Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

O objetivo geral dessa técnica é rastrear rapidamente os autoanticorpos de forma multiplex. Este método pode ajudar a identificar questões-chave no campo da autoimunidade, como quais autoanticorpos estão correlacionados com diferentes estados de doença. As principais vantagens dessa técnica são que os autoanticorpos podem ser rastreados de forma paralela, apenas microlitros de soro são necessários e apenas microgramas de antígeno.

Para gerar microarrays de antígenos, comece diluindo antígenos em PBS até uma concentração final de 2 miligramas por mililitro. Defina uma configuração de micro arrayer com nove pinos para imprimir até 162 antígenos exclusivos em duplicata. Incluir os antígenos IgG e IgM na biblioteca de antígenos como controles positivos.

Inclua PBS apenas como um controle negativo. Adicione 20 microlitros de cada antígeno à placa de origem de 384 poços em grupos que espelham a configuração do cabeçote de impressão. Use papel alumínio para cobrir a placa de origem e congele a placa a 80 graus Celsius negativos, até que esteja pronta para imprimir matrizes.

Limpe os pinos sólidos do microarray incubando-os em um banho de sonicação com água deionizada três vezes por um minuto cada. Coloque os pinos em uma grade para secar. Em seguida, organize os pinos na cabeça de impressão do microarray.

Para nove pinos, use uma configuração de três por três. Em seguida, programe o microarrayer para a execução de impressão, definindo o número de pinos no cabeçote de impressão, o número de lâminas a serem impressas, o número de almofadas em cada lâmina e o número de pontos replicados para cada antígeno. Além disso, programe o microarrayer para sonicar os pinos em água entre diferentes grupos de antígenos.

Em seguida, depois de descongelar a placa de origem, centrifugue-a por um minuto a 100 vezes G. Coloque a placa de origem no local designado no microarrayer e, em seguida, remova a seção de papel alumínio que cobre o primeiro grupo de antígenos a serem impressos. Organize os slides não impressos na superfície do array e execute o programa de impressão. Imprima as lâminas em temperatura ambiente com a umidade definida no arrayer em 55 a 60%Depois que cada grupo de antígenos for impresso em todas as lâminas, pause o microarrayer.

Cubra os antígenos que acabaram de ser impressos com papel alumínio para evitar a evaporação e descubra o próximo grupo de antígenos a serem impressos. Em seguida, continue o programa de impressão. Depois de todos os antigénios terem sido impressos, cubra a placa de origem com um novo pedaço de papel alumínio e congele-o a 80 graus Celsius negativos.

Coloque os slides impressos em uma caixa de slides e sele-a a vácuo. Os slides podem ser usados no dia seguinte ou até um mês depois. Para sondar microarrays com soros diluídos usando câmaras de incubação, coloque as lâminas em quadros.

Em seguida, adicione 700 microlitros de buffer de bloqueio a cada superfície da matriz. Coloque o filme adesivo sobre a moldura e transfira-o para um recipiente lacrado com um pedaço de lenço de papel úmido. Em seguida, incube os slides a quatro graus Celsius em um balancim durante a noite.

No dia seguinte, diluir as amostras de soro de um a 100 em tampão de bloqueio. Em seguida, aspire a solução de bloqueio das matrizes e adicione 500 microlitros de amostra diluída a cada superfície da matriz. Em seguida, cubra as matrizes com filme adesivo e incube a quatro graus Celsius, com balanço por uma hora.

Em seguida, aspire as amostras de soro das matrizes e use tampão de enxágue para enxaguar as superfícies da matriz quatro vezes, despejando o tampão nas lâminas e retirando-o rapidamente. Use 700 microlitros de tampão de bloqueio para lavar cada superfície da matriz e incube 10 minutos em temperatura ambiente com balanço. Em seguida, adicione 500 microlitros de anticorpo secundário diluído a cada superfície da lâmina e use filme adesivo para cobri-la.

