Name: Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a desenvolver um modelo hepático tridimensional recelularizado com células HepG2 para estudar vetores virais AAV. Este método permite analisar transferência gênica em ambiente humanizado, reduzindo o uso de animais em pesquisas de terapia gênica.

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Os autores agradecem a Bernd Krostitz pela assistência técnica, Radoslaw Kedzierski pelas contribuições iniciais ao projeto, Erik Wade pela revisão e comentários úteis e Prof. Heike Walles por fornecer o biorreator e compartilhar sua valiosa experiência com descelularização de órgãos. Também agradecemos o financiamento do projeto e a publicação pela Universidade de Tecnologia de Berlim.

NOTA: RL obtido aprovação ética para a explantação de órgãos do Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Os fígados foram explantadas de ratos Wistar. A veia cava inferior e a veia porta do fígado foram canulada com uma cânula de 22 L. Os métodos para a descelularização de fígados explantados foram 4,5 As matrizes extracelulares aqui utilizados foram obtidos por perfusão excessiva de um fígado de rato com 1% de desoxicolato de sódio descrito anteriormente.. 1. Recellularization da Matriz Extracelular (ECM) de um rato fígado <ol><li> Expansão da hepática HepG2 linha celular <ol><li> Cultura da linha celular de carcinoma hepatocelular HepG2 no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, glutamina 2 mM, e 2 mM de penicilina e estreptomicina, cada. </li><li> Semente 1,5 x 10 7 células em frascos T175 e crescer as células a 37 ° C e 5% de CO 2 </sub&gt;. Células colheita após 4 dias por tripsinização durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Girar as células a 300 xg e ressuspender-los em 4 ml de PBS e contar as células com uma câmara de Neubauer sob um microscópio. Um frasco T175 irá produzir cerca de 4,5 x 10 7 células. NOTA: Certifique-se a cultura contém o número de células suficientes para recelularização do ECM fígado de rato com 6 x 10 8 células HepG2 por ECM (10 x 175 cm 2 frascos de cultura com 4-5 x 10 8 células cada). </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig1.jpg" /> Figura 1. Sistema de biorreator. A) Este sistema biorreator foi feito por encomenda. Mantém os modelos de órgãos a 37 ° C e 5% de CO 2. Os caudais das bombas peristálticas pode ser regulado individualmente. B) O fígado é colocado numa câmara de crescimento e ligared ao circuito de perfusão, que consiste de uma bomba peristáltica, um reservatório médio, uma armadilha de bolhas e um sensor de pressão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="2"><li> Recellularization do ECM <ol><li> Configure o sistema de biorreator, contendo uma câmara de fígado de perfusão, um sistema de perfusão, um reservatório de meio e um borbulhador. Esteriliza-se o sistema de bioreactor (121 ° C, 15 min). </li><li> Ligar o sistema de biorreactor com uma bomba peristáltica e colocá-lo em uma incubadora proporcionar condições adequadas (37 ° C, 5% CO 2). Coloque descelularizados andaimes de fígado de rato 8 na câmara de perfusão do fígado do sistema de bioreactor (Figura 1). </li><li> Ligue a veia porta e veia cava canulada usando grampos de tubo ao sistema de perfusão. Equilibrar andaime com 150 ml de meio RPMI (como descrito em 1.1)durante 5 d com um caudal de 1,25 ml / min. </li><li> Desligue o andaime fígado de circuito os meios de comunicação e inocular o andaime com 3 x 10 8 células HepG2 (em 5 mL) através da veia portal utilizando uma seringa de 5 ml, evitar a formação de bolhas de ar e permitir que as células para repovoar a ECM através da sua incubação durante 1 hr no andaime com a bomba desligada. </li><li> Aumentar gradualmente a taxa de fluxo através do ajuste da bomba, começando com 1,25 ml / min durante 10 min; 2,5 ml / min durante 20 min e, finalmente, 3,75 mL / min durante 30 min. </li><li> Repita os passos 1.2.4-1.2.5 para atingir um número de células total de 6 x 10 8. </li><li> Executar o sistema de bioreactor com um caudal de 3,75 ml / min. Cultura do fígado de rato repovoados por 2 semanas. NOTA: Substituir um terço do meio com meio fresco (50 ml) a cada dois dias. Amostra do meio de cultura