Ensaios de eletroquimioluminescência para humano ilhéu auto-anticorpos

O objetivo geral deste ensaio de eletroquimioluminescência é detectar anticorpos de ilhotas em diabetes tipo um autoimune, com alta sensibilidade e alta especificidade. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do diabetes tipo um, como o tempo de início da autoimunidade das ilhotas e a previsão de alto risco para diabetes tipo um. A principal vantagem desta técnica é um radioensaio mais sensível, mais específico da doença e não radioativo em comparação com os radioensaios padrão atuais.

A implicação dessa técnica se estende à previsão e diagnóstico de diabetes tipo um, porque esses autoanticorpos das ilhotas aparecem meses a anos antes da doença clínica sintomática. Embora esse método possa fornecer informações sobre a previsão do diabetes tipo um, ele também pode ser aplicado para estudar outras doenças autoimunes, como autoanticorpos para transglutaminase para doença celíaca, TPO e tireoglobulina para doença autoimune da tireoide e várias outras. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando descobrimos que a técnica é baseada em alta sensibilidade e não radioatividade.

Em contraste com o método ELISA convencional, que não funciona bem para a detecção de autoanticorpos de ilhotas. A demonstração visual desse método é crítica, pois o ensaio de autoanticorpos de insulina com tratamento com ácido sérico é difícil de ser descrito no texto. Demonstrando o procedimento estará Yong Gu, um pós-doutorado do meu laboratório.

Primeiro, misture o autoantígeno da ilhota humana com biotina ou SULFO-TAG na proporção de um a cinco molares em um tubo. E cubra o tubo com papel alumínio, pois ambas as etiquetas são sensíveis à luz. Em seguida, incube o tubo por uma hora em temperatura ambiente.

Enquanto isso, quando a incubação está em andamento, prepare a coluna de rotação com solução salina tamponada com fosfato duplo. Em seguida, centrifugue a coluna a 1.000 vezes a gravidade por dois minutos de cada vez. Em seguida, centrifugue a mistura de autoantígeno na coluna de rotação a 1.000 vezes a gravidade por dois minutos.

Em seguida, alíquota e armazene o antígeno marcado a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, use a concentração racional do antígeno marcado com biotina SULFO-TAG com base no ensaio quadriculado para o tampão de antígeno, para preparar três mililitros de solução de antígeno por placa de 96 poços. Em seguida, em cada poço, adicione quatro microlitros de soro e ajuste o volume final para 20 microlitros com uma dobra de solução salina tamponada com fosfato.

Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de antígeno marcada em cada poço. E cubra a placa com folha de vedação para evitar a luz. Em seguida, transfira o prato para uma coqueteleira em temperatura ambiente por duas horas.

Assim que o shaker parar, deixe o prato a quatro graus Celsius na geladeira por 18 a 24 horas. Agora, misture 15 microlitros de soro com 18 microlitros de ácido acético 0,5 molar para cada amostra e incube o mesmo em temperatura ambiente por 45 minutos. Com base no ensaio quadriculado, use a concentração racional do antígeno marcado com biotina SULFO-TAG para preparar a solução de antígeno.

Em seguida, alíquota de 35 microlitros do tampão antígeno em cada poço de uma nova placa de PCR. Pouco antes de completar o curso de incubação da mistura de soro, adicione 3,8 microlitros de um tampão Tris molar em PH nove, ao lado de cada poço na placa de antígeno. Terminada a incubação, transfira rapidamente 25 microlitros do soro tratado com ácido acético em cada poço da placa de antígeno e agite a solução.

Em seguida, cubra a placa de PCR com papel alumínio para evitar a luz e coloque em um shaker em temperatura ambiente por duas horas. Uma vez feito isso, transfira a placa a quatro graus Celsius na geladeira e incube por 18 a 24 horas. Remova uma placa de estreptavidina da geladeira a quatro graus Celsius e deixe a placa atingir a temperatura ambiente.

Depois que a placa de estreptavidina atingir a temperatura ambiente, adicione 150 microlitros de 3% de bloqueador A em cada poço e cubra a placa de PCR com folha de vedação e incube na geladeira durante a noite. No dia seguinte, remova a placa de estreptavidina da geladeira e expulse o tampão dos poços. Em seguida, seque o prato colocando-o de cabeça para baixo em algumas toalhas de papel para que o tampão restante fique de molho.

Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão PBST de uma dobra para lavar o poço por três lavagens consecutivas. Em seguida, transfira 30 microlitros de antígeno sérico incubado em cada poço da placa de estreptavidina e cubra a placa com papel alumínio para evitar a luz. Em seguida, transfira o prato para uma coqueteleira em temperatura ambiente por uma hora.

Após uma hora, descarte o antígeno sérico incubado da placa e adicione 150 microlitros de tampão PBST de uma dobra para lavar o poço por três vezes. Quando a lavagem terminar, adicione 150 microlitros de tampão de leitura a cada poço para ler em um leitor de placas. Antes de analisar quaisquer amostras desconhecidas, o ponto de corte do ensaio para cada ensaio de autoanticorpos foi estabelecido testando cerca de 100 pacientes com diabetes tipo um e cerca de 100 controles saudáveis.

Em seguida, uma curva ROC foi plotada para determinar o índice ótimo do limite superior da normal para o ensaio GADA, que foi de 0,023, de modo a obter a melhor sensibilidade e especificidade. Em seguida, o resultado da amostra ignorada foi calculado por meio de uma equação derivada de padrões de controle positivos altos, positivos baixos e negativos. Em seguida, um gráfico foi traçado para determinar os sinais obtidos no ensaio de autoatibody das ilhotas na incubação do anticorpo monoclonal de insulina com soro humano normal na presença e ausência de tratamento ácido.

O gráfico mostra que o sinal é marcadamente bloqueado após a adição de soro normal na ausência de tratamento ácido. Pelo contrário, o sinal obtido é comparativamente maior quando o soro é submetido a tratamento ácido antes da incubação com o anticorpo monoclonal de insulina. Um gráfico semelhante também foi plotado para determinar os sinais obtidos usando o paciente estrangeiro Sera na presença e ausência de tratamento ácido.

O tratamento do soro do paciente com ácido antes da incubação com o anticorpo aumenta significativamente os sinais no ensaio de autoanticorpos das ilhotas quando comparado na ausência de tratamento. Uma vez dominada, essa técnica pode ser facilmente executada para várias centenas de amostras em um dia, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar o ensaio quadriculado para cada ensaio de autoanticorpos para otimizar a condição do ensaio.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do diabetes tipo um autoimune para previsão e prevenção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da facilidade de realizar este ensaio. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de soro pode ser perigoso e contagioso.

Precauções para evitar o contato direto com a pele devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.