Geração de duas cores Antigen Microarrays para a detecção simultânea de auto-anticorpos IgG e IgM

O objetivo geral desta técnica é realizar uma triagem rápida de autoanticorpos de forma multiplexada. Este método pode ajudar a identificar questões fundamentais no campo da autoimunidade, como quais autoanticorpos estão correlacionados com diferentes estados de doença. As principais vantagens desta técnica são que os autoanticorpos podem ser triados de maneira paralela, são necessários apenas microlitros de soro e apenas microgramas de antígeno.

Para gerar microarranjos de antígenos, comece diluindo antígenos em PBS até uma concentração final de 2 miligramas por mililitro. Configure um microarranjador com nove pinos para imprimir até 162 antígenos únicos em duplicata. Inclua antígenos IgG e IgM na biblioteca de antígenos como controles positivos.

Inclua apenas PBS como controle negativo. Adicione 20 microlitros de cada antígeno à placa-fonte de 384 poços em grupos que espelhem a configuração da cabeça de impressão. Cubra a placa-fonte com papel alumínio e congele a placa a menos 80 graus Celsius até o momento de imprimir os arranjos.

Limpe os pinos sólidos do microarranjo incubando-os em banho ultrassônico com água desionizada três vezes, por um minuto cada vez. Coloque os pinos em um suporte para secar. Em seguida, organize os pinos na cabeça de impressão do microarranjo.

Para nove pinos, utilize uma configuração de três por três. Em seguida, programe o microarranjador para a corrida de impressão definindo o número de pinos na cabeça de impressão, o número de lâminas a serem impressas, o número de campos em cada lâmina e o número de pontos replicados para cada antígeno. Além disso, programe o microarranjador para sonificar os pinos em água entre diferentes grupos de antígenos.

Em seguida, após descongelar a placa de origem, centrifugue-a por um minuto a 100 vezes a gravidade (×g). Coloque a placa de origem no local designado no microarranjador e remova a seção de folha de alumínio que cobre o primeiro grupo de antígenos a serem impressos. Organize as lâminas não impressas na superfície do arranjador e execute o programa de impressão. Imprima as lâminas à temperatura ambiente, com a umidade no microarranjador ajustada entre 55 e 60%. Após cada grupo de antígenos ser impresso em todas as lâminas, pause o microarranjador.

Cubra os antígenos recém-impressos com folha de alumínio para evitar evaporação e descubra o próximo grupo de antígenos a ser impresso. Em seguida, continue o programa de impressão. Após todos os antígenos terem sido impressos, cubra a placa de origem com um novo pedaço de folha de alumínio e congele-a a menos 80 graus Celsius.

Coloque as lâminas impressas em uma caixa de lâminas e feche-a a vácuo. As lâminas podem ser usadas no dia seguinte ou até um mês depois. Para sondar microarranjos com soros diluídos utilizando câmaras de incubação, coloque as lâminas nas molduras.

Em seguida, adicione 700 microlitros de tampão de bloqueio a cada superfície do arranjo. Coloque a película adesiva sobre a estrutura e transfira para um recipiente fechado com um pedaço de tecido úmido. Incube então as lâminas a quatro graus Celsius em um agitador rotativo durante a noite.

No dia seguinte, dilua as amostras de soro de um para 100 no tampão de bloqueio. Em seguida, aspire a solução de bloqueio dos arranjos e adicione 500 microlitros da amostra diluída a cada superfície de arranjo. A seguir, cubra os arranjos com filme adesivo e incube a quatro graus Celsius, sob agitação, por uma hora.

Em seguida, aspire as amostras de soro dos arranjos e use o tampão de lavagem para enxaguar as superfícies dos arranjos quatro vezes, despejando o tampão sobre as lâminas e removendo-o rapidamente com um movimento brusco. Utilize 700 microlitros de tampão bloqueador para lavar cada superfície do arranjo e incube por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação. Em seguida, adicione 500 microlitros do anticorpo secundário diluído sobre cada superfície da lâmina e cubra com filme adesivo.

