Name: Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a gerar microarrays de antígenos bicolor para detectar simultaneamente autoanticorpos IgG e IgM em amostras de soro humano e murino. Esta técnica de alta vazão permite triagem rápida e quantitativa em imunologia.

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A.C. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da Heart and Stroke Foundation of Canada e do Programa de Treinamento em Medicina Regenerativa (Canadian Institutes of Health Research). F.Y.Y.H. foi apoiado pelo Programa de Treinamento em Medicina Regenerativa. Este trabalho foi financiado por uma doação da Astellas Pharma Canada. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Mark Menenghini (Universidade de Toronto) pelo uso de seu scanner de microarray Axon.

1. diluindo Antígenos e gerando Antigen Microarrays <ol><li> Diluir antigénios em PBS para uma concentração final de 0,2 mg / ml. Imprimir até 162 antígenos únicos em duplicado com uma configuração microarrayer com 9 pinos. Incluem antigénios de IgG e IgM na biblioteca antigénio como controlos positivos. Incluem apenas PBS como controlo negativo. </li><li> Adicionar 20 ul de cada antigénio para a placa de fonte de 384 poços. Adicionar antígenos para a placa de fonte em grupos que espelham a configuração da cabeça de impressão (por exemplo, organizar antígenos em grupos de 9, quando 9 pinos são utilizados para impressão). </li><li> placa fonte Cubra com papel alumínio e congelar a -80 ° C até que esteja pronto para imprimir arrays. </li><li> Limpar os pinos microarrayer sólidos, incubando-as num banho de ultra-sons com água desionizada durante 3 x 1 min. Coloque pinos no rack para secar e em seguida, organizar pinos no cabeçote microarray. Para 9 pinos, use uma configuração de 3 x 3. </li><li> microarrayer Programa de impressão gerido pela definição do número de pinos na cabeça de impressão,número de lâminas de imprimir, o número de pastilhas em cada lâmina, e o número de pontos em replicado para cada antigénio. Normalmente, utilize 9 pinos, 70 slides, 2 almofadas / slides, e 2 pontos em replicado para cada antigénio. microarrayer programa para sonicate pinos na água entre diferentes grupos de antígenos. </li><li> placa fonte descongelar e placa, em seguida, centrifuga-se durante 1 min a 100 x g. Coloque placa de fonte no local designado na microarrayer. Retirar a parte da folha que está cobrindo o primeiro grupo de antigénios a ser impresso. </li><li> Organizar os slides não impressos na superfície arrayer e executar o programa de impressão. lâminas de impressão em temperatura ambiente com umidade definida no arrayer a 55 - 60% com a construção em umidificador da máquina matriz. </li><li> Depois de cada grupo de antígenos é impresso em todos os slides, pause o microarrayer. Cobrir os antigénios que foram impressas apenas com uma folha (para evitar a evaporação) e descobrir o próximo grupo de antigénios a ser impresso. Continue programa de impressão. </li><li> Depois de todos os antígenos foram impressas, fonte de cobertura de plcomeu com novo pedaço de papel alumínio e congelar a -80 ° C. Coloque slides impressos na caixa slide e selo de vácuo. As lâminas podem ser usados ​​no dia seguinte ou até um mês mais tarde. </li></ol> 2. Sondagem Antigen Microarrays com soro diluído <ol><li> Coloque slides em quadros usando câmaras de incubação. Adicionar 700 ul de tampão de bloqueio (2,5% [vol / vol] de soro de vitelo fetal (FCS), 0,1% [vol / vol] de Tween 20 em PBS) a cada superfície de matriz. </li><li> Coloque película adesiva sobre o quadro e coloque em um recipiente fechado, com um pedaço de tecido molhado. Incubar O / N a 4 ° C num agitador rotativo. </li><li> Diluir as amostras de soro de 1: 100 em tampão de bloqueio. Aspirar solução a partir de matrizes de bloqueio e adicionar 500 ul de amostra diluída a cada superfície de matriz. </li><li> Cubra com filme adesivo e incubar durante 1 hora a 4 ° C com agitação. </li><li> Diluir anticorpos secundários em tampão de bloqueio. Para os estudos humanos, dilui-se um anticorpo de IgG de cabra Cy3 anti-humano marcado para 0,33 ug / ml e marcado com Cy5 de um anticorpo de cabra anti-humaN anticorpo IgM para 0,25 ug / ml. Para os estudos de rato, dilui-se uma cabra marcado com Cy3 de anticorpo IgG anti-rato a 0,38 ug / mL e um anticorpo marcado com Cy5 