Um método de injeção Alternativa e validado para acessar o espaço sub-retiniano via Uma abordagem transcleral Posterior

O objetivo geral deste estudo é descrever uma nova técnica de injeção sub-retiniana que pode ser usada para direcionar vetores virais, agentes farmacológicos ou induzir células-tronco pluripotentes ao espaço sub-retiniano em camundongos. Este método pode responder a questões-chave nos campos da ciência da visão e oftalmologia, como avaliar a eficácia de novas intervenções terapêuticas para degenerações da retina. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para fornecer material ao espaço sub-retiniano, com alta eficácia, danos mínimos e rápida recuperação da estrutura e função da retina.

Demonstrando o procedimento estará Sachin P, um técnico do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, apare os bigodes de um camundongo anestesiado para facilitar a visualização e mantenha a temperatura corporal do animal em 37 graus Celsius com uma almofada de água circulante. Em seguida, dilate suas pupilas com colírio de fenilefrina a 2,5%.

Em seguida, aplique colírios de metilcelulose para evitar o ressecamento e minimizar a catarata transitória induzida por anestésico. Esterilize os instrumentos antes da cirurgia. Em seguida, prepare a fluoresceína diluída em um gabinete de biossegurança.

Encha a seringa com a quantidade adequada de fluoresceína. Em seguida, faça uma pitada no dedo do pé para garantir que o animal esteja profundamente anestesiado e posicione o mouse de forma que o olho a ser injetado fique voltado para cima e claramente visível no microscópio de dissecação. Aperte suavemente a conjuntiva temporal com um par de pinças de ponta fina.

Em seguida, faça uma incisão circunferencial de aproximadamente 90 graus usando a tesoura de Vannas curva. Repita o procedimento na cápsula de Tenon subjacente. Depois disso, ressece o problema conjuntivo circundante com uma pinça de ponta fina, enquanto gira o globo nasalmente.

Trabalhe em direção ao local da injeção a aproximadamente 0,5 milímetros de distância do nervo óptico e tome muito cuidado para evitar interromper o seio retro-orbital. Uma etapa crítica é expor o local da injeção que requer rotação do olho, sem danificar o próprio olho ou as estruturas associadas, evitando principalmente danos ao saco sanguíneo orbital. Neste procedimento, faça uma pequena incisão na esclera do local da injeção, coçando suavemente a ocular com uma lâmina oftálmica de 22,5 graus.

Esta incisão deve ser grande o suficiente para permitir que a ponta da agulha passe pela esclera. Em seguida, insira a agulha chanfrada de calibre 33 na esclerotomia com o chanfro voltado para a retina e inclinado paralelamente à retina. Injete a quantidade desejada de 0,01% de fluoresceína pressionando o êmbolo lentamente com pressão uniforme.

Observe que quando a agulha está no espaço sub-retiniano, uma leve resistência será sentida ao pressionar o êmbolo. Não haverá resistência se a agulha perfurar a retina, mas alta resistência se a agulha não penetrar na esclera ou no EPR. Outra etapa crítica é a injeção direcionada ao espaço sub-retiniano.

Isso deve ser feito sem penetrar através da retina neurossensorial, até a cavidade vítrea. Aguarde alguns segundos antes de retirar a agulha, para minimizar o refluxo. Em seguida, lave o olho com solução salina estéril e certifique-se de que o olho tenha girado de volta à sua posição normal.

Em seguida, aplique uma camada espessa de creme oftálmico antibiótico triplo na superfície da córnea do olho injetado. Depois, coloque o mouse em uma gaiola solitária limpa para recuperação. Monitore sua respiração e temperatura durante a recuperação da anestesia e verifique se ele pode manter a decúbito esternal.

Realize monitoramento e tratamento pós-operatório apropriados adicionais, incluindo uma injeção subcutânea de carprofeno, para controle da dor pós-cirúrgica. Aqui está uma reconstrução 3D da bolha em forma de cúpula no local da injeção. A bolha em forma de cúpula é então preenchida em branco denso para mostrar a extensão e as margens do descolamento de retina.

As seções transversais da retina da OCT podem ser vistas em branco, enquanto o espaço cheio de líquido no nível do EPR e dos fotorreceptores parece preto. E nesta figura, as varreduras representativas de OCTB no local do descolamento máximo de retina são mostradas para pré-injeção, 10 minutos após a injeção e quatro semanas após a injeção. Esta imagem mostra a formação e a resolução de uma bolha plana a partir de uma injeção de 0,3 microlitro.

E esta imagem mostra a formação e resolução de uma bolha abobadada a partir de uma injeção de 0,5 microlitro, enquanto esta imagem mostra a formação e resolução de uma bolha abobadada a partir de uma injeção de um microlitro. Por fim, aqui está um exemplo de cicatrizes coroidais graves e afinamento da retina no local da injeção. As retinas mantêm a função normal após a resolução da bolha.

Em nove intensidades de iluminação, as formas de onda para respostas mediadas por bastonetes escotópicos são mostradas para pré-injeção e quatro semanas após a injeção para injeções de 0,3 microlitro, 0,5 microlitro e 1 microlitro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 10 a 15 minutos por olho. Ao tentar este procedimento, é importante avaliar a saúde dos olhos antes de começar.

Exclua olhos com opacidades da córnea ou do cristalino, ou olhos profundos para os quais esse procedimento seria muito difícil. Após este procedimento, outros métodos, como OCT e fundo de olho, podem ser realizados para avaliar a qualidade da injeção.