Incube as lâminas a quatro graus Celsius com agitação durante 45 minutos. Após a incubação, aspire a mistura de anticorpo secundário das lâminas e enxágue quatro vezes, conforme acabou de ser demonstrado. Em seguida, lave as lâminas com 700 microlitros de tampão de diluição bloqueador, três vezes por 10 minutos cada.

Retire os lâminas dos porta-lâminas, coloque-os em uma grade metálica para lâminas e imerja-os em PBS. Incube à temperatura ambiente com agitação orbital por 20 minutos. Coloque uma grade de lâminas em um recipiente com água desionizada por 15 segundos.

Em seguida, coloque o suporte em um novo recipiente com água e incube por mais 15 segundos. Para secar as lâminas, coloque o suporte de lâminas em um adaptador de placa de ELISA na centrífuga e gire a 220 ×g e temperatura ambiente por cinco minutos. Guarde as lâminas em uma caixa à prova de luz até o momento da leitura.

Para escanear as lâminas, utilize um escâner de microarranjo capaz de detectar os sinais fluorescentes SI três e SI cinco. Determine as configurações ideais do tubo multiplicador, ou PMT, pré-escaneando uma lâmina de biblioteca de antígenos completa que tenha sido incubada apenas com anticorpos secundários. Defina os valores de PMT utilizados pressionando o botão de hardware de modo que as características de IgG humana no canal SI três e as características de IgM humana no canal SI cinco apresentem uma intensidade média de fluorescência menos o fundo, ou MFIB, semelhante, o que normalmente corresponde a 40.000.

Em seguida, escaneie as lâminas experimentais nos dois canais pressionando o botão de escaneamento. Salve as imagens das lâminas em ambos os canais após cada escaneamento. Usando o botão de arquivo, carregue a lâmina a ser analisada no software de microarranjo.

Em seguida, utilize o botão de arquivo para carregar a lista de matriz de genes, ou arquivo GAL, que contém o layout da matriz, com as identidades das características da matriz. Posicione o modelo da matriz sobre a imagem escaneada, de modo que as características da matriz coincidam com o modelo o mais próximo possível. Pressione o botão alinhar para alinhar as características em todos os blocos com o modelo.

O software então calculará a MFI menos o fundo para cada um dos antígenos. Por fim, utilize o botão arquivo para exportar os resultados como um arquivo de texto e analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto. Nesta figura, que mostra lâminas de controle positivo e negativo, a lâmina negativa é incubada apenas com anticorpos secundários, e a lâmina de controle positivo é incubada com soro de um paciente com lúpus eritematoso sistêmico.

Como indicado aqui, o soro controle positivo, com reatividade conhecida ao riboP, mostrou ter anticorpos IgM contra DNA de fita simples e anticorpos IgG contra riboP. Respostas lineares foram observadas com IgM em todas as diluições do soro e com IgG até um valor de MFI menos fundo de aproximadamente 30.000. Neste experimento, o arranjo é sondado com soro humano de um paciente com vasculite crioglobulinêmica, com fator reumatoide documentado, que é um anticorpo IgM contra IgG.

O sinal da IgG é verde-amarelado devido à ligação da IgM no soro do paciente à IgG imobilizada na matriz. Usando apenas anticorpos secundários, nenhuma reatividade de IgM é observada contra a IgG depositada na matriz. Aqui mostrado, IgM e IgG de camundongo depositadas na matriz são detectadas apenas com anticorpos secundários anti-camundongo específicos para IgM e IgG, respectivamente.

Esta figura mostra o alinhamento de uma grade modelo sobre uma imagem de matriz digitalizada, utilizando um software de análise de microarranjos. Após o alinhamento, as características da matriz podem ser analisadas para obter a intensidade mediana de fluorescência subtraída do fundo para cada característica. Uma vez dominado, o teste de microarranjos de antígenos pode ser realizado em quatro horas, se feito corretamente.

Após este procedimento, outras técnicas, como ELISA, podem ser realizadas para validar os resultados obtidos a partir dos microarranjos de antígenos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como imprimir microarranjos de antígenos, como sondar microarranjos de antígenos com soro e como escanear microarranjos de antígenos com um escâner. Não se esqueça de que trabalhar com soro humano pode ser perigoso, e precauções universais devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.