anti-murganho de cabra IgM para 0,7 ug / ml. </li><li> Aspirar as amostras a partir de matrizes e lavar superfícies de matriz 4 vezes com tampão de lavagem (0,1% de Tween 20 em PBS). Pour tampão para a slides e agite rapidamente. </li><li> Adicionar 700 ul de tampão de bloqueio para lavar cada superfície de matriz e incubar 10 min à TA com agitação. etapa de lavagem Repita mais duas vezes. </li><li> Adicionar 500 uL de anticorpo secundário diluído a cada superfície de deslizamento e cobrir com película adesiva. Incubar 45 min a 4 ° C com agitação. </li><li> Aspirar mistura de anticorpo secundário a partir de lâminas e lavar 4 vezes como acima. Lave as lâminas 3 vezes com 700 ul de tampão de bloqueio / diluição como acima. </li><li> Retirar as lâminas de quadros e coloque em porta-lâminas de metal que está imerso em PBS. Incubar 20 min a RT com agitação orbital. Coloque no novo recipiente de PBS e incubar mais 20 mcom agitação. </li><li> Lugar porta-lâminas no recipiente de água deionizada 15 seg. Coloque em rack em um novo recipiente de água e incubar mais 15 seg. </li><li> Para lâminas secas, lugar porta-lâminas em um adaptador de placa de ELISA em centrífuga e girar a 220 xg por 5 min a RT. </li><li> Colocar as lâminas na caixa à prova de luz até que esteja pronto para a digitalização. </li></ol> 3. A digitalização Antigen Microarrays e exportação de dados <ol><li> Digitalizar slides usando um scanner de microarray que podem detectar sinais fluorescentes Cy3 e Cy5. A fim de ajustar os níveis de tubo fotomultiplicador (PMT) do scanner, pré-digitalizar um slide que só foi sondado com anticorpos secundários. Nota: Esta corrediça deve ter a biblioteca antigénio completo impresso nele incluindo positivo (IgG e IgM), bem como controlos negativos (PBS). A pré-digitalização é uma digitalização de baixa resolução que permite que o usuário rapidamente para encontrar as configurações ideais PMT. </li><li> Defina os valores de PMT de modo que os recursos humanos IgG (no canal Cy3) e o zumbidouma características IgM (no canal Cy5) têm um semelhante mediana intensidade de fluorescência menos de fundo (MFI-B) (tipicamente 40.000). Os níveis PMT são definidos pressionando o botão &quot;hardware&quot;. Uma vez definido, manter essas configurações PMT constante. </li><li> Digitalizar os slides experimentais sobre os dois canais, premindo o botão &quot;Scan&quot;. Salve as imagens de slides (ambos os canais) após cada digitalização. </li><li> Coloque o slide a ser analisados ​​no software microarray usando o botão &quot;file&quot;. </li><li> Carregar o arquivo de lista de matriz gene (GAL) utilizando o botão &quot;file&quot;. O arquivo GAL tem o layout da matriz com as identidades das características da matriz. </li><li> Coloque o modelo de matriz sobre a imagem digitalizada para que as matrizes características corresponder ao modelo, tanto quanto possível. </li><li> Alinhar recursos em todos os blocos com o modelo premindo o botão &quot;align&quot;. O programa vai encontrar geralmente o contorno das características circulares, mas alguns ajustes manuais podem ser necessárias. Estes ajustes podem ser feitos através da introdução do modo de recurso. O software terá, então, calcular um MFI-B para cada um dos antigénios. </li><li> Use o botão &quot;Arquivo&quot; para exportar estes resultados como um arquivo de texto. </li></ol> 4. Analisando dados matriz com análise da significância dos microarrays (SAM) <ol><li> Carregar arquivos de texto individuais em excel e identificar as colunas que têm MFI-B para os canais Cy3 e Cy5. </li><li> Calcule a média dos recursos duplicados. </li><li> Para qualquer negativo MFI-B, substitua o número negativo com 10. Transformar dados dividindo-primas MFI-B por 100 e, em seguida, calculando log de base 2. </li><li> Analisar log de ​​dados transformados com análise da significância dos microarrays (SAM), como descrito anteriormente 7. </li><li> Para um estudo com dois grupos (por exemplo, controles saudáveis ​​versus pacientes), etiqueta um grupo &quot;1&quot; e o grupo &quot;2.&quot; Use uma de duas classes, a análise não emparelhado na SAM para identificar os antígenos reacções que são significantly diferente entre os dois grupos (valor q &lt;0,05). </li><li> Use um software de clustering e de geração de calor mapa para fazer imagens para a apresentação 8. </li></ol>

