביצועי assay נכונים. ניתוח מתבצע באמצעות אשפי מאתר התכונה ושיתוף לוקליזציה לזהות שעוצמת פירוט בהירה היא משתנה הטוב ביותר להפריד בין האוכלוסיות וגם לזהות כמה חפיפה קיימת בין פרץ חמצוני ואותות phagocytosis. באופן ספציפי, השימוש בcytometry מבוסס תמונה סיפק את היכולת להפריד גרנולוציטים הופעלו לשלוש תת קבוצות. Tפירוט משנו נקבע באמצעות עוצמת פירוט בהירה של phagocytosis לעומת פרץ חמצוני. בנוסף לבחינת פונקציות תא היחידה אלה, תאים שהציגו שני אירועים באותו הזמן באותו מיקום האנטומי (שיתוף לוקליזציה) זוהו. גרנולוציטים שנפלו לקבוצת המשנה &quot;גבוה-האקטיבי&quot; היו פנוטיפ היחיד שהפגין שיתוף לוקליזציה עקבית בין phagocytosis ופרץ חמצוני. זיהוי זה של תת granulocyte מופעל הוא האזור הגדול ביותר שבו יש צורך בפתרון בעיות. זה מאוד חשוב עבור משתמש חדש כדי לקחת את הזמן כדי להבין את זרימת העבודה תהליך הדגימה ברעיונות ולהבין את המכניקה של gating אוכלוסיות תאים באמצעות רכיב ההדמיה. שינויים אחרים שהמשתמש יכול לנסות ולהפוך כוללים מבחר של פעמים דגירה assay חלופיות או נוספות. השיטה הנוכחית מצביעה על השימוש בתקופות של 10-40 דקות; עם זאת, בהתאם לדגם הניסיוני שבה שיטה זו היאכדי לשמש, זה עשוי להיות נחוץ כדי לבחור משכי assay עוד. כגון שינוי היית צריך להיות מוערך על בסיס פרטני. עוד נקבע כי משך הדגירה assay יש השפעה משמעותית על המראה של שלוש תת קבוצות הופעלו. הגישה המתוארת בדוח זה מייצגת הארכת איזה מידע ניתן להשיג בעבר לגבי תפקוד granulocyte 3,4,13,15. מעבדות אחרות לא הוכיחו את החשיבות של הערכת שינויים בתפקוד granulocyte כחלק מהערכה מקיפה של חסינות ומחלות 15-17. למרות הפוטנציאל של assay זה זה לא בלי מגבלות. אחת המגבלות העיקריות הוא דרישת עלות וזמן הקשורים גבוה מדגם עיבוד תפוקה. כאשר עיצוב מחקר דורש מספר רב של דגימות ביום נתון, אלה יכולים להיות קשים לעיבוד. עיבוד הוא יעיל על ידי השימוש במכשירים אלקטרוני וpipets,אבל אלה נוטים להיות יקרים ולא בהכרח זמינים בכל מעבדה. האזור שלנו של מחקר מתמקד במחקר של כמה פעילות גופנית והרגלי תזונה משפיעים על בריאות מערכת חיסונית ולתפקד 6,8-10,18-20. יש יעדים כגון השלכות מעשיות משמעותיות עבור מגוון רחב של תחומי בריאות אדם. מעבר ללימוד השפעות הפעילות הגופנית ולתזונה בשיטת phagocytosis הפגינה בכתב יד זה יכול להיות שימושית בתחומים אחרים של אימונולוגיה קלינית בי הניטור של תפקוד phagocytosis הוא קריטי לתוצאות טיפול. Assay הנוכחי הוא הראשון מני רבים שמבחנים אימונולוגיים עם הפוטנציאל להיות מחדש שהומצאו על ידי לקיחת יתרונות של מידע ההדמיה הייחודי שיכול להיות יכול מזרימה מבוססת תמונה cytometer.