Incube as lâminas a quatro graus Celsius com balanço por 45 minutos. Após a incubação, aspirar a mistura de anticorpos secundários das lâminas e enxaguar quatro vezes, como acabamos de demonstrar. Em seguida, lave as lâminas com 700 microlitros de tampão de diluição de bloqueio, três vezes por 10 minutos cada.

Remova as lâminas das molduras, coloque-as em um rack de lâminas de metal e mergulhe-as no PBS. Incubar à temperatura ambiente com agitação orbital durante 20 minutos. Coloque um rack de slides em um recipiente com água deionizada por 15 segundos.

Em seguida, coloque o rack em um novo recipiente com água e incube por mais 15 segundos. Para secar as lâminas, coloque o suporte de lâminas em um adaptador de placa ELISA na centrífuga e gire a 220 vezes G e temperatura ambiente por cinco minutos. Coloque as lâminas em uma caixa leve e apertada até que estejam prontas para digitalização.

Para escanear as lâminas, use um scanner de microarray que possa detectar sinais fluorescentes SI três e SI cinco. Determine o tubo multiplicador ideal, ou configurações de PMT, pré-escaneando uma lâmina completa da biblioteca de antígenos que foi sondada apenas com anticorpos secundários. Defina os valores PMT usados pressionando o botão de hardware para que os recursos de IgG humano no canal SI de três canais e os recursos de IGM humano no canal SI de cinco canais tenham uma intensidade de fluorescência média semelhante menos o fundo, ou MFIB, que normalmente é 40.000.

Em seguida, digitalize os slides experimentais nos dois canais pressionando o botão de varredura. Salve as imagens do slide em ambos os canais após cada digitalização. Usando o botão de arquivo, carregue o slide a ser analisado no software de microarray.

Em seguida, use o botão de arquivo para carregar a lista de matriz de genes, ou arquivo GAL, que tem o layout da matriz, com as identidades dos recursos da matriz. Coloque o modelo de matriz sobre a imagem digitalizada, de modo que os recursos de matriz correspondam ao modelo o mais próximo possível. Pressione o botão de alinhamento para alinhar feições em todos os blocos com o modelo.

O software calculará então um fundo MFI menos para cada um dos antígenos. Por fim, use o botão de arquivo para exportar os resultados como um arquivo de texto e analise os dados de acordo com o protocolo de texto. Nesta figura, mostrando lâminas de controle positivo e negativo, a lâmina negativa é sondada apenas com anticorpos secundários, e a lâmina de controle positivo é sondada com soro de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico.

Conforme indicado aqui, o soro de controle positivo, com reatividade conhecida ao riboP, demonstrou ter anticorpos IgM contra DNA de fita simples e anticorpos IgG contra riboP. Respostas lineares foram observadas com IgM em todas as diluições de soro e com IgG até um fundo MFI menos de aproximadamente 30.000. Neste experimento, a matriz é sondada com soro humano de um paciente com vasculite crioglobulinêmica, com um fator reumatóide documentado, que é um anticorpo IgM contra IgG.

A característica IgG é verde-amarelada devido à ligação de IgM no soro do paciente ao IgG imobilizado na matriz. Usando anticorpos secundários sozinhos, nenhuma reatividade de IgM é observada contra IgG que é detectada na matriz. Mostrado aqui, IgM e IgG de camundongo detectados na matriz são detectados apenas com anticorpos secundários anti-camundongo para IgM e IgG, respectivamente.

Esta figura mostra o alinhamento de uma grade de modelo em uma imagem de matriz digitalizada, usando software de análise de microarray. Uma vez alinhados, os recursos da matriz podem ser analisados para obter a intensidade média de fluorescência menos o fundo para cada recurso. Uma vez dominada, a sondagem de microarrays de antígenos pode ser feita em quatro horas, se for feita corretamente.

Após este procedimento, outras técnicas como o ELISA podem ser realizadas para validar os resultados obtidos a partir dos microarrays de antígenos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como imprimir microarrays de antígeno, como sondar microarrays de antígeno com soro e como escanear microarrays de antígeno com um scanner. Não se esqueça de que trabalhar com soro humano pode ser perigoso e precauções universais devem ser tomadas ao realizar este procedimento.