<ol><li>Naparstek, Y., Plotz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in autoimmune disease.</a> Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).</li>
<li>Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+2015%3A+From+diagnostic+biomarkers+toward+prediction%2C+prognosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention.</a> Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).</li>
<li>Robinson, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+microarrays+for+multiplex+characterization+of+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+medicine%22%5BJournal%5D)">Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses.</a> Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).</li>
<li>Quintana, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarrays+identify+unique+serum+autoantibody+signatures+in+clinical+and+pathologic+subtypes+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).</li>
<li>Hueber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarray+profiling+of+autoantibodies+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+analysis+reveals+BAFF-binding+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).</li>
<li>Chruscinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Antigen+Microarrays+to+Screen+for+Autoantibodies+in+Heart+Failure+and+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation.</a> PloS one. 11, e0151224(2016).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+influenza+vaccine+immunogenicity+using+influenza+antigen+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays.</a> PloS one. 8, e64555(2013).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+profiles+of+broadly+neutralizing+anti-HIV-1+antibodies+are+distinct+from+those+of+pathogenic+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies.</a> Aids. 25, 1247-1257 (2011).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+humoral+rejection+of+human+kidney+allografts+associates+with+broad+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses.</a> Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).</li>
<li>Haddon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+epitopes+of+U1-70K+autoantibodies+at+single-amino+acid+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution.</a> Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).</li>
<li>Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of immunoglobulins.</a> J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui descrito permite a quantificação de auto-anticorpos, utilizando a técnica de microarray antigénio. microarrays Antigen oferecem várias vantagens sobre ELISA convencional na pesquisa de auto-anticorpos. Primeiro de tudo, uma variedade de antigénios, incluindo ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, e os lisados ​​celulares podem ser dispostas sobre as lâminas revestidas com nitrocelulose, permitindo, assim, para o rastreio multiplexado de auto-anticorpos. Além disso, apenas microgramas de antigénio são n...

Os autoanticorpos estão presentes em muitos estados de doença e muitas vezes podem ter atividade patogênica direta1. A identificação de autoanticorpos é importante para o diagnóstico de determinadas doenças, para o prognóstico do desfecho da doença e para a classificação de pacientes que podem se beneficiar de terapias específicas2. Os autoanticorpos são tipicamente identificados no soro do paciente usando a técnica ELISA; no entanto, a triagem de múltiplos antígenos com essa técnica é trabalhosa e consome uma grande quantidade de amostra de pacientes. Novas tecnologias são, portanto, necessárias para traçar o perfil dos autoanticorpos em maior escala.
A técnica de microarray de antígeno é uma tecnologia proteômica que permite que os autoanticorpos sejam perfilados de forma multiplex3. Na primeira etapa desse processo, uma biblioteca de antígenos é disposta em uma superfície de lâmina usando um microarrayer robótico. As lâminas são sondadas com soro diluído e, em seguida, anticorpos secundários marcados com fluorescência são adicionados. As reatividades de anticorpos são visualizadas por varredura das lâminas com um scanner de microarray e quantificadas por intensidades fluorescentes. Os microarrays de antígenos oferecem múltiplas vantagens sobre a técnica ELISA na triagem de autoanticorpos: 1) eles requerem apenas microlitros de soro para traçar o perfil de autoanticorpos para vários antígenos simultaneamente, 2) eles usam antígenos com moderação, pois apenas nanolitros de antígeno são detectados nas matrizes, 3) eles têm sensibilidade aprimorada3 em comparação com ELISA e 4) eles permitem o simultâneo ainda, detecção separada de mais de um isotipo de anticorpo. Microarrays de antígenos têm sido usados para traçar o perfil de autoanticorpos em doenças autoimunes, como artrite reumatoide, esclerose múltipla e lúpus eritematoso sistêmico4-6. Em todas essas três doenças, uma nova visão sobre a patogênese da doença foi obtida a partir do perfil de autoanticorpos em larga escala com as matrizes. 
Aqui descrevemos um protocolo para gerar microarrays de antígenos usando lâminas revestidas de nitrocelulose. Uma variedade de antígenos, incluindo proteínas, peptídeos e lisados celulares, pode ser disposta nas lâminas usando esta técnica. As matrizes podem ser facilmente personalizadas incluindo antígenos de interesse na placa de origem que contém a biblioteca de antígenos. Além disso, mostramos como um par de anticorpos secundários pode ser usado para separar as reatividades de IgG e IgM na mesma superfície da lâmina. Agora otimizamos essa técnica para medir autoanticorpos em humanos e camundongos.