para medição dos parâmetros fisiológicos, tais como a actividade de lactato desidrogenase, o pH de amostras do meio e da concentração de glucose e lactato. </li></ol></li></ol> 2. A transdução do repovoados de Fígado de Rato <ol start="1"><li> Produção em larga escala de AAV vetores <ol><li> Produzir, purificar e quantificar os vectores de AAV, tal como descrito anteriormente: 11 <ol><li> Resumidamente, produzir vectores AAV em garrafas de rolos e purificá-los por centrifugação em gradiente de iodixanol. Remover o iodixanol residual por filtração em colunas PD10 filtração em gel. Determinar a concentração de vector de AAV por qPCR utilizando ADN genómico de AAV como um padrão. NOTA: O auto-complementar, pseudotipado AAV2 / 6 vector utilizado no presente estudo codificado EmGFP como um repórter para demonstrar a eficácia de transdução e uma cassete de expressão de shRNA para o knockdown de um gene expresso endogenamente (ciclofilina B humana (hCycB), Figura 2) . Certifique-se de uma quantidade suficiente de vetores scAAV pseudotipados de serotipo 6 (2,7 x 10 13 vectores AAV por modelo de fígado). </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig2.jpg" /> Figura 2. Mapa do auto-complementar, pseudotipado AAV2 / 6 vector utilizado no presente estudo. O genoma consiste em as repetições terminais invertidas (ITR) de AAV2 e codifica EmGFP sob o controlo do promotor de CMV, assim como um shRNA sob controle de um promotor U6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="2"><li> A transdução do fígado Modelo <ol><li> Ajustar a solução de vector de AAV para uma concentração final de 2,7 x 10 13 genomas vectoriais em 5 mL através da adição do respectivo volume de PBS. </li><li> Desligue o fígado a partir do circuito dos meios de comunicação através da remoção do tubo da cânula. Ligar uma seringa de 5 ml para a cânula da veia porta e injectar a solução de vector de AAV completo (5 ml). NOTA: OptionallY, adicionar vermelho de fenol (5 ug / ml) a seguir a distribuição da solução de vector de AAV por todo o fígado. </li><li> Incubar durante 1 hora, sem bombeamento. Aumentar gradualmente a taxa de fluxo, começando com 1,25 ml / min durante 10 min; 2,5 ml / min durante 20 min e 3,75 ml / min durante 30 min. Cultura do fígado de rato repovoados mais de 6 dias. NOTA: Substituir um terço da média tal como consta da nota sob 1.2.7 </li></ol></li></ol> 3. Avaliação do Fígado repovoados transduzidas Rat <ol start="1"><li> Hematoxilina e eosina (HE) e Análise imuno-histoquímica <ol><li> Tome amostras (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) de cada lóbulo do fígado usando um bisturi. </li><li> Incubar as amostras (a partir de 3.1.1) em 4% de paraformaldeído (PFA) + solução de sacarose a 4% durante 1,5 horas a 4 ° C. (Atenção: PFA é tóxico e cancerígeno Sempre mantenha PFA dentro de um exaustor e usar vestuário de protecção adequado..) Lavar três vezes com PBS (1 min por etapa de lavagem) e incubar em 8%durante a noite em sacarose a 4 ° C. </li><li> Despeje fixação meio para cryomolds plástico, coloque as amostras em que fixa livre meio de bolhas de ar. Adicionar meio de fixação até amostra é bem cobertos. Loja incorporado amostras a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Preparar material crio-secções (10 mm) com um Criótomo 12. Avaliar recelularização pela hematoxilina + eosina 8. Avaliar a eficiência de transdução por coloração imuno-histoquímica para o interesse gene-de-(aqui: EmGFP). </li></ol></li><li> amostragem biológica molecular <ol><li> Amostra de cada lobo do fígado com um perfurador de biopsia (4 mm de diâmetro). Isolar RNA total, DNA e proteínas de acordo com as instruções do fabricante para a avaliação da expressão do transgene de EmGFP e hCycB derrubar 8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+spheroid+culture+of+human+liver+hepatocellular+carcinoma+cell+line+cells+demonstrate+distinct+global+gene+expression+patterns+and+functional+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Butler, D., Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientists+in+the+dark+after+French+clinical+trial+proves+fatal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal.</a> Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).</li>
