Estudo de Vetores Virais em um tridimensional do fígado Modelo repovoada com a linha de células humanas carcinoma hepatocelular HepG2

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um modelo tridimensional de fígado para estudar vírus e vetores virais. Este método permite o estudo de processos biológicos em um sistema tridimensional vascularizado com células humanas que diferem em sua fisiologia das células de roedores em um modelo de camundongo ou rato. Além disso, é um passo para melhorar o bem-estar animal, pois evita experimentos com animais vivos e, a longo prazo, destina-se a substituir totalmente os componentes animais.

Embora tenhamos desenvolvido esse método para estudar vetores virais para transferência de genes, ele também pode ser aplicado ao estudo de vírus vitais infecciosos e outras áreas de pesquisa, como a pesquisa do câncer. Demonstrando o procedimento estará Viola Rohrs, uma técnica do meu laboratório. Por uma questão de bem-estar animal, apenas animais excedentes foram usados para o presente estudo que foram sacrificados para outros experimentos com animais, ou seja,

nenhum animal adicional foi necessário para obter os andaimes de fígado. Para começar, primeiro expanda a linha de células hepáticas Hep G2. Semeie 15 milhões de células em frascos T175 em 30 mililitros de meio contendo 10% de soro fetal de bezerro e dois milimoles de gulatmina, penicilina e estreptomicina. Após quatro dias de cultivo, use cinco minutos de exposição à solução de tripsina em condições de cultivo para soltar as células e, em seguida, colete-as.

Em seguida, gire as células a 300 Gs por três minutos. Em seguida, suspenda-os novamente em quatro mililitros de PBS e obtenha uma contagem de células. Cada frasco deve render cerca de 45 milhões de células.

600 milhões de células são necessárias para recelularizar uma ECM de fígado de rato. Para recelularizar a ECM, primeiro configure o sistema de biorreator contendo uma câmara de profusão hepática, um sistema de profusão, um reservatório de meio e uma armadilha de bolhas. Existem duas etapas críticas para o procedimento de recelularização.

Uma delas é evitar prender bolhas de ar no sistema de profusão. A segunda é que todo o sistema deve ser mantido estéril. Primeiro, esterilize esses componentes do sistema do biorreator a 121 graus Celsius por 15 minutos.

Em segundo lugar, encha os tubos e a câmara de profusão esterilizada com meio. Em seguida, coloque o andaime de fígado de rato descelularizado na câmara de profusão hepática. O próximo passo é usar clipes de tubo para conectar a veia porta canulada ao sistema de profusão.

Agora coloque o sistema de biorreator na incubadora e conecte-o a uma bomba peristáltica. Em seguida, equilibre o andaime com 150 mililitros de meio suplementado durante cinco dias. Defina o fluxo para 1,25 mililitros por minuto.

Após cinco dias, desconecte o sistema de biorreator da bomba e transfira-o para uma coifa estéril. Desconecte o andaime do fígado do circuito de mídia. Em seguida, carregue uma seringa com cinco mililitros de meio contendo 300 milhões de células Hep G2 e injete as células pela veia porta, evitando a formação de bolhas de ar.

Em seguida, permita que as células repovoem o ECM por uma hora sem executar a bomba. Após uma hora, ligue a bomba a 1,25 mililitros por minuto. Após 10 minutos, aumente a pressão para 2,5 mililitros por minuto.

Após mais 20 minutos, ajuste a bomba para a velocidade de operação de 3.75 mililitros por minuto. Após 30 minutos na velocidade máxima da bomba, desligue a bomba, adicione mais 300 milhões de células e deixe as células preencherem o ECM por uma hora. Após uma hora, aumente gradualmente a circulação por meio de ajustes incrementais na velocidade da bomba como antes.

Agora deixe a cultura recelularizar o fígado ao longo de duas semanas. A cada dois dias, substitua 50 mililitros do meio e meça os parâmetros fisiológicos de uma amostra do meio usado. A produção de vetores AAV é um procedimento complicado que envolve muitas etapas que são resumidas no protocolo de texto.

Nesta seção do vídeo, algumas das etapas cruciais são demonstradas. Primeiro, produza, purifique e quantifique os vetores AAV. Produzir brevemente os vetores AAV em frascos de rolos e purificá-los por centrifugação com gradiente de iodixanol.

Remova o iodixanol residual por filtração sobre colunas de filtração de gel PD10. Em seguida, determine a concentração do vetor AAV por QPCR usando o DNA genômico do AAV como padrão. Um total de 27 trilhões de vetores AAV são necessários por modelo.

Agora transduza o modelo de fígado. Primeiro, coloque 27 trilhões de vetores em cinco mililitros de PBS em uma seringa. O vermelho de fenol pode ser adicionado a 5 microgramas por mililitro.

Em seguida, desconecte o fígado do circuito de mídia e injete os vetores no sistema. Uma vez injetado, incubar o sistema durante uma hora sem bombear. Em seguida, aumente gradualmente o fluxo conforme descrito anteriormente.

Mais tarde, à medida que o fígado transduzido é incubado ao longo de seis dias, troque 50 mililitros do meio a cada dois dias. Usando um bisturi, corte amostras de cada lobo do fígado com cerca de meio centímetro de espessura e 1,5 a dois centímetros de comprimento. Incube as fatias em 4% de paraformaldeído com 4% de sacarose por 90 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave a amostra três vezes com PBS por um minuto por lavagem. Siga as lavagens incubando as amostras durante a noite em 8% de sacarose a quatro graus Celsius. No dia seguinte, coloque as amostras em criomoldes contendo algum meio de fixação.

Evite introduzir bolhas de ar. Uma vez carregadas, cubra totalmente as amostras com meio de fixação e coloque-as a 80 graus Celsius negativos. Depois de congeladas, prepare criossecções de 10 mícrons a partir das amostras usando um criotomo.

Pinte as amostras conforme necessário para confirmar a recelularização. Para análise da expressão gênica, colete amostras usando um punção de biópsia de quatro milímetros. Para avaliar a recelularização, as criossecções foram coradas com hematoxilina e eosina.

Os lobos de dois fígados transduzidos e um fígado controle que foi recelularizado, mas não transduzido, foram todos repovoados com células Hep G2. A expressão de RNA e o título do vetor foram quantificados a partir de 28 biópsias por punção de cada modelo hepático. Nos dois modelos de fígado transduzido, 55 e 90 genomas vetoriais por célula foram medidos, o que é vetor suficiente para induzir o silenciamento gênico.

Nenhum genoma foi medido no controle, como esperado. A expressão de EmGFP foi analisada por RT-PCR e western blotting. A maioria das biópsias mostrou expressão de mRNA de EmGFP e expressão proteica de EmGFP.

A imunoposição das criossecções mostrou que, onde quer que o modelo tenha sido recelularizado com sucesso, a expressão de EmGFP também pôde ser observada. Isso é indicativo de boa expressão do gene AAV. Em seguida, o knockdown mediado por AAV da ciclofilina B humana foi analisado por RT-PCR quantitativo.

O knockdown médio da ciclofilina B humana foi entre 70 e 90% em todos os lobos dos dois fígados transduzidos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que os pesquisadores estudassem a distribuição de vírus e vetores virais no sistema de órgãos tridimensionais vascularizados. Esses estudos ajudarão a melhorar as técnicas atuais de transferência de genes e a desenvolver novas estratégias antivirais.