Name: Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a medir o pH fagossomal e citoplasmático em neutrófilos humanos e de camundongo utilizando o indicador ratiométrico SNARF-1 e microscopia confocal. Este método permite monitorar mudanças dinâmicas de pH e volume vacuolar.

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Este trabalho foi gentilmente financiado pelo Wellcome Trust, da Biotecnologia e Ciências Biológicas Conselho Investigação, eo Irwin Joffe Memorial Fellowship.

declaração de ética: Todo o trabalho animal foi realizado com a licença e aprovação do Home Office do Reino Unido. participação humana nesta pesquisa foi aprovado pelos comités mistos UCL / UCLH sobre a ética da pesquisa humana. Todos os participantes forneceram consentimento informado. 1. Preparação de C. albicans <ol><li> Crescer um disco Candida (ver Lista de Materiais) em uma placa de agar YPD, conforme as instruções do fabricante. Escolha uma colônia e adicioná-lo a 15 ml de caldo YPD. Incubar-lo em uma incubadora com agitação a 30 ° C e 200 rpm até que o caldo é turvo (geralmente cerca de 2 dias, ou a uma concentração de cerca de mais de 1 x 10 9 / mL). </li><li> Girar a forma Candida e ressuspender-lo em 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Centrifugar a 3.000 xg durante 10 min. Repita este passo duas vezes. </li><li> Colocar o tubo contendo 50 ml de meio PBS / Candida em um banho de água pré-aquecido a 60 ° C, de modo que todo o tubo é submerged durante 1 h. <ol><li> Para confirmar que a Cândida são mortas pelo calor, sequência de uma amostra numa placa de agar YPD e incubar durante a noite a 30 ° C. Ajustar a concentração morta pelo calor (HK) Candida a 5-9 x 10 8 / mL, dependendo do crescimento de Candida, e armazená-lo em aliquotas de 1 ml num congelador -20 ° C. Nota: Todas as contagens de células em este protocolo foram realizadas utilizando um contador de células automatizado. </li></ol></li></ol> 2. S-1 de acoplamento para aquecer-morto (HK) Candida <ol><li> Prepara-se uma alíquota de carboxi-S-1 de éster de succinimidilo (50 g) diluindo-lo em 100 mL de sulfóxido de dimetilo de grau elevado (DMSO). Vortex bem para misturar. </li><li> Preparar 1 mL de 1 x 10 8 HK Candida em bicarbonato de sódio 0,1 M (pH 8,3) num tubo de 15 mL. </li><li> Adicionar 100 mL de carboxi-S-1 uma gota de cada vez para o HK Candida, enquanto se mistura num vórtice a aproximadamente 2000 rpm (velocidade média a alta). Enrole foi alumíniol em torno do tubo e colocá-lo num rolo à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lava-se a HK Candida- S-1 (HKC-S-1), três vezes por centrifugação a 2250 xg durante 10 minutos cada. Para as duas primeiras lavagens, ressuspender o sedimento em 15 mL de bicarbonato de sódio 0,1 M (pH 8,3). Após a terceira lavagem, ressuspender-lo em 1 ml de tampão equilibrado solução salina (BSS) (ver Tabela 1). </li><li> Transferir os HKC-S-1 da suspensão para dentro de tubos em aluotas de 100 e armazená-las a -20 ° C. NOTA: Usar tubos com material de ligação de superfície baixa, se possível, como HKC-S-1 partículas pode furar a parede de tubos de centrifugação normais. </li><li> Opsonizar HKC-S-1 <ol><li> Para os neutrófilos humanos, adiciona-se 100 uL de soro de IgG humano a 100 uL de descongeladas HKC-S-1. </li><li> Para neutrófilos de rato, adicionar 50 ul de soro de ratinho normal e 50? L de rato Candida no soro imune (gerado a partir de ratos C57B6 injectados com Cândida HK) 5 a 100 uLde HKC-S-1. </li><li> Misturá-lo em um calor agitador a 37 ° C e 1100 rpm durante 60-90 min, e, em seguida, sobre um rolo de 4 ° C durante 2 h. </li><li> Lavar três vezes em tampão BSS por centrifugação a 17200 xg durante 1 min cada. Ressuspender em 100 uL de tampão BSS. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento de Neutrófilos <ol><li> Para neutrófilos de sangue periférico humano, tomar 15 ml de sangue por punção venosa a partir de um dador saudável e colocá-lo em uma seringa de 20 mL contendo 90 mL de solução de heparina sódica 1000 UI / mL (60 uL de heparina / 10 mL de sangue). </li><li> Utilizando uma ponta de pipeta, injectar 1,5 ml de solução de dextrano a 10% para dentro da seringa. Invertê-lo suavemente 3 vezes e deixá-lo de pé no banco. </li><li> Esperar 30-60 minutos, até que o sangue é dividida aproximadamente em metade, com uma camada buffy coat topo que é cor de palha, e uma camada inferior contendo eritrócitos. </li><li> Cuidadosamente empurrar para fora a camada superior por meio de uma agulha ou removê-lo com uma ponta de pipeta. Coloque-ind tubo de 15 mL. Evite tirar a camada de vermelho. Usando uma pipeta de 5, adicionar 3-4 mL de meio de gradiente de densidade (ver Lista de Materiais) para o fundo do tubo por baixo da camada buffy coat para se obter duas camadas distintas. Centrifugar a 913 xg durante 10 min. NOTA: Se usando neutrófilos de rato (ver referência 17 para o isolamento dos neutrófilos de rato), utilizar a suspensão de células que foi descarregado a partir da medula óssea, em vez. </li><li> Deitar fora o sobrenadante, deixando para trás uma bolinha vermelha. Suavemente vortex para perturbar o sedimento. Adicionar 7 ml de água destilada, H autoclavados 2 O para o sedimento e inverter durante 20 s para ressuspender o sedimento. Adicionar 7 ml de solução salina e 2x inverter algumas vezes para misturar, a lise das células vermelhas do sangue remanescentes. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão BSS para cerca de 4 x 10 6 / mL. NOTA: Para a microscopia óptimo das células, manter a concentração da suspensão de células entre 1,5-6 x 10 6 </sup&gt; / mL. </li></ol> 4. Preparação de Lâminas <ol><li> Pré-tratar uma chapa de microscopia de 8 poços (ver Lista de Materiais) com 200 ul de poli-L-lisina (solução 0,01%) em cada poço durante 40-60 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover o poli-L-lisina (pode ser reutilizada) e lavar os poços duas vezes com 200 mL de H2O destilada </li><li> Adicionar 200 uL de suspensão de células, preparado no passo 3.6 a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 30-60 min. </li><li> Prepara-se uma alíquota de 5- (e-6) -carboxi-1 S acetoximetilo (S-1-AM) éster (50? G) por adição de 100 uL de DMSO de grau elevado a um tubo. Vortex para misturar. Quando não estiver em utilização, armazenar a -20 ° C. </li><li> Em um pequeno tubo, adicionar 1,7 ml de tampão BSS e 20 uL de S-1-AM. Vortex para misturar. </li><li> Lavam-se os poços duas vezes com 200 mL de tampão BSS, e então substituir o tampão com a solução de S-1-AM. Tome cuidado para não perturbar a monocamada de células ligados ao fundo do poço com cuidado pipetandopara baixo nas paredes dos poços. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 25 min. </li><li> Lavam-se os poços duas vezes com 200 uL de tampão BSS. Para testar um inibidor, fazer-se uma &quot;mistura principal&quot; do fármaco apropriado em tampão BSS. Lavam-se os poços duas vezes na solução de inibidor. NOTA: Certifique-se usar a mesma quantidade de veículo do fármaco (por exemplo, DMSO ou etanol) no controlo assim como foi utilizado para o inibidor. Se testar o efeito do cloreto de zinco, usar tampão BSS falta de KH 2 PO 4 (o HEPES pode tamponar a solução sozinho), como zinco precipitados com fosfato. </li><li> Sonicar a opsonizado HKC-S-1 (secção 6.2) durante cerca de 3 s a 5 m de amplitude. Adicionam-se 10 uL a cada poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 15-20 minutos para permitir a fagocitose, tornando as células de pronto a ser trabalhada para instantâneos da fagocitose. </li></ol> 5. microscopia confocal <ol><li> Usando um microscópio confocal, ajustar o comprimento de onda do laser de modo them que as células são animado a 555 nm e o de emissão é detectada por dois canais, ou detectores: 560-600 nm e a 600 nm. NOTA: Os parâmetros microscópio específicos serão diferentes para cada microscópio e precisam ser otimizados pelo pesquisador. </li><li> Ver as células usando uma lente de 63X com óleo. Usar uma imagem de telha-scan do ajuste contínuo para ver a peça central. Usando a intensidade de fluorescência e ganho de canais de detecção, ajustar o foco ea intensidade do laser e o ganho dos dois canais para otimizar a imagem. </li><li> Dividir a imagem usando as configurações para ver ambos os canais; verifique que não há saturação da intensidade de fluorescência no citoplasma ou vacúolos. Saturação aparece como pontos vermelhos. Reduzir a intensidade do laser de modo que haja um número mínimo de pontos vermelhos, mas as células e phagosomes são brilhantes o suficiente para ver claramente. </li><li> Quando estiver satisfeito, clique em &quot;Iniciar a experiência.&quot; Uma imagem de digitalização 9-telha é gerado. Salve a imagem como um arquivo complexo recomendado peloo software que contém uma imagem compósita de dois canais (não TIFF ou JPEG). </li></ol> 6. Experiências de calibração <ol><li> Construir a curva padrão de pH com sozinho Candida. <ol><li> Prepare os tampões de pH 3,0-13,0, conforme indicado na Tabela 1. </li><li> Tomar uma aliquota (100 uL) de HKC-S-1. Girá-lo para baixo durante 1 min a 17.200 x g. Ressuspender-lo em 500 uL do tampão atribuído. </li><li> A partir do intervalo de pH mais baixo, adicionar a suspensão para um pré-tratamento bem (a partir do passo 4.2). Colocar a lâmina do microscópio confocal sobre uma fase aquecida ajustado para 37 ° C. </li><li> Grave a fluorescência a cada min para 10 min. Repetir para cada tampão. </li></ol></li><li> Saponina curva padrão. <ol><li> Isolar 1 x 10 7 neutrófilos humanos 5 e suspendê-las em 1 mL do tampão de pH mais baixo. </li><li> Seguir o processo descrito na secção 4 para medir a ppH hagosomal em neutrófilos. </li><li> Após a incubação com a suspensão Candida durante 20 min, adicionar 0,3% de saponina (15 ul de estoque de 10% de um pré-tratamento bem (a partir do passo 4.2)) para o prato, e, em seguida, incuba-se durante 20 min a 37 ° C. Tome uma imagem a cada minuto, durante 10 min. Repetir para cada tampão. </li></ol></li><li> Curvas padrão pH citosólicas usando o elevado de K + / nigericina técnica de 5, 18, 19. <ol><li> Adicione-se os tampões descritos na Tabela 1, a partir de pH 4,0 a 13.0. </li><li> Siga passos 4,1-4,7, deixando apenas os neutrófilos nos poços pré-tratada - cada cavidade para conter um tampão diferente. Adicionar a corrediça para a fase aquecida a 37 ° C e registar a fluorescência de cada min durante 10 min. </li><li> Nota: Pode levar algum tempo para que o pH citosólico para estabilizar com a solução externa, mas após este ponto, o valor da relação de S-1 se tornaconstante. Medindo as extracelulares HKC-S-1 em cada experiência pode servir como um controlo para verificar se quaisquer inibidores adicionados não interferem com a fluorescência emitida S-1 ou afectar o pH do tampão. </li></ol></li></ol> Análise 7. Imagem NOTA: Aqui, é fornecido instruções para análise de imagem (quantificação de fluorescência) usando