<table><tbody><tr><td>Ribossômico P0</td><td>Diarect</td><td>14100</td><td>diluir para 0,2 mg / ml em PBS</td></tr><tr><td>humano IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-003</td><td>diluir para 0,2 mg / ml em</td></tr><tr><td>PBS humano IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-012</td><td>diluir para 0,2 mg / ml em</td></tr><tr><td>PBS camundongo IgG Sigma-Aldrich</td><td></td><td>I5381</td><td>diluir para 0,2 mg / ml em</td></tr><tr><td>PBS camundongo IgM</td><td>Biolegend</td><td>401601</td><td>diluir para 0,2 mg/ml em PBS</td></tr><tr><td>DNA de fita dupla</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>diluir para 0,2 mg/ml em PBS</td></tr><tr><td>DNA de fita simples</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8899</td><td>diluir para 0,2 mg/ml em</td></tr><tr><td>PBS microarrayer</td><td>Virtek</td><td>VersArray Chipwriter Pro</td><td>muitos tipos de arrayers são</td></tr><tr><td>adequados pinos de impressão sólidos</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SSP015</td><td></td></tr><tr><td>software para microarrayer robótico</td><td>Virtek</td><td>Chipwriter Pro&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas FAST (2 Pad)</td><td>GVS Northa America</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>estrutura FAST</td><td>GVS Northa America</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>câmaras de incubação FAST (2 Pad)</td><td>GVS Northa America</td><td>10486242</td><td></td></tr><tr><td>placas de 384 poços</td><td>Seladoras de placas Whatman</td><td>7701-5101</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>tampas</td> <td>de placas de alumínioVWR</td><td>60941-124</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Invitrogen</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 cabra anti-humano IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-165-096</td><td>use estoque de trabalho em 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 cabra anti-humano IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-175-129</td><td>use estoque de trabalho em 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy3 cabra anti-rato IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-165-071</td><td>uso de estoque de trabalho em 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 cabra anti-rato IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-175-075</td><td>uso de estoque de trabalho em 50% glyercol</td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Molecular Devices Axon</td><td>4200A</td><td></td></tr><tr><td>Microarray software</td><td>Molecular Devices</td><td>Genepix 6.1</td><td></td></tr><tr><td>Clustering software</td><td>eisenlab.org</td><td>Cluster 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Software de mapa de calor</td><td>eisenlab.org</td><td>Treeview 1.60</td><td></td></tr><tr><td>Software estatístico de microarray</td><td>Universidade</td><td>de Stanford SAM 4.0 (Análise de Significância de Microarrays)</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de duas cores antigen microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos igg e igm

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Autoanticorpos, que são anticorpos contra autoantígenos, estão presentes em muitos estados de doença e podem servir como marcadores para a atividade da doença. Os níveis de autoanticorpos para antígenos específicos são normalmente detectados com a técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA). No entanto, a triagem de múltiplos autoanticorpos com ELISA pode ser demorada e requer uma grande quantidade de amostra de pacientes. A técnica de microarranjo de antígenos é um método alternativo que pode ser usado para rastrear autoanticorpos de forma multiplex. Nesta técnica, os antígenos são dispostos em lâminas de microscópio especialmente revestidas com um microarrayer robótico. As lâminas são sondadas com amostras de soro do paciente e, posteriormente, anticorpos secundários marcados com fluorescência são adicionados para detectar a ligação de autoanticorpos séricos aos antígenos. As reatividades de autoanticorpos são reveladas e quantificadas por varredura das lâminas com um scanner que pode detectar sinais fluorescentes. Aqui descrevemos métodos para gerar microarrays de antígenos personalizados. Nossas matrizes atuais são impressas com 9 pinos sólidos e podem incluir até 162 antígenos detectados em duplicata. As matrizes podem ser facilmente personalizadas alterando os antígenos na placa de origem usada pelo microarrayer. Desenvolvemos um esquema de detecção de anticorpos secundários de duas cores que pode distinguir as reatividades de IgG e IgM na mesma superfície da lâmina. O sistema de detecção foi otimizado para estudar a ligação de autoanticorpos humanos e murinos.