<li>Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+penetrate+human+solid+tumor+tissue+in+vivo+more+effectively+than+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Decellularization+of+Rat+Livers+in+an+Oscillating-pressure+Perfusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device.</a> J. Vis. Exp. (102), e53029(2015).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).</li>
<li>Wagner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+three-dimensional+humanized+liver+model+for+the+study+of+viral+gene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors.</a> J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).</li>
<li>Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+gene-based+therapies%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).</li>
<li>Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+adeno-associated+virus+vectors+for+RNA+interference+applications+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+and+purified+genomic+adeno-associated+virus+DNA+as+a+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard.</a> Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).</li>
<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissected+region-specific+gene+expression+analysis+with+methacarn-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR.</a> J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os fígados 3D reconstituídos descritos aqui fornecem um modelo para estudar vectores virais num sistema humanizado. Repovoamento da ECM de um fígado de rato com uma linha de células de carcinoma hepatocelular humano gera um sistema vascularizado que permite o estudo de grandes biológicos. Estes resultados dão uma prova de conceito de que o modelo de fígado reconstituída pode ser eficazmente transduzidas com um vector viral. Para as experiências apresentadas aqui, cada lóbulo do fígado foi transduzida pelo vector de AAV. No entanto, em algumas experiências preliminares, foram lóbulos individuais não repovoada com células. Por conseguinte, é importante para evitar que os detritos de células ou outros componentes de oclusão do sistema vascular. Para testar se a todos os lóbulos pode ser perfundido, um corante não-tóxico, tal como vermelho de fenol pode ser lavada por meio do modelo de fígado. Outra questão fundamental é manter o andaime fígado estéril. Embora o tratamento com antibióticos é etanol ou disadvantageous para o sistema vascular, a irradiação da matriz extracelular com γ-radiação preservou os vasos e esterilizados a amostra. Além disso, o tamanho de fígados explantados será diferente, de modo que o número de células utilizadas para o processo e o tempo recelularização repovoamento pode ter que ser ajustada para se obter resultados reprodutíveis. Os fígados de ratos utilizados no presente estudo são comparativamente grande e necessitam de grandes quantidades de células e reagentes de ensaio (por exemplo, vectores de AAV). Além disso, o processo de repovoamento levou mais do que duas semanas. Isso limita o número de repetições que pode ser feito com um esforço razoável. Estamos actualmente a estabelecer o modelo de fígado de rato, que são apenas cerca de um quinto do volume de fígados de rato, permitindo o uso de um número de células e reagentes de teste menos. Embora proporcional escala para baixo do número de células parece razoável, as quantidades exactas devem ser determinadas em furtseus experimentos. Outra desvantagem do presente modelo é o uso da linha celular HepG2 hepatocelular. As experiências estão em curso para desenvolver o uso de hepatócitos diferenciados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas, que irá fornecer um modelo fisiologicamente mais relevante. Além disso, o fígado é constituído por vários tipos de células para além dos hepatócitos, por exemplo, células de Kupffer e sinosoids. Nós assumimos que os diferentes tipos de células vão repovoar seus ambientes naturais quando um ECM é repovoados com vários tipos de células. O modelo de fígado 3D combina várias vantagens. A principal desvantagem do convencional em modelos in vivo é que fisiologia animal difere substancialmente da fisiologia humana. efeitos secundários tóxicos do tratamento