גרנולוציטים מייצגים רכיב אחד של המערכת החיסונית של הגוף המולדת, אשר מספקת את קו הגנה הראשון נגד אנטיגנים פולשים. שיטות קודמות להערכת תפקוד granulocyte התמקדו בקיבולת phagocytosis או פרץ חמצוני בשיטות נפרדות, ולכן קשה לקבוע באופן קולקטיבי איך גרנולוציטים השתנו 1-4. התקדמות בתחום הזרימה cytometry הביאו בייצור של מכשירים המעבדתיים מסוגלים ברזולוציה גבוהה, הדמיה צבע רב של תאים באופן תפוקה גבוהה 5. היכולת לשלב הדמיה עם זרימה מסורתית cytometry מייצגת התקדמות שמספקת את הפלטפורמה הטכנולוגית הדרושה כדי לחדש בתוך זרימה הקיימת cytometry שיטות ולחלץ מידע חדש על המערכת החיסונית. במהלך עשר השנים האחרונות, המעבדה שלנו, בין יתר, התמקדה בחריפות על ההשפעה של patte התזונתי וטיפולי מימוש השוניםRNS על תפקוד מערכת חיסון מולדים 6-9. יש השיטה הוכיחה בכתב היד הזה השלכות מעשיות בתחום האימונולוגיה קלינית. השיטה הנוכחית ממנפת את הכח של הזרימה cytometry מבוסס תמונה למדוד phagocytosis של חלקיקי חיידקים ופרץ חמצוני בו זמנית. שימוש בגישה זו, אחד הוא מסוגלת להפריד גרנולוציטים מופעלים באמצעות משתנים הניתנים על ידי החלק מבוסס דמותו של הניתוח. תת אלה היו רק זיהוי לאחר הערכת התמונות הסלולריות על גרנולוציטים הבודדים. זמן הדגירה assay נוסף השפיע על המעבר בין תת הפעלת שלוש 10. לכן, זה מתקבל על הדעת ששימוש במספר רבה של פעמים דגירה עשוי לאפשר שיטה לבחון את השינוי בתפקוד granulocyte הבא טיפול ניסיון ספציפי. המטרה של כתב היד הזה הייתה להדגים שיטה של ​​פונקצית granulocyte הערכה באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה למדוד phagocytosis עם oxidat בו זמניתive פרץ.

<table><tbody><tr><td>שואבי אבק</td><td>BD מדעי</td><td></td> החיים <td>המשמשים לאיסוף דם</td></tr><tr><td>WBC Fixative / RBC תמיסת ליזה</td><td>eBioscience</td><td>00-5333-57</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td>שיבוט G10F5</td><td></td></tr><tr><td>CD45-APCeFluor780</td><td>eBioscience</td><td>שיבוט 2D1</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus ביו-חלקיקים</td><td>Life Technologies</td><td>A10010</td><td></td></tr><tr><td>דיהידרואתידיום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-אתילמלמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנתח המטולוגיה</td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>96 ערוצים</td><td>פיפט אינטגרה ביוסיינסס</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>חממת אמבט חרוזים</td><td>מעבדהשרמור</td><td>BeadBath</td><td></td></tr><tr><td>הדמיה זרימה ציטומטר</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>INSPIRE תוכנה</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis INSPIRE</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS תוכנה</td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis IDEAS</td><td></td></tr><tr><td>X-Pierce Piercable Plate Sealer</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision Workstation</td><td>מחשבי Dell</td><td></td><td>שונים המשמשים לניתוח IDEAS</td></tr></tbody></table>

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte במבחנה

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

גרנולוציטים ממלאים תפקיד מפתח בתגובה החיסונית המולדת של הגוף לזיהומים חיידקיים וויראליים. בעוד שקיימות שיטות למדידת תפקוד הגרנולוציטים, באופן כללי הן מוגבלות מבחינת המידע שהן יכולות לספק. לדוגמה, רוב הבדיקות הקיימות מספקות רק אחוז מכמה גרנולוציטים מופעלים לאחר דגירה בודדת באורך קבוע. מה שמסבך את העניינים, רוב הבדיקות מתמקדות רק בהיבט אחד של התפקוד עקב מגבלות בטכנולוגיית הזיהוי. דוח זה מדגים טכניקה למדידה בו זמנית של פגוציטוזיס גרנולוציטים של חיידקים והתפרצות חמצונית. על ידי מדידת שתי הפונקציות הללו בו זמנית, זוהו שלושה פנוטיפים ייחודיים של גרנולוציטים פעילים: 1) הפעלה נמוכה (פגוציטוזיס מינימלי, ללא פרץ חמצוני), 2) הפעלה מתונה (פגוציטוזיס בינוני, פרץ חמצוני מסוים, אך ללא לוקליזציה משותפת של שני האירועים התפקודיים), ו-3) הפעלה גבוהה (פגוציטוזיס גבוה, פרץ חמצוני גבוה, לוקליזציה משותפת של פגוציטוזיס ופרץ חמצוני). זוהתה גם אוכלוסייה רביעית שהורכבה מגרנולוציטים מומתים. באמצעות דגירה של 10, 20 ו-40 דקות הוערכה ההשפעה של משך הדגירה על החלוקה מחדש של פנוטיפים גרנולוציטים פעילים. דגירה רביעית הושלמה על הקרח כביקורת. על ידי שימוש בדגירה סדרתית, הבדיקה עשויה להיות מסוגלת לזהות כיצד טיפול משפיע מרחבית על תפקוד הגרנולוציטים. כל הדגימות נמדדו באמצעות ציטומטר זרימה מבוסס תמונה המצויד באפשרות הדמיה כמותית (QI), דגימה אוטומטית ולייזרים מרובים (488, 642 ו-785 ננומטר).

באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה אפשר לנו להפריד בין אוכלוסייה הומוגנית של גרנולוציטים הופעלו לשלוש תת קבוצות שונות הפעלה (איור 3). בשיטה זו, הדרך היעילה ביותר לפתור את שלוש תת קבוצות ההפעלה היא על ידי התוויית עוצמת פירוט בהיר לphagocytosis (S. aureus) לעומת פרץ חמצוני (DHE) (איור 3; איור 4). כמו כן, שימוש באשף שיתוף הלוקליזציה בתוכנת רעיונות יאפשר לכימות של הנוכחות של phagocytosis בו זמנית ופרץ חמצוני, וזה סימן היכר של גרנולוציטים הופעלו מאוד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg"> זיהוי איור 3. של תת granulocyte הופעל. לאחר זיהוי של גרנולוציטים באמצעות סמנים על פני קרום תא (+ CD45 + / 66b), עלילת בת נוצרה עם inten פירוט הבהירsity לphagocytosis לעומת עוצמת פירוט בהירה לפרץ חמצוני. שימוש בגישה זו, אחוז לא פעיל (סגול), נמוך-אקטיבי (אדום,), מתון-אקטיבי (כחולה, B), וגרנולוציטים גבוהים פעילים (צהובים, C) נקבעו. טכניקת gating זה היה בשימוש גם על מנת להעריך את ההשפעה של זמן הדגירה assay בשפע היחסי של תת granulocyte הופעל השונים. האחוז הגבוה ביותר של גרנולוציטים "גבוהים-אקטיביים" היה נוכח הבא הדגירה 40 דקות. כל הניתוח של קבצי תמונה שנרכשו הושלם באמצעות תוכנת v.6 רעיונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בנוסף הוכחת הנוכחות של שלוש תת קבוצות שונות של גרנולוציטים הופעלו, זה היה הראה כי זמן הדגירה assay השפיע השפע היחסי של כל תת-קבוצה גרנולוציטים הופעלה. באופן ספציפי, inc 40 דקותubation הביא את האחוז הגדול ביותר של גרנולוציטים "גבוהים-אקטיביים". על ידי ובם לפחות שלושה משכי דגירה assay זה עשוי להיות אפשרי כדי לקבוע כיצד טיפול קליני ניתנו משנה את מצב ההפעלה הזמני של גרנולוציטים. זוהי השיטה הראשונה שפורסמה באמצעות זרימה cytometry מבוסס תמונה לזהות תת granulocyte הופעל שונים כפונקציה של מדידות בו זמנית של phagocytosis ופרץ חמצוני. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg"> איור 4. נציגי תמונות של סמנים תאיים. גלריית תמונות של תאים שסווגו כגבוה פעיל (), מתון-אקטיבי (B), ונמוך-אקטיבי (C) מוצגות בנתון זה. Bioparticles S.aureus נמצאות בCh03 , פרץ חמצוני הוא בCh04, 7AAD לגרעין הוא בCh05, פיזור הצד הוא בCh06, CD66b הוא בCh11, וCD45 הוא בCh12. כמו כן, תמונת מיזוג-מקומי שיתוף של phagocytosis (Ch03) לעומת פרץ חמצוני (Ch04) מוצגת. תחומי צהובים בתמונה המיזוג לציין כי פרץ phagocytosis והחמצונים מתרחשים באותו המקום האנטומי באותו הזמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

שיטה זו מדגימה טכניקה להערכת תפקוד גרנולוציטים על ידי מדידה בו-זמנית של פגוציטוזיס של חיידקים והתפרצות חמצונית. ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה אפשרה זיהוי של שלוש תת-קבוצות נפרדות של גרנולוציטים מופעלים שכולן נבדלות ביכולתן התפקודית היחסית.