Os antigénios são dispostos em uma placa de 384 poços e impresso em lâminas por um microarrayer robótico como mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra as lâminas colocados num quadro com câmaras de incubação e uma corrediça digitalizada após o processamento. A Figura 3 mostra as lâminas de controlo positivas e negativas. O slide negativo apenas deve ser sondado com anticorpos secundários, ea lâmina de controlo positivo é sondada com soro ...

Descrevemos aqui um método para gerar microarrays de antígenos personalizáveis que podem ser usados para a detecção simultânea de autoanticorpos séricos IgG e IgM de humanos e camundongos. Essas matrizes permitem alto rendimento e detecção quantitativa de anticorpos contra quaisquer antígenos ou epítopos de interesse.

Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

O objetivo geral desta técnica é realizar uma triagem rápida de autoanticorpos de forma multiplexada. Este método pode ajudar a identificar questões fundamentais no campo da autoimunidade, como quais autoanticorpos estão correlacionados com diferentes estados de doença. As principais vantagens desta técnica são que os autoanticorpos podem ser triados de maneira paralela, são necessários apenas microlitros de soro e apenas microgramas de antígeno.Para gerar microarranjos de antígenos, comece diluindo antígenos em PBS até uma concentração final de 2 miligramas por mililitro. Configure um microarranjador com nove pinos para imprimir até 162 antígenos únicos em duplicata. Inclua antígenos IgG e IgM na biblioteca de antígenos como controles positivos.Inclua apenas PBS como controle negativo. Adicione 20 microlitros de cada antígeno à placa-fonte de 384 poços em grupos que espelhem a configuração da cabeça de impressão. Cubra a placa-fonte com papel alumínio e congele a placa a menos 80 graus Celsius até o momento de imprimir os arranjos.Limpe os pinos sólidos do microarranjo incubando-os em banho ultrassônico com água desionizada três vezes, por um minuto cada vez. Coloque os pinos em um suporte para secar. Em seguida, organize os pinos na cabeça de impressão do microarranjo.Para nove pinos, utilize uma configuração de três por três. Em seguida, programe o microarranjador para a corrida de impressão definindo o número de pinos na cabeça de impressão, o número de lâminas a serem impressas, o número de campos em cada lâmina e o número de pontos replicados para cada antígeno. Além disso, programe o microarranjador para sonificar os pinos em água entre diferentes grupos de antígenos.Em seguida, após descongelar a placa de origem, centrifugue-a por um minuto a 100 vezes a gravidade (×g). Coloque a placa de origem no local designado no microarranjador e remova a seção de folha de alumínio que cobre o primeiro grupo de antígenos a serem impressos. Organize as lâminas não impressas na superfície do arranjador e execute o programa de impressão. Imprima as lâminas à temperatura ambiente, com a umidade no microarranjador ajustada entre 55 e 60%. Após cada grupo de antígenos ser impresso em todas as lâminas, pause o microarranjador.Cubra os antígenos recém-impressos com folha de alumínio para evitar evaporação e descubra o próximo grupo de antígenos a ser impresso. Em seguida, continue o programa de impressão. Após todos os antígenos terem sido impressos, cubra a placa de origem com um novo pedaço de folha de alumínio e congele-a a menos 80 graus Celsius.Coloque as lâminas impressas em uma caixa de lâminas e feche-a a vácuo. As lâminas podem ser usadas no dia seguinte ou até um mês depois. Para sondar microarranjos com soros diluídos utilizando câmaras de incubação, coloque as lâminas nas molduras.Em seguida, adicione 700 microlitros de tampão de bloqueio a cada superfície do arranjo. Coloque a película adesiva sobre a estrutura e transfira para um recipiente fechado com um pedaço de tecido úmido. Incube então as lâminas a quatro graus Celsius em um agitador rotativo durante a noite.No dia seguinte, dilua as amostras de soro de um para 100 no tampão de bloqueio. Em seguida, aspire a solução de bloqueio dos arranjos e adicione 500 microlitros da amostra diluída a cada superfície de arranjo. A seguir, cubra os arranjos com filme adesivo e incube a quatro graus Celsius, sob agitação, por uma hora.Em seguida, aspire as amostras de soro dos arranjos e use o tampão de lavagem para enxaguar as superfícies dos arranjos quatro vezes, despejando o tampão sobre as lâminas e removendo-o rapidamente com um movimento brusco. Utilize 700 microlitros de tampão bloqueador para lavar cada superfície do arranjo e incube por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação. Em seguida, adicione 500 microlitros do anticorpo secundário diluído sobre cada superfície da lâmina