de um paciente humano pode, portanto, permanecem sem serem detectados. Este defeito pode ser superado através da reconstituição o modelo 3D fígado com células humanas que reflecte mais intimamente a biologia de Hupacientes homem. A segunda vantagem do modelo de fígado é a sua contribuição para o bem-estar animal. Embora os componentes de origem animal são necessários para as experiências de reconstituição, a abordagem ainda segue os objectivos do princípio 3R (substituição, redução, refinamento), como animais excedentes podem ser usados que foram sacrificados para outras experiências com animais, ou seja, não são necessários animais adicionais e a abordagem evita completamente o sofrimento dos animais, que é frequentemente associados com experimentos in vivo. Esferóides são uma ferramenta alternativa para estudar processos celulares em um sistema 3D. No entanto, não são esferóides vascularizado para que grandes substâncias e produtos biológicos não penetram profundamente nas partes interiores da estrutura. Estes problemas foram ultrapassados ​​com o modelo de fígado 3D vascularizado. Nas experiências aqui descritas, os vectores de AAV foram investigados, uma vez que estão entre os candidatos mais promissores para o gene terapêuticoaplicações. Como numerosos genes abordagens terapêuticas visando determinar um fígado, por exemplo, para o tratamento de infecções com os vírus da hepatite ou de deficiência de alfa-1-antitripsina, o fígado 3D pode ser utilizado no processo de desenvolvimento destes vector de AAV. É, claro, também adequadas para o estudo de outros vectores virais, por exemplo, hepatotrópicos vectores adenovirais. Além disso, ele pode ser usado para estudar os vírus das hepatites infecciosas, tais como vírus da hepatite B ou C. Ele pode, por exemplo, ser utilizada para conceber novas estratégias antivirais. Além disso, os modelos de órgãos 3D representam ferramentas promissoras para o desenvolvimento de novas terapias citostáticos para tratar o cancro e para a realização de estudos toxicológicos. No longo prazo, fígados artificiais podem ser usados ​​na medicina regenerativa como transplantes. Tomados em conjunto, o modelo de fígado 3D oferece uma ampla gama de aplicações em biologia da infecção e outros campos da pesquisa biomédica.

A maioria das pesquisas biomédicas atuais depende de uma das duas abordagens, experimentos de cultura de células bidimensionais (2D) ou modelos animais, que são tridimensionais (3D) por sua própria natureza. No entanto, essas abordagens têm algumas desvantagens graves. As células cultivadas em cultura 2D demonstraram diferir nos padrões de expressão gênica e fisiologia celular daquelas cultivadas em condições 3D. 1 Os modelos animais, além de estarem associados a preocupações éticas, muitas vezes não modelam bem a fisiologia humana. Embora a ausência de efeitos tóxicos óbvios de um composto deva ser confirmada em modelos animais antes da primeira administração em humanos, vários casos foram documentados em que efeitos adversos graves, às vezes fatais, ocorreram em ensaios clínicos. algarismo
Para superar essas deficiências, modelos de órgãos 3D ex vivo humanizados tornaram-se importantes ferramentas de pesquisa. Quando cultivadas em condições adequadas, as células se automontam em estruturas 3D conhecidas como esferoides. No entanto, esses esferóides não possuem um sistema vascular, o que limita a distribuição de pequenos compostos moleculares, grandes biológicos e vetores virais. Por exemplo, os vetores adenovirais transduzem apenas as camadas celulares externas de esferoides preparados a partir de glioblastomas humanos. 3 Uma solução para esse problema é o uso de um modelo de órgão contendo um sistema vascular. Para esse fim, o órgão de interesse pode ser explantado de um animal e as células animais podem ser substituídas por células humanas. Vários métodos de descelularização de fígados de animais por tratamento com detergentes ou colato de sódio têm sido descritos. 4-6 A matriz extracelular (MEC) resultante abriga citocinas e fatores de crescimento que regulam vários processos celulares. 7 Pode ser usado como um andaime para recelularização com células humanas para obter um modelo de órgão funcional.
