טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte במבחנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את תפקוד הגרנולוציטים כגישה דו-פרמטרית. זה מושג על ידי דגירה ראשונה של גרנולוציטים מדגימות דם של מטופלים עם חלקיקים ביולוגיים ומגיב כדי לדמיין את פרץ החמצון. בשלב השני, הפגוציטוזיס שלאחר הדגירה נחסם, ואז מסומנים קולטני פני התא המעניינים כדי לאפשר זיהוי חיובי של הגרנולוציטים.

בסופו של דבר, ניתן לזהות ולבודד את תת-קבוצות הגרנולוציטים המופעלים על ידי ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה התזונתית או הקלינית, כגון כיצד הרגלי תזונה ושיטות תזונה תורמים לשינויים ולתפקוד גרנולוציטים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה אריק פראדו, דוקטורנט מהמעבדה שלי.

עם השגת הפשרת דגימת הדם ההיקפית, החלקיקים הביולוגיים של ה-SIUs ו-DHE בטמפרטורת החדר והאתיל באמבט של 37 מעלות צלזיוס B, כאשר הריאגנטים הפשירו, מוסיפים 20 מיקרוליטר של חלקיקי הביו של ssus לארבעה צינורות בודדים של 1.2 מיליליטר בתוך מכסה מנוע סטרילי. לאחר מכן הוסף 40 מיקרוליטר של ה-DHE המופשר לכל צינור המכיל את חלקיקי הביו, והקש בעדינות על הצינורות על הספסל כדי לאסוף את המגיב בתחתית הצינורות. לאחר הוספת 100 מיקרוליטר של דם מלא מעורב לכל צינור, הסר את כל הדם המזהם לאורך הקצה הפנימי של הצינורות בעזרת מוליך עם קצה כותנה וערבב את הדם והריאגנטים עם פיפטה אלקטרונית המוגדרת לשלושה מחזורים.

לאחר המחזור השלישי, הניחו את כל הצינורות בדלי קרח מוגן מפני אור. לאחר מכן דגרו את הצינורות למשך 10, 20 או 40 דקות באמבט במהירות של 37 מעלות צלזיוס, החל מהצינור של 40 דקות כדי להבטיח שכל הדגירות יסתיימו באותו הזמן. בתום הדגירות יש להוציא 15 מיקרוליטר של אתיל מלאם לכל אחד מהצינורות.

לאחר 30 דקות יש לדגור על התאים עם 10 מיקרוליטר כל אחד מהנוגדנים המתאימים. לאחר שעה נוספת דגרו את התאים ב-750 מיקרוליטר של תאי דם לבנים לתקן תמיסת כיני תאי דם אדומים. לאחר שעה נוספת, צנטריפוגת הדגירה של התאים ושואבת בוואקום את הסופרנטנט, ומשאירה נפח נוזל שיורי של 100 מיקרוליטר מעל כדורית התא.

כעת הוסף 10 מיקרוליטר של שבעה A a d מדולל טרי, 50 מיקרוליטר PBS ו-25 מיקרוליטר חרוזי כיול לכל דגימה. לאחר מכן מכסים את הצינורות, עוטפים אותם בנייר כסף ומאחסנים אותם בארבע מעלות צלזיוס. כאשר ציטומטר הזרימה מבוסס התמונה מוכן, הפעל כל צינור דגימה שאוסף מינימום של 3000 אירועי אתר ULU באמצעות פרמטרים מוגדרים מראש כדי לנתח את הדגימות.

השתמש באשף פיצוי התוכנה האוטומטי של תוכנת IDEA כדי להחיל מטריצת פיצוי על קובצי התמונה הגולמית וליצור קובצי תמונה עם פיצוי. לאחר מכן טען את קבצי ה-CIF הבודדים בתוכנת IDEA וצור את העלילות הבאות כדי לזהות את תת-קבוצות הגרנולוציטים עבור כל דגימת מטופל. השתמש תחילה בבקרה הלא מגורה כתקן ייחוס, השתמש בהיסטוגרמה של ריבוע ממוצע שורש שיפוע השדה הבהיר כדי לקבוע את השערים הראשוניים ולזהות את התאים שנחשבו למוקד.

לאחר מכן כדי להפריד את תאי הסינגל מהפסולת והכפולים, צור עלילת נקודות של יחס הגובה-רוחב של Brightfield לעומת אזור השדה הבהיר. לאחר שזוהתה אוכלוסייה נקייה של תאים, קבע תרשים נקודות של CD 45 לעומת CD 66 B.To זהה באופן חיובי את הגרנולוציטים החיוביים CD 45 CD 66 B. לבסוף, צור תרשים נקודות של עוצמת הפרטים הבהירים עבור האאוראוס לעומת עוצמת הפירוט הבהיר עבור פרץ החמצון.

כדי לזהות את תת-הקבוצות של הגרנולוציטים המופעלים האוספים את תמונות השדה הבהיר בערוצים 1 ו-9, את החלקיקים הביולוגיים בערוץ שלוש, את ה-DHE בערוץ ארבע, את ה-7 a a d בערוץ חמש, את ה-CD 66 B בערוץ 11 ואת ה-CD 45 בערוץ 12, ניתן ליצור גם שכבת על של שני צבעים המתארת אירועי חלקיקים משולבים של DHE וביו. באמצעות ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה, ניתן להפריד אוכלוסייה הומוגנית של גרנולוציטים מופעלים לשלוש תת-קבוצות הפעלה שונות. בשיטה זו, הדרך היעילה ביותר לפתור את שלושת תת-הקבוצות היא על ידי התוויית עוצמת הפירוט הבהיר עבור הפגוציטוזיס לעומת ההתפרצות החמצונית.

שימוש נוסף באשף הקולוקליזציה בתוכנת IDEAS מאפשר לכמת את הנוכחות של הפגוציטוזיס בו זמנית והתפרצות החמצון של הגרנולוציטים, סימן היכר להפעלה גבוהה. בנוסף, בניסוי זה, תקופת הדגירה של 40 דקות הדגימה את האחוז הגדול ביותר של גרנולוציטים פעילים מאוד. לפיכך, הכללת לפחות שלוש תקופות דגירה בפרוטוקול מקלה על הקביעה כיצד טיפול קליני נתון עשוי לשנות את מצב ההפעלה הזמנית של הגרנולוציטים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים כדי לענות על שאלות נוספות. לדוגמה, כיצד משתנה ייצור הכימוקין של GRANULOCYTE בסופינט בעקבות חשיפה לחלקיקים ביולוגיים?