e cubra com filme adesivo.Incube as lâminas a quatro graus Celsius com agitação durante 45 minutos. Após a incubação, aspire a mistura de anticorpo secundário das lâminas e enxágue quatro vezes, conforme acabou de ser demonstrado. Em seguida, lave as lâminas com 700 microlitros de tampão de diluição bloqueador, três vezes por 10 minutos cada.Retire os lâminas dos porta-lâminas, coloque-os em uma grade metálica para lâminas e imerja-os em PBS. Incube à temperatura ambiente com agitação orbital por 20 minutos. Coloque uma grade de lâminas em um recipiente com água desionizada por 15 segundos.Em seguida, coloque o suporte em um novo recipiente com água e incube por mais 15 segundos. Para secar as lâminas, coloque o suporte de lâminas em um adaptador de placa de ELISA na centrífuga e gire a 220 ×g e temperatura ambiente por cinco minutos. Guarde as lâminas em uma caixa à prova de luz até o momento da leitura.Para escanear as lâminas, utilize um escâner de microarranjo capaz de detectar os sinais fluorescentes SI três e SI cinco. Determine as configurações ideais do tubo multiplicador, ou PMT, pré-escaneando uma lâmina de biblioteca de antígenos completa que tenha sido incubada apenas com anticorpos secundários. Defina os valores de PMT utilizados pressionando o botão de hardware de modo que as características de IgG humana no canal SI três e as características de IgM humana no canal SI cinco apresentem uma intensidade média de fluorescência menos o fundo, ou MFIB, semelhante, o que normalmente corresponde a 40.000.Em seguida, escaneie as lâminas experimentais nos dois canais pressionando o botão de escaneamento. Salve as imagens das lâminas em ambos os canais após cada escaneamento. Usando o botão de arquivo, carregue a lâmina a ser analisada no software de microarranjo.Em seguida, utilize o botão de arquivo para carregar a lista de matriz de genes, ou arquivo GAL, que contém o layout da matriz, com as identidades das características da matriz. Posicione o modelo da matriz sobre a imagem escaneada, de modo que as características da matriz coincidam com o modelo o mais próximo possível. Pressione o botão alinhar para alinhar as características em todos os blocos com o modelo.O software então calculará a MFI menos o fundo para cada um dos antígenos. Por fim, utilize o botão arquivo para exportar os resultados como um arquivo de texto e analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto. Nesta figura, que mostra lâminas de controle positivo e negativo, a lâmina negativa é incubada apenas com anticorpos secundários, e a lâmina de controle positivo é incubada com soro de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico.Como indicado aqui, o soro controle positivo, com reatividade conhecida ao riboP, mostrou ter anticorpos IgM contra DNA de fita simples e anticorpos IgG contra riboP. Respostas lineares foram observadas com IgM em todas as diluições do soro e com IgG até um valor de MFI menos fundo de aproximadamente 30.000. Neste experimento, o arranjo é sondado com soro humano de um paciente com vasculite crioglobulinêmica, com fator reumatoide documentado, que é um anticorpo IgM contra IgG.O sinal da IgG é verde-amarelado devido à ligação da IgM no soro do paciente à IgG imobilizada na matriz. Usando apenas anticorpos secundários, nenhuma reatividade de IgM é observada contra a IgG depositada na matriz. Aqui mostrado, IgM e IgG de camundongo depositadas na matriz são detectadas apenas com anticorpos secundários anti-camundongo específicos para IgM e IgG, respectivamente.Esta figura mostra o alinhamento de uma grade modelo sobre uma imagem de matriz digitalizada, utilizando um software de análise de microarranjos. Após o alinhamento, as características da matriz podem ser analisadas para obter a intensidade mediana de fluorescência subtraída do fundo para cada característica. Uma vez dominado, o teste de microarranjos de antígenos pode ser realizado em quatro horas, se feito corretamente.Após este procedimento, outras técnicas, como ELISA, podem ser realizadas para validar os resultados obtidos a partir dos microarranjos de antígenos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imprimir microarranjos de antígenos, como sondar microarranjos de antígenos com soro e como escanear microarranjos de antígenos com um escâner. Não se esqueça de que trabalhar com soro humano pode ser perigoso, e precauções universais devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo descreve uma técnica de imunoensaio usando esferas magnéticas fluorescentes ou microesferas acopladas a diferentes antígenos para detectar simultaneamente vários isotipos de anticorpos em uma amostra de soro. O ensaio é útil para entender a soroconversão durante uma infecção ou pós-vacinação.