Em um estudo recente, usamos um modelo de fígado 3D humanizado para estudar a distribuição e a expressão transgênica de um vetor de vírus adeno-associado (AAV). 8 Os vetores AAV pertencem aos vetores virais mais promissores para aplicações terapêuticas genéticas. 9 A primeira, e até agora única, intervenção terapêutica gênica aprovada no mundo ocidental usa um vetor AAV para a transferência de lipoproteína lipase. 10

<table><tbody><tr><td>Incubadora</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Flange com ranhura</td><td>Duran</td><td>2439454</td><td>modificado pelo gaffer</td></tr><tr><td>O-Ring Transparente</td><td>Duran</td><td>2922551</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira de Liberação Rápida</td><td>Duran</td><td>2907151</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Flange Plana</td><td>Duran</td><td>2429857</td><td>modificado por gaffer</td></tr><tr><td>Tubo de rosca</td><td>Duran</td><td>2483802</td><td>modificado por gaffer</td></tr><tr><td>Tubo de rosca Duran</td><td></td><td>2483602</td><td>modificado por gaffer</td></tr><tr><td>Anel de vedação de silicone</td><td>Duran</td><td>2862012</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de rosca</td><td>Duran</td><td>2924013</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de rosca</td><td>Duran</td><td>2924008</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de rosca com abertura</td><td>Duran</td><td></td><td></td>2922709</tr><tr><td>Tampa de rosca com abertura</td><td>Filtro</td><td>de 2922705</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Duran Sarstedt</td><td>831.826.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicone</td><td>VWR</td><td>228-1500</td><td></td></tr><tr><td>Conector de tubo</td><td>Ismatec</td><td>ISM556A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo biocompatível</td><td>Ismatec</td><td>SC0736</td><td></td></tr><tr><td>T175 frascos de cultura</td><td>Greiner bio-one</td><td>660 160</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td> <td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>glutamina</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td> <td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td> <td>L0940-100</td><td></td></tr><tr><td>penicilina / estreptomicina</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td> <td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal de bezerro</td><td>cc pro</td><td>S-10-M</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Weckert-Labortechnik</td><td>600001</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 180</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold 15 x 15 x 5 mm</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia 4 mm</td><td>pfm médico</td><td>48401</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin miRNA</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740971.10</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA/DNA Buffer Set</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740944</td><td></td></tr></tbody></table>

estudo de vetores virais em um tridimensional do fígado modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular hepg2

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Este protocolo descreve a geração de uma imagem tridimensional (3D) modelo ex vivo de fígado e sua aplicação para o estudo e o desenvolvimento de sistemas de vectores virais. O modelo é obtida por repovoar a matriz extracelular de um fígado de rato descelulada com uma linha de células de hepatócitos humanos. O modelo permite estudos num sistema de células 3D vascularizado, substituindo experiências potencialmente prejudiciais com animais vivos. Outra vantagem é a natureza humanizada do modelo, o que está mais perto de fisiologia humana do que os modelos animais. No presente estudo, nós demonstramos a transdução do fígado com este modelo um vector viral derivado de vírus adeno-associados (AAV vector). O circuito de perfusão que fornece o modelo de fígado em 3D com a mídia proporciona um meio fácil de aplicar o vetor. O sistema permite a monitorização dos principais parâmetros metabólicos do fígado. Para análise, amostras de tecido pode ser feita para determinar a extensão de recellularização por meio de técnicas histológicas. Distribuição do vector de vírus e a expressão do transgene entregue pode ser analisada por PCR quantitativa (qPCR), transferência de Western e imuno-histoquímica. Numerosas aplicações do modelo vector em pesquisa básica e no desenvolvimento de aplicações de terapia génica pode ser visionado, incluindo o desenvolvimento de novas terapias antivirais, a investigação do cancro, e o estudo de vectores virais e os seus efeitos secundários potenciais.

