Desenvolvimento e Identificação de uma subpopulação Novel dos fagócitos Human Giant neutrófilos derivado In Vitro

Os objetivos gerais deste método são gerar e identificar fagócitos gigantes cultivados in vitro derivados de neutrófilos humanos circulantes para a investigação de seu papel nas respostas imunes inflamatórias e anti-inflamatórias. Este método pode ser usado para obter e identificar uma nova subpopulação de fagócitos gigantes que se desenvolvem a partir de neutrófilos humanos para manter as condições de cultura a longo prazo. Esta técnica pode ser usada para investigar melhor o significado e as funções dos fagócitos gigantes, bem como para responder a perguntas-chave sobre sua ativação e plasticidade.

Demonstrando o procedimento estarão Eva Leder, nossa assistente de pesquisa, e Oksana Rogovoy, pós-doutorada, ambas do meu laboratório. Use um conjunto de veias estéreis do couro cabeludo para obter pelo menos 40 mililitros de sangue venoso de um jovem voluntário saudável. Em seguida, misture suavemente o sangue em uma capela de fluxo laminal de biossegurança.

Diluir alíquotas de 10 a 12 mililitros da amostra de sangue total até um volume final de 24 mililitros com PBS livre de íons pré-aquecido contendo 2% de FCS inativado pelo calor. Em seguida, adicione 12% mililitros de polissacarose 1119 ao fundo de um tubo de centrífuga cônico de polipropileno estéril de 50 mililitros por alíquota de amostra de sangue, seguido pela estratificação cuidadosa de 12 mililitros de polissacarose 1077 em cima da solução de gradiente de polissacarose 1119. Pipetar cuidadosamente 24 mililitros de sangue diluído para tubos individuais das soluções de gradiente de densidade e separar as células por centrifugação.

Devem ser observadas duas camadas opacas resultantes. Descarte o fluido até 0,5 centímetros acima da camada de células mononucleares em cada tubo. Em seguida, transfira as células mononucleares de cada amostra para um único novo tubo.

Em seguida, descarte o fluido restante até 0,5 centímetros acima da célula polimorfonuclear ou camada de PMN e transfira os PMNs de cada amostra para um novo tubo diferente. Lave os PMNs em um volume final de 30 mililitros de PBS contendo 2% de FCS inativado pelo calor, seguido de lise dos glóbulos vermelhos com três mililitros de cloreto de sódio hipotônico estéril a 0,2%. Após 30 segundos no gelo, restaure a isotonicidade com três mililitros de cloreto de sódio a 1,6% estéril e gelado.

Em seguida, adicione seis mililitros de meio RPMI 1640 a 37 graus Celsius suplementado com FCS inativado por calor e colete as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em quatro mililitros de RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS inativado por calor. Após a contagem, ajuste a concentração para 1,25 a 1,5 vezes 10 elevado ao sexto PMN por mililitro de meio de cultura e coloque um mililitro de células por poço em poços individuais de uma placa de 24 poços.

Em seguida, coloque a placa em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, alimentando as culturas com substituição suave de metade do meio por meio RPMI 1640 fresco suplementado com FCS inativado por 10% de calor a cada três dias. Os neutrófilos se diferenciarão em fagócitos gigantes dentro de sete dias após a cultura. No sétimo dia de cultura, remova cuidadosamente metade do meio de cada poço.

Em seguida, pipete de forma robusta o meio restante para remover os fagócitos gigantes levemente aderidos. Transferir as células destacadas de dois a quatro poços de cada grupo de tratamento para tubos cônicos individuais de 15 milímetros e coletar as células por centrifugação, ressuspendendo os pellets em 100 a 120 microlitros de meio por tubo. Em seguida, equipe dois a três suportes por grupo de tratamento com lâminas de microscópio, cartões de filtro e funis.

Em seguida, adicione todo o volume de células de cada tubo no funil Cytospin apropriado. Em seguida, carregue os suportes em um Cytospin e gire as células nas lâminas. Seque as lâminas fiadas por 10 minutos.

Em seguida, use um marcador estável à água para desenhar uma barreira hidrofóbica ao redor das células e fixe as amostras com 4% de paraformaldeído sob uma capa química à temperatura ambiente. Após 10 minutos, enxágue brevemente as lâminas três vezes com cerca de 100 microlitros de PBS por lavagem. Em seguida, permeabilize as células com 0,5% de Triton X-100 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de cinco lavagens de PBS, conforme demonstrado.

Bloqueie a ligação inespecífica com soro de cabra 10% normal em meio RPMI 1640 pelo período de tempo apropriado, seguido por uma única lavagem de PBS. Agora, adicione uma pequena quantidade de água à caixa para manter a umidade e, em seguida, rotule as células com cerca de 100 microlitros do anticorpo primário apropriado de interesse durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara escura umidificada. Em seguida, execute uma única lavagem de PBS e, em seguida, adicione o anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado.

Após 40 minutos à temperatura ambiente e protegido da luz, lavar as amostras para remover o excesso de anticorpos e montar as lâminas com uma gota de meio de montagem por amostra e uma lamínula. Analise as lâminas por microscopia de fluorescência de varredura a laser confocal dentro de 30 a 120 minutos sob uma objetiva de óleo de emersão de 40X. Em seguida, calcule a área celular, a intensidade de fluorescência e a co-localização usando o software apropriado.

O desenvolvimento de neutrófilos em fagócitos gigantes dentro de sete dias após a cultura pode ser observado nessas imagens. A autofagocitose é evidente 90 minutos após a cultura de neutrófilos com colorações de membrana fluorescente com um diâmetro celular amplamente aumentado aparente nos dias quatro a sete. Se as culturas de neutrófilos forem suplementadas com GM-CSF e IL-4, no entanto, as células demonstram um diâmetro geral menor e projeções citoplasmáticas semelhantes a células dendríticas.

A microscopia de lapso de tempo dos fagócitos gigantes nos dias de cultura três a quatro e nos dias quatro a cinco revela células nenhumas ou levemente aderentes com uma capacidade de movimento limitada que ingere ativamente os remanescentes e detritos de neutrófilos circundantes. Nesta cultura mista de neutrófilos de monócitos, a migração de um macrófago rastejante ativo pode ser comparada ao movimento quase estacionário de um fagócito gigante marcado com fluorescência no mesmo poço de cultura. A origem neutrofílica dos fagócitos gigantes pode ser verificada pela expressão positiva de marcadores de neutrófilos e pela falta de expressão de marcadores de células monocíticas e dendríticas.

Os fagócitos gigantes também geram espécies reativas basais de oxigênio e respondem à estimulação da zimosana e da PMA por explosão oxidativa. No entanto, ao contrário dos monócitos ou neutrófilos, eles também respondem por explosões oxidativas à estimulação de lipoproteínas de baixa densidade oxidadas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis a sete dias.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de substituir metade do meio suavemente ao alimentar as culturas de neutrófilos. Após este procedimento, outras técnicas de coloração podem ser realizadas para responder a perguntas sobre as funções adicionais dessas células intrigantes in vitro e in vivo. Essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores no campo da biologia de neutrófilos explorarem a ativação e plasticidade dos neutrófilos e identificarem essas células in vivo em condições fisiológicas e fisiopatológicas em humanos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter e identificar fagócitos gigantes em cultura. Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano pode ser potencialmente infeccioso e que precauções como usar luvas e descartar todos os fluidos e usar equipamentos descartáveis nos recipientes de risco biológico apropriados são essenciais ao realizar este procedimento.