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את תפקוד הגרנולוציטים כגישה דו-פרמטרית. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של גרנולוציטים מדגימות דם של מטופלים עם חלקיקים ביולוגיים ומגיב כדי לדמיין את פרץ החמצון. בשלב השני, הפגוציטוזיס שלאחר הדגירה נחסם, ואז מסומנים קולטני פני התא המעניינים כדי לאפשר זיהוי חיובי של הגרנולוציטים.בסופו של דבר, ניתן לזהות ולבודד את תת-קבוצות הגרנולוציטים המופעלים על ידי ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה התזונתית או הקלינית, כגון כיצד הרגלי תזונה ושיטות תזונה תורמים לשינויים ולתפקוד גרנולוציטים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה אריק פראדו, דוקטורנט מהמעבדה שלי.עם השגת הפשרת דגימת הדם ההיקפית, החלקיקים הביולוגיים של ה-SIUs ו-DHE בטמפרטורת החדר והאתיל באמבט של 37 מעלות צלזיוס B, כאשר הריאגנטים הפשירו, מוסיפים 20 מיקרוליטר של חלקיקי הביו של ssus לארבעה צינורות בודדים של 1.2 מיליליטר בתוך מכסה מנוע סטרילי. לאחר מכן הוסף 40 מיקרוליטר של ה-DHE המופשר לכל צינור המכיל את חלקיקי הביו, והקש בעדינות על הצינורות על הספסל כדי לאסוף את המגיב בתחתית הצינורות. לאחר הוספת 100 מיקרוליטר של דם מלא מעורב לכל צינור, הסר את כל הדם המזהם לאורך הקצה הפנימי של הצינורות בעזרת מוליך עם קצה כותנה וערבב את הדם והריאגנטים עם פיפטה אלקטרונית המוגדרת לשלושה מחזורים.לאחר המחזור השלישי, הניחו את כל הצינורות בדלי קרח מוגן מפני אור. לאחר מכן דגרו את הצינורות למשך 10, 20 או 40 דקות באמבט במהירות של 37 מעלות צלזיוס, החל מהצינור של 40 דקות כדי להבטיח שכל הדגירות יסתיימו באותו הזמן. בתום הדגירות יש להוציא 15 מיקרוליטר של אתיל מלאם לכל אחד מהצינורות.לאחר 30 דקות יש לדגור על התאים עם 10 מיקרוליטר כל אחד מהנוגדנים המתאימים. לאחר שעה נוספת דגרו את התאים ב-750 מיקרוליטר של תאי דם לבנים לתקן תמיסת כיני תאי דם אדומים. לאחר שעה נוספת, צנטריפוגת הדגירה של התאים ושואבת בוואקום את הסופרנטנט, ומשאירה נפח נוזל שיורי של 100 מיקרוליטר מעל כדורית התא.כעת הוסף 10 מיקרוליטר של שבעה A a d מדולל טרי, 50 מיקרוליטר PBS ו-25 מיקרוליטר חרוזי כיול לכל דגימה. לאחר מכן מכסים את הצינורות, עוטפים אותם בנייר כסף ומאחסנים אותם בארבע מעלות צלזיוס. כאשר ציטומטר הזרימה מבוסס התמונה מוכן, הפעל כל צינור דגימה שאוסף מינימום של 3000 אירועי אתר ULU באמצעות פרמטרים מוגדרים מראש כדי לנתח את הדגימות.השתמש באשף פיצוי התוכנה האוטומטי של תוכנת IDEA כדי להחיל מטריצת פיצוי על קובצי התמונה הגולמית וליצור קובצי תמונה עם פיצוי. לאחר מכן טען את קבצי ה-CIF הבודדים בתוכנת IDEA וצור את העלילות הבאות כדי לזהות את תת-קבוצות הגרנולוציטים עבור כל דגימת מטופל. השתמש תחילה בבקרה הלא מגורה כתקן ייחוס, השתמש בהיסטוגרמה של ריבוע ממוצע שורש שיפוע השדה הבהיר כדי לקבוע את השערים הראשוניים ולזהות את התאים שנחשבו למוקד.לאחר מכן כדי להפריד את תאי הסינגל מהפסולת והכפולים, צור עלילת נקודות של יחס הגובה-רוחב של Brightfield לעומת אזור השדה הבהיר. לאחר שזוהתה אוכלוסייה נקייה של תאים, קבע תרשים נקודות של CD 45 לעומת CD 66 B.To זהה באופן חיובי את הגרנולוציטים החיוביים CD 45 CD 66 B. לבסוף, צור תרשים נקודות של עוצמת הפרטים הבהירים עבור האאוראוס לעומת עוצמת הפירוט הבהיר עבור פרץ החמצון.כדי לזהות את תת-הקבוצות של הגרנולוציטים המופעלים האוספים את תמונות השדה הבהיר בערוצים 1 ו-9, את החלקיקים הביולוגיים בערוץ שלוש, את ה-DHE בערוץ ארבע, את ה-7 a a d בערוץ חמש, את ה-CD 66 B בערוץ 11 ואת ה-CD 45 בערוץ 12, ניתן ליצור גם שכבת על של שני צבעים המתארת אירועי חלקיקים משולבים של DHE וביו. באמצעות ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה, ניתן להפריד אוכלוסייה הומוגנית של גרנולוציטים מופעלים לשלוש תת-קבוצות הפעלה שונות. בשיטה זו, הדרך היעילה ביותר לפתור את שלושת תת-הקבוצות היא על ידי התוויית עוצמת הפירוט הבהיר עבור הפגוציטוזיס לעומת ההתפרצות החמצונית.שימוש נוסף באשף הקולוקליזציה בתוכנת IDEAS מאפשר לכמת את הנוכחות של הפגוציטוזיס בו זמנית והתפרצות החמצון של הגרנולוציטים, סימן היכר להפעלה גבוהה. בנוסף, בניסוי זה, תקופת הדגירה של 40 דקות הדגימה את האחוז הגדול ביותר של גרנולוציטים פעילים מאוד. לפיכך, הכללת לפחות שלוש תקופות דגירה בפרוטוקול מקלה על הקביעה כיצד טיפול קליני נתון עשוי לשנות את מצב ההפעלה הזמנית של הגרנולוציטים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, כיצד משתנה ייצור הכימוקין של GRANULOCYTE בסופינט בעקבות חשיפה לחלקיקים ביולוגיים?