Para a avaliação da extensão da recelularização, crio-secções foram preparados a partir de cada lóbulo de cada modelo de fígado repovoados. As secções foram depois analisadas por hematoxilina e eosina. Como pode ser visto na Figura 3, cada um dos lóbulos dos três modelos de fígado, denotado como TLM1, TLM2 (transduzidas modelos fígado 1 2) e Ctrl (modelo de fígado de controle que foi repovoados, mas não transduzidas), foram repovoada com células HepG2. Esta linha celular de carcinoma hepatocelular foi estabelecida a partir do tecido tumoral de um menino argentina 15 anos de idade. Algumas áreas dos modelos de fígado foram mais intensamente do que outras repovoados. As razões para estas variações continuam a ser determinado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig3.jpg" /> Figura 3. hematoxilina e eosina de cada lóbulo dos três analisados modelos de fígado TLM1 + 2:. Fígado transduzidasmodelos 1 e 2; modelo de controle de fígado Ctrl .: que foi repovoados mas não transduzidas. Barra de escala: 200? m. (Re-impresso com a permissão da Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> No passo seguinte, a transdução dos modelos de fígado foi avaliada. Para este fim, o ADN foi preparado a partir de 28 biópsias de cada um dos modelos de fígado e o título de vector foi quantificada por qPCR. Em média, 55 e 90 genomas vectoriais internalizadas por célula (VG / célula) foram medidas para os dois modelos de fígado transduzidas. Experiências em cultura celular 2D têm mostrado 30 VG / célula são suficientes para a expressão do transgene forte e silenciamento mediado por RNAi. Produção de EmGFP foi analisado por RT-PCR e transferência de Western. De facto, a expressão do repórter foi detectada em 80-90% das biópsias sobre os níveis de mRNA e proteína, respectivamente.8 Para obter uma imagem abrangente da eficiência de transdução, crio-secções foram immunohistologically analisados. Como pode ser visto na Figura 4, as áreas do modelo de fígado que foram repovoados com sucesso, tal como visualizado por coloração com DAPI, também deram fortes sinais fluorescentes na análise imuno-histoquímica de expressão EmGFP. Como esperado, o modelo de fígado de controlo, não tratados com os vectores de AAV, não mostraram qualquer expressão EmGFP. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig4.jpg" /> Figura 4. A análise imuno-histoquímica de células que expressão EmGFP repopulated os modelos de fígado foram visualizadas por coloração com DAPI (azul).; EmGFP expressão foi visualizado por coloração com imunoquímico (vermelho). TLM1 + 2: modelos de fígado transduzidas 1 e 2; modelo de controle de fígado Ctrl .: que foi repovoados mas não transduzidas. Barra de escala: 200? m. (Re-impresso com permissãode Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Em um teste final, knockdown mediada por AAV de hCycB foi analisada por qRT-PCR. O knockdown de hCycB verificou-se ser entre 70 e 90%, em média, em todos os lóbulos dos dois modelos de fígado transduzidas (Figura 5). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig5.jpg" /> Figura 5. knockdown mediada por ARNi do hCycB fígado em modelos 3D transduzidas com AAV. Silenciamento de hCycB foi determinada por qRT-PCR. Os valores médios e desvios padrão (SD) foram calculados para todas as amostras de cada modelo 3D fígado transduzidas (TLM1 e 2, respectivamente) e normalizadas para o valor médio do controlo não transduzidas (Ctrl.). (Re-impresso com a permissão de Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A matriz extracelular recelularizada de um fígado de rato descelularizado pode ser usada como um modelo ex vivo tridimensional humanizado para estudar a distribuição e expressão transgênica de um vírus ou vetor viral.

Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um modelo tridimensional de fígado para estudar vírus e vetores virais. Este método permite o estudo de processos biológicos em um sistema tridimensional vascularizado com células humanas, que diferem em sua fisiologia das células de roedores em modelos de camundongo ou rato. Além disso, representa um passo para melhorar o bem-estar animal, pois evita experimentos com animais vivos e, a longo prazo, tem a intenção de substituir completamente os componentes animais.Embora tenhamos desenvolvido este método para estudar vetores virais para transferência gênica, ele também pode ser aplicado ao estudo de vírus infecciosos e outras áreas de pesquisa, como a pesquisa sobre câncer. A demonstração do procedimento será feita por Viola Rohrs, técnica do meu laboratório. Por questões de bem-estar animal, apenas animais excedentes foram utilizados no presente estudo, os quais foram sacrificados para outros experimentos com animais, ou seja.não foram necessários animais adicionais para obter os esqueletos hepáticos. Para começar, expanda primeiramente a linhagem celular hepática Hep G2. Semeie 15 milhões de células em frascos T175 com 30 mililitros de meio contendo 10% de soro fetal bovino e dois milimoles de glutamina, penicilina e estreptomicina. Após quatro dias de cultivo, utilize cinco minutos de exposição à solução de tripsina em condições de cultivo para soltar as células e, em seguida, colete-as.Em seguida, centrifugue as células a 300 Gs durante três minutos. Depois, re-suspenda-as em quatro mililitros de PBS e realize uma contagem celular. Cada frasco deve render cerca de 45 milhões de células.São necessárias 600 milhões de células para recelularizar uma matriz extracelular (ECM) de fígado de rato. Para recelularizar a ECM, primeiro prepare o sistema de biorreator contendo uma câmara de perfusão hepática, um sistema de perfusão, um reservatório de meio e um captador de bolhas. Existem duas etapas críticas no procedimento de recelularização.Uma delas é evitar aprisionar bolhas de ar no sistema de perfusão. A segunda é que todo o sistema deve ser mantido estéril. Primeiro, esterilize estes componentes do sistema de biorreator a 121 graus Celsius por 15 minutos.Em segundo lugar, preencha os tubos e a câmara de perfusão esterilizada com meio. Em seguida, coloque o suporte de fígado de rato descelularizado dentro da câmara de perfusão hepática. O próximo passo é usar grampos de tubo para conectar a veia porta canulada ao sistema de perfusão.Agora coloque o sistema de biorreator no incubador e conecte-o a uma bomba peristáltica. Em seguida, equilibre a matriz com 150 mililitros de meio suplementado durante cinco dias. Ajuste o fluxo para 1,25 mililitro por minuto.Após cinco dias, desconecte o sistema de biorreator da bomba e transfira-o para uma cabine de segurança biológica estéril. Desconecte o suporte hepático do circuito de meio. Em seguida, carregue uma seringa com cinco mililitros de meio contendo 300 milhões de células Hep G2 e injete as células pela veia porta, evitando a formação de bolhas de ar.Em seguida, permita que as células repovoem a MEC por uma hora sem ligar a bomba. Após uma hora, inicie a bomba em 1,25 mililitros por minuto. Após 10 minutos, aumente a pressão para 2,5 mililitros por minuto.Após mais 20 minutos, ajuste a bomba à velocidade de operação de 3,75 mililitros por minuto. Após 30 minutos na velocidade máxima da bomba, desligue a bomba, adicione mais 300 milhões de células e deixe as células povoarem a MEC durante uma hora. Após uma hora, aumente gradualmente a circulação por meio de ajustes incrementais na velocidade da bomba, como antes.Agora, deixe o cultivo recelularizar o fígado ao longo de duas semanas. A cada dois dias, substitua 50 mililitros do meio e meça os parâmetros fisiológicos a partir de uma amostra do meio usado. A produção de vetores AAV é um procedimento complicado que envolve muitas etapas, as quais são resumidas no protocolo textual.Nesta seção do vídeo, algumas das etapas cruciais são demonstradas. Primeiro, produza, purifique e quantifique os vetores AAV. Resumidamente, produza os vetores AAV em frascos rotativos e purifique-os por centrifugação em gradiente de iodixanol.Remova o iodixanol residual por filtração em colunas de filtração em gel PD10. Em seguida, determine a concentração