Ensaio de Imunoesferas Multianalita: Uma Técnica de Imunoensaio Baseada em Fluxo para Detecção Simultânea de Vários Subtipos de Anticorpos em Amostra de Soro Humano

Neste vídeo, demonstramos o processo de detecção de isotipos de anticorpos em várias amostras de soro humano usando uma lâmina de microarray impressa com subtipos antigênicos de cepas do vírus influenza.

Ensaio de microarranjo de antígeno viral para detectar isotipos de anticorpos no soro contra o antígeno viral

Este vídeo demonstra a tecnologia de matriz de glicanos impressos para analisar anticorpos antiglicanos circulantes no soro de camundongos. Os anticorpos no soro interagem com glicanos específicos no chip, o que é confirmado por imunocoloração seguida de varredura de fluorescência.

Detecção de anticorpos antiglicanos circulantes com uma matriz de glicanos impressa

O vídeo mostra a implementação da tecnologia de chip instantâneo para imunoensaios sanduíche multiplexados sem reatividade cruzada. A simples ação de encaixar duas lâminas de microarray, cada uma contendo reagentes diferentes, garante a transferência de reagentes sem contaminação cruzada e ajuda a detectar várias proteínas usando imunoensaio sanduíche.

Uma tecnologia Snap Chip para um imunoensaio sanduíche multiplexado livre de reatividade cruzada

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Aqui, apresentamos os métodos para detectar autoanticorpos ilhota humana utilizando ensaios de eletroquimioluminescência (ECL). O protocolo, usado para prever o tipo 1 diabetes, pode ser expandido em cima para detectar autoanticorpos para outras doenças auto-imunes.

Ensaios de eletroquimioluminescência para humano ilhéu auto-anticorpos

Nós apresentamos um protocolo para usar um microarray da proteína construído imprimindo antígenos da gripe em corrediças nitrocelulose-revestidas para sonda simultaneamente o soro para isotipos múltiplos do anticorpo de encontro a mais de 250 antígenos das tensões diferentes do vírus, assim permitindo a medida da amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus.

Uso de um microarray do antígeno da gripe para medir a amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus

Modelamos um ensaio de ECL multiplexado simples que combina 7 ensaios de autoanticorpos juntos. O ensaio é capaz de rastrear DM1 e várias outras doenças autoimunes, simultaneamente, incluindo doença celíaca, doença tireoidiana autoimune e síndrome poliglandular autoimune 1.

Um ensaio de eletroquimioluminescência de alto rendimento 7-plex rastreando simultaneamente diabetes tipo 1 e múltiplas doenças autoimunes

Um sistema de análise de fluxo para ensaios multiplexados baseados em contas que fornece uma leitura de dois repórteres foi usado para o desenvolvimento de ensaios sorológicos e de neutralização de anticorpos multiplex que podem medir simultaneamente anticorpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

Um sistema de análise de fluxo de fluorescência de três canais de duplo repórter foi usado para desenvolver um imunoensaio multiplex baseado em esferas que avalia simultaneamente amostras de soro para IgG e IgM eliciadas contra múltiplos antígenos de diferentes espécies de Borrelia que causam borreliose de Lyme na Europa e América do Norte.

Detecção Simultânea de Diferentes Classes de Anticorpos em um Teste Sorológico Multiplexado

Aprenda a gerar microarrays de antígenos bicolor para detectar simultaneamente autoanticorpos IgG e IgM em amostras de soro humano e murino. Esta técnica de alta vazão permite triagem rápida e quantitativa em imunologia.

Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

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