Desenvolvimento de um protocolo refinado para Trans-escleral apresentam transplante de células epiteliais de pigmento Retinal humano nos olhos de rato

Subretinal injeção tem sido amplamente aplicada em estudos pré-clínicos de terapia de reposição de células-tronco para degeneration macular age-related. Neste artigo visualizado, descrevemos uma técnica de injeção subretinal menos arriscado, reproduzíveis e precisamente modificados através da abordagem trans-escleral para entregar as células nos olhos de rato.

O objetivo geral deste vídeo é apresentar uma técnica de injeção sub-retiniana transescleral reproduzível para fornecer células epiteliais pigmentares da retina humana, ou RPE, no espaço sub-retiniano dos olhos de roedores com risco mínimo de danos à retina. Isso é feito primeiro fazendo uma pequena incisão na conjuntiva temporal posterior ao limbo para expor a esclera subjacente. Em seguida, uma agulha de insulina chanfrada de calibre 31 é usada para penetrar no complexo central da esclera, inserindo a agulha 500 mícrons ou aproximadamente metade da ponta no tecido com o lado chanfrado voltado para cima para criar um orifício piloto.

Em seguida, uma agulha de injeção chanfrada de calibre 33 presa a uma seringa é guiada para o orifício piloto e inserida em um ângulo e profundidade específicos, o orifício de injeção veda automaticamente após a agulha ser retraída e nenhum ponto ou cola de tecido é necessário. As retinopatias degenerativas consistem em um amplo espectro de doenças que envolvem diferentes tipos de células da retina. Em todo o mundo, a doença mais comum, a degeneração macular relacionada à idade, ou DMRI, ocorre entre os idosos e leva à cegueira permanente.

As alterações patológicas que ocorrem na DMRI envolvem uma degeneração inicial das células epiteliais pigmentadas da retina, ou EPR. A perda de EPR leva à disfunção ou morte do fluorreceptor retiniano. Os tratamentos farmacológicos atuais para DMRI em estágio inicial limitam-se a retardar a progressão ou aliviar os sintomas.

Isso, juntamente com um potencial regenerativo limitado da retina, significa que não há tratamento eficaz para restaurar a visão. O Neural Stem Cell Institute identificou recentemente uma população de células-tronco adultas na população de células RPE. Essas células podem ser usadas como fonte para terapia de reposição de células-tronco.

Atualmente, nosso instituto está realizando estudos pré-clínicos para investigar a eficácia e a segurança da terapia de transplante de células-tronco RPE em um modelo animal de rato degenerativo RPE. Neste estudo, utilizamos uma técnica de injeção sub-retiniana transescleral para fornecer células-tronco RPE nos olhos de ratos, entre as camadas retiniana e RPE. Nosso método é um meio fácil e confiável para a entrega bem-sucedida de células no espaço sub-retiniano.

Você precisará dos seguintes reagentes e equipamentos. 1% de tropicamida e 2,5% de fenilefrina, recém-feitos a partir de 10% de fenilefrina, diluindo-o em solução salina estéril a 0,9% no dia da cirurgia, são usados para dilatar a pupila. O colírio é usado para enxaguar o olho e manter o olho não operado úmido.

Um lubrificante ocular é usado para manter o olho direito não operado úmido durante a cirurgia. 0,5% de proparacaína é usado como anestésico local. Um lubrificante ocular é usado no olho esquerdo operado durante a varredura da OCT.

Uma quantidade mínima de material e equipamento é necessária para esta técnica. Informações detalhadas de equipamentos e reagentes usados nesta técnica são descritas no protocolo. Uma seringa de 10 microlitros é usada para injetar células.

Antes da injeção, primeiro montamos o injetor e o esterilizamos com etanol. Insira uma agulha chanfrada estéril de calibre 33 na seringa e aperte bem para montar o injetor. Lave o injetor com etanol 100%, depois etanol 70% e, em seguida, água destilada deionizada, sequencialmente por cinco a seis vezes cada.

Marque a agulha injetora com um marcador preto estéril em uma posição a 600 mícrons de distância da ponta da agulha. Coloque o injetor em um micro manipulador para uso injecional. As células RPE humanas são preparadas no dia da cirurgia e mantidas em mistura de água gelada.

Triture suavemente a suspensão celular e carregue o injetor com 1,2 microlitros, os 0,2 microlitros extras são usados para compensar o refluxo da injeção, para garantir um volume de injeção de um microlitro. Substitua o injetor preenchido com a suspensão celular no micromanipulador ou peça a um assistente para segurá-lo verticalmente, pois as células RPE tendem a afundar facilmente nas soluções. Prepare a área cirúrgica estéril colocando uma almofada de cirurgia estéril com uma almofada de aquecimento embaixo do palco do microscópio de dissecação.

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Nova York em Albany. Pese o animal e anestesieste-o usando o sistema de liberação de vapor de isoflurano, conforme mostrado aqui. Transfira o rato para a área cirúrgica depois de anestesiado e coloque-o em um cone nasal conectado ao sistema isoflurano para manter a anestesia.