do vetor AAV por QPCR utilizando DNA genômico de AAV como padrão. Um total de 27 trilhões de vetores AAV são necessários por modelo.Agora, transduza o modelo de fígado. Primeiro, obtenha 27 trilhões de vetores em cinco mililitros de PBS carregados em uma seringa. Fenol vermelho pode ser adicionado a 5 microgramas por mililitro.Em seguida, desconecte o fígado do circuito de meio e injete os vetores no sistema. Após a injeção, incube o sistema por uma hora sem bombeamento. Em seguida, aumente gradualmente o fluxo conforme descrito anteriormente.Posteriormente, enquanto o fígado transduzido é incubado por seis dias, troque 50 mililitros do meio a cada dois dias. Usando um bisturi, corte amostras de cada lobo hepático com cerca de meio centímetro de espessura e de 1,5 a dois centímetros de comprimento. Incube os fragmentos em paraformaldeído 4% com sacarose 4% durante 90 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, lave a amostra três vezes com PBS, durante um minuto por lavagem. Após as lavagens, incube as amostras durante a noite em sacarose a 8% a quatro graus Celsius. No dia seguinte, carregue as amostras em moldes criogênicos contendo algum meio de fixação.Evite introduzir bolhas de ar. Após o carregamento, cubra completamente as amostras com meio de fixação e coloque-as a menos 80 graus Celsius. Após congelar, prepare cortes criostáticos de 10 mícrons das amostras utilizando um criotomo.Colorir as amostras conforme necessário para confirmar a recelularização. Para análise de expressão gênica, coletar amostras utilizando um punch de biópsia de quatro milímetros. Para avaliar a recelularização, cortes criostáticos foram corados com hematoxilina e eosina.Lóbulos de dois fígados transduzidos e de um fígado controle, que foi recelularizado mas não transduzido, foram todos repovoados com células Hep G2. A expressão de RNA e o título do vetor foram quantificados a partir de 28 biópsias por punção de cada modelo de fígado. Nos dois modelos de fígado transduzidos, foram medidos 55 e 90 genomas virais por célula, o que corresponde a uma quantidade suficiente de vetor para induzir o silenciamento gênico.Nenhum genoma foi medido no controle, como esperado. A expressão de EmGFP foi analisada por RT-PCR e por western blotting. A maioria das biópsias mostrou expressão de mRNA de EmGFP e expressão proteica de EmGFP.A imunomarcação das crioseções mostrou que, em todos os locais onde o modelo foi recelularizado com sucesso, também era possível observar a expressão de EmGFP. Isso indica uma boa expressão gênica do AAV. Em seguida, o silenciamento mediado por AAV da ciclofilina B humana foi analisado por RT-PCR quantitativa.A redução média da ciclofilina B humana foi entre 70 e 90% em todos os lobos dos dois fígados transduzidos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores estudarem a distribuição de vírus e vetores virais no sistema orgânico tridimensional vascularizado. Tais estudos ajudarão a aprimorar as técnicas atuais de transferência gênica e a desenvolver novas estratégias antivirais.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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De Alta Eficiência Transdução de células de câncer de fígado por recombinante sorotipo de vírus adeno-associado 3 Vetores

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Descrevemos aqui um vírus da hepatite B recentemente desenvolvido sistema de repórter (HBV) para monitorar as fases iniciais do ciclo de vida do HBV. Este simplificado sistema in vitro irá ajudar no rastreio de agentes anti-HBV, utilizando uma estratégia de alto rendimento.

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Descrito aqui é um método eficaz sobre como produzir altos estoques virais de vírus de hepatite E (HEV) para infectar eficientemente as células hepatomas. Com o método apresentado, tanto não envolta, quanto partículas virais envoltas podem ser colhidas e utilizadas para inocular várias linhas celulares.

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Modelagem da infecção por vírus da hepatite B em células não hepáticas 293T-NE-3NRs

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Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2 (Vídeo) | JoVE Journal

Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2

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