image-based-flow-cytometry-technique-to-evaluate-changes-granulocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים ציטומטריית זרימה למדידת ספיגת מיקרוגליה של חלקיקים פלואורסצנטיים לאחר מסירה תוך ויטריאלית בעין עכבר. ציטומטריית זרימה מזהה תאים חיים המבטאים CD11b ומבדילה תאי מיקרוגליה פגוציטיים המציגים פלואורסצנטיות ירוקה מתאים מיאלואידים אחרים, כולל מונוציטים המבטאים Ly6C ונויטרופילים המבטאים Ly6G.

מדידת ספיגה מיקרוגליאלית של חלקיקים פלואורסצנטיים המועברים תוך ויטראלית באמצעות ציטומטריית זרימה

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה באמצעות שני פלואורוכרום לזיהוי תאי T CD4+ ו- CD8+, תאי T γδ, תאי B, תאי הרג טבעי (NK) ומונוציטים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). לאחר הדגירה על התאים עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום כנגד סמני פני השטח, תת-קבוצות התא מזוהות באמצעות אסטרטגיית גטינג ציטומטרית אופטימלית של זרימה.

בדיקת ציטומטריית זרימה לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

סרטון זה מדגים בדיקה במבחנה כדי לחקור את ההשפעה האימונומודולטורית של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) על התפשטות תאי T משפיעים. הבדיקה כוללת תרבית משותפת של MSCs עם PBMCs כדי לגרום לאוכלוסיית המונוציטים לרכוש פנוטיפ אימונומודולטורי, המוביל להפרשת אינטרלוקין-10 (IL-10). לאחר הדגירה עם תאי T CD4+ פעילים, המונוציטים המושרים מדכאים ביעילות את התפשטות תאי T.

בדיקת מבחנה להערכת ההשפעה האימונומודולטורית של מונוציטים על התפשטות לויקוציטים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חדשה לזיהוי אוכלוסייה של enucleating erythroblasts אורתוכרומטי ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, מתן להדמיה של תהליך אנוקלאציה erythroblast.

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

מונוציטים הם מרכיבים אינטגרליים של מערכת החיסון המולדת האנושית המסתמכים על חילוף חומרים גליקוליטי כאשר הם מופעלים. אנו מתארים פרוטוקול זרימה ציטומטרית למדידת ביטוי טרנספורטר גלוקוז וספיגת גלוקוז על ידי סך כל המונוציטים ותת-אוכלוסיות המונוציטים בדם מלא טרי.

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

מטרת כתב היד הזה היא להציג שיטה למדידת פגוציטוזיס מונוציטים וגרנולוציטים ופעילות פרץ חמצוני בדגימות דם אנושיות.

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

למדו להעריך פונקציית גרנולוציטים באמצעות ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה. שיטה זו מאפשרת זיהוי של שלוש תת-אוכלוסיות שונות של גרנולוציטים מופעלים ומסייעת בחקר תפקוד המערכת החיסונית במחקר קליני.

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte במבחנה

גלה סרטונים נוספים