Cubra o corpo do rato com gaze e aperte o dedo do pé do rato para confirmar a anestesia completa. Aplique uma gota de lubrificante ocular no olho direito do rato, posicione o rato para o lado direito, com o olho esquerdo voltado para o teto para injeção, a cabeça voltada para a mão direita do cirurgião e de costas para o cirurgião. Apare todos os bigodes que cobrem o olho.

Pingue uma pequena quantidade de colírio para o lado temporal do olho esquerdo e colete o excesso no lado nasal com um aplicador de algodão para enxaguar o olho. Dilate a pupila com 1% de tropicamida, 2,5% de fenilefrina, para uma tomografia de coerência óptica pós-injeção, ou exame de OCT, aplicando uma gota de cada. Aplique uma gota de colírio para manter os olhos úmidos.

Aplique uma gota de Proparacaína no olho e retire o excesso com um aplicador de algodão. Massageie suavemente a pele ao redor do olho quatro a seis vezes para abrir a pálpebra, de modo que o olho saia temporária e levemente de sua órbita para permitir um fácil acesso à agulha injetora. Use forças para segurar a conjuntiva posterior ao limbo e gire o olho para encontrar um local melhor para a cirurgia sem danificar os músculos oculares.

Levante suavemente a conjuntiva para fazer uma tenda e gire o olho nasalmente. Em seguida, use uma tesoura para cortar a parte superior da barraca, para fazer uma pequena abertura na conjuntiva e expor a esclera. Em seguida, use uma pinça para segurar a borda da abertura da conjuntiva ao lado do limbo e gire o olho nasalmente, de modo que o eixo pupilar fique em um ângulo de cerca de 30 graus em relação ao solo.

Uma agulha de insulina de calibre 31 chanfrada estéril é usada para penetrar no complexo do núcleo da esclera com um chanfro apontando para cima e metade da ponta, ou cerca de 500 mícrons inseridos no tecido, para criar um orifício piloto para injeção. Retire cuidadosamente a agulha de insulina e um pequeno derrame de sangue pode ser observado. Uma lança ocular pode ser aplicada para limpar o buraco e parar o sangramento, se necessário.

Guie a agulha injetora carregada com células RPE no orifício piloto em um ângulo de cerca de 10 a 15 graus em relação à superfície local da esclera para alcançar o espaço sub-retiniano inserindo a agulha com um comprimento de 500 mícrons completamente no tecido e deixando uma distância de 100 micro entre o ponto da agulha que é coberto pelo tecido e o ponto do marcador preto na agulha. Diga ao assistente para pressionar o êmbolo da seringa, para injetar o volume apropriado de células. Segure o injetor no lugar por 25 a 30 segundos após a injeção e, em seguida, retraia lentamente o injetor.

O orifício de injeção veda automaticamente e uma pequena quantidade de cerca de 0,2 microlitros de refluxo é comumente observada. Enxágue o local da injeção com colírio estéril três vezes e colete o excesso com um aplicador de algodão. Aplique uma gota de lubrificante no olho operado e transfira o rato para a estação OCT, para examinar a localização das células transplantadas e o tamanho da bolha sub-retiniana.

Retorne o rato para a gaiola de recuperação sob uma lâmpada de calor para manter a temperatura corporal assim que a OCT terminar. Observe o rato para garantir que ele saia da anestesia e monitore diariamente se há sinais de angústia. Notifique o veterinário imediatamente se houver dúvidas.

Usando nossa técnica, entregamos de forma consistente e bem-sucedida células RPE humanas no espaço sub-retiniano. Imediatamente após o transplante, realizamos o exame de OCT para observar o local da injeção e a bolha sub-retiniana criada pelas células transplantadas. Isso serve como uma boa ferramenta de triagem para avaliar a qualidade das injeções e o grau de dano à retina, ou hemorragia.

A reflexão da luz brilhante ao redor do local da injeção e uma bolha sub-retiniana preenchida com a suspensão celular podiam ser vistas na varredura da OCT. Não há sangramento, vazamento de fluido interocular ou descolamento de retina, observado ao redor do local da injeção ou do espaço intravítreo em uma injeção bem-sucedida, demonstrando o trauma mínimo causado pela injeção. Os olhos dos ratos operados foram nucleados, fixados e seccionados para análise imuno-histológica sete dias após o transplante.

O marcador nuclear humano, Hunu, e o marcador celular RPE, OTX2, foram usados para detectar as células transplantadas. Uma afirmação positiva de ambos os marcadores mostrou que as células RPE humanas transplantadas estavam localizadas no espaço sub-retiniano dos olhos de ratos. Esta técnica de injeção sub-retiniana transescleral é simples e fácil de aprender.

Causa menos trauma cirúrgico e deixa a retina intacta ao passar a agulha de injeção pelas camadas externas da parede do olho, sem quebrar a retina neural. As gotas quantificadas para que a agulha piloto e a agulha de injeção entrem no tecido e o ângulo usado durante a injeção permitem a entrega de células de forma confiável no espaço sub-retiniano com precisão e taxa de sucesso muito maiores. Com este método de injeção, entregamos de forma consistente e bem-sucedida células RPE derivadas de células-tronco RPE humanas no espaço sub-retiniano de ratos RCS.

Este procedimento pode ser facilmente repetido por qualquer pessoa que assista ao vídeo.