Um imunoensaio baseado em nanopartículas magnéticas usando um dispositivo microfluídico

Pegue um dispositivo microfluídico afixado a um estágio de microscópio, compreendendo uma entrada para dispensar reagentes, canais interconectados para fluxo de fluido e saídas para purgar os fluidos.

O canal principal contém uma restrição central escalonada com micropartículas de ferro agregadas aprisionadas.

Os canais são incubados com uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Flua um tampão de lavagem, removendo o excesso de solução de bloqueio.

Introduzir uma suspensão imunocomplexa a um débito definido. O imunocomplexo consiste em nanopartículas magnéticas, revestidas com antígenos ligados a anticorpos primários, que são posteriormente ligados a anticorpos secundários conjugados com peroxidase.

Aplique um campo magnético externo, magnetizando as micropartículas agregadas e transformando-as em uma armadilha magnética para capturar os imunocomplexos.

Introduzir um substrato fluorogénico que é convertido pela peroxidase num produto fluorescente e flui através da armadilha.

Usando o microscópio, compare a fluorescência antes e depois da armadilha, confirmando a captura de imunocomplexos.

Encha os canais com água destilada usando uma seringa. Mergulhe o dispositivo em um banho ultrassônico por 10 minutos. Em seguida, esvazie a água dentro dos canais do dispositivo e use uma seringa para introduzir a solução de BSA a 5%.

Prepare uma suspensão de micropartículas de ferro de diâmetro 7,5 micrômetros em 5% BSA. Incubar o chip e a suspensão de micropartículas com a solução de bloqueio por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, insira as micropartículas no chip com uma agulha de seringa através da mangueira de saída do canal lateral.

Coloque o chip verticalmente; em seguida, gire o chip em duas etapas de 90 graus, de modo que as micropartículas atinjam e compactem na restrição de 5 micrômetros. Sele todas as mangueiras do dispositivo de acrílico com calor. Corte a mangueira de entrada até restarem apenas alguns milímetros.

Encha a agulha dispensadora com tampão de lavagem e insira-a na mangueira cortada. Deixe a solução pingar e, em seguida, conecte a agulha ao dispositivo. Corte a mangueira de saída do canal lateral e conecte à bomba da seringa. Em seguida, repita o mesmo procedimento para a mangueira de saída do canal principal e, em seguida, conecte o chip ao ímã.

Para imunodetecção, mantenha o tampão de lavagem fluindo por 10 minutos a 50 microlitros por hora. Remova o tampão de lavagem restante da agulha dispensadora com uma micropipeta e adicione 50 microlitros da suspensão de nanopartículas. Flua a suspensão de nanopartículas por 7 minutos a uma taxa de fluxo de 100 microlitros por hora. Em seguida, altere a vazão para 50 microlitros por hora e continue o fluxo por mais 15 minutos.

Troque a agulha dispensadora e flua o tampão de lavagem por 10 minutos na mesma taxa. Remova o tampão de lavagem restante da agulha dispensadora com uma micropipeta e adicione 100 microlitros do substrato fluorogênico. Ajuste a taxa de fluxo e os parâmetros de tempo para entrada de substrato, medição de fluorescência e etapa de lavagem.

Ative o fluxo de entrada do substrato fluorogênico por 6 minutos a 50 microlitros por hora. 15 segundos antes de o fluxo do substrato parar, ligue a fluorescência do microscópio. Inicie a captura da imagem com o software da câmera do microscópio 10 segundos antes que o substrato pare com um tempo de exposição de 1.000 milissegundos.

Clique no botão Iniciar do parâmetro de vazão desejado imediatamente após a interrupção da lavagem do substrato. Realize imagens por 6 minutos a um quadro por segundo. Clique no botão Iniciar do fluxo de lavagem imediatamente após a interrupção do fluxo de medição selecionado.