o ImageJ software livre. Uso de ImageJ é recomendado. <ol><li> Faça o download e instale a versão ImageJ&gt; 1.46r como por instruções do desenvolvedor (https://imagej.nih.gov/ij/). Instale o arquivo de código suplementar anexado com este protocolo chamado de “medição Phagosomal.” </li><li> Abrir imagem J e carregar o arquivo de imagem escolhida para análise na barra de ferramentas. Para combinar os dois canais, use Imagem&gt; Cor&gt; Faça Composite. </li><li> Botão direito do mouse para escolher um arquivo para armazenar resultados. </li><li> Clique na ferramenta de linha na barra de ferramentas e clique duas vezes para aumentar a largura de &amp; #34; 2 &quot;. </li><li> Desenhar uma linha em toda a largura de um fagossoma, e em seguida, clique com o botão direito a &quot;medida pH&quot;. A intensidade média dos dois canais é adquirido, e seu índice é calculado automaticamente pelo arquivo de código em ImageJ. </li><li> Depois de terminar as medições, botão direito do mouse para escolher &quot;salvar o arquivo.&quot; </li><li> Para medir a área do fagossoma, use o quarto ícone ao longo da barra de ferramentas para desenhar à mão livre ao redor da área. Botão direito do mouse para selecionar &quot;medida área.&quot; NOTA: Os resultados são salvas e um arquivo de log é gerado no diretório selecionado. Os resultados podem ser processados ​​utilizando folha de cálculo, R, ou um software equivalente. A relação entre a razão de fluorescência para pH é aproximadamente sigmoidal, e os valores da relação gerados pela análise ImageJ pode ser convertido a pH utilizando uma função logística ou sigmóide generalizada ou por interpolao spline cúbica linear ou. </li><li> Para medir citoplasma, desenhar uma linha através do citoplasma e clique com o botão direito “medir pH”. </li></ol>

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<li>Riazanski, V., Gabdoulkhakova, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC6+channel+translocation+into+phagosomal+membrane+augments+phagosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">TRPC6 channel translocation into phagosomal membrane augments phagosomal function.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (47), 6486-6495 (2015).</li>
<li>Martínez-Zaguilán, R., Martínez, G. M., Lattanzio, F., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+intracellular+pH+and+Ca2%2B+using+the+fluorescence+of+SNARF-1+and+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of intracellular pH and Ca2+ using the fluorescence of SNARF-1 and fura-2.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 260 (2), (1991).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Uma vez que os reagentes adequados, configurações de microscópio, e experimentos de calibração são criadas, este método é relativamente simples de executar. Os passos críticos incluem: rotular a Candida com S-1 para garantir que não há nenhuma sobrecarga do corante, a calibragem, e a análise da imagem. S-1 é um reagente adequado para ambientes de pH mais alcalino, o que é particularmente importante para os neutrófilos 21 mas limita o seu uso em determinados tipos de células. Para ambientes mais ácidos, tais como macrófagos, fagossomas SNARF-4, ou S-4, é mais apropriado por causa do seu mais baixo de pKa 22. Além disso, para leituras citoplasmáticos mais precisos, é melhor usar S-4, como a curva padrão para o S-1 mostra que os rácios de fluorescência começar a planalto abaixo de pH 6 (Figura 3). Outros corantes, tais como 2&#39; , 7&#39;-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) ou pHrodo vermelhos pode também ser mais apropriada em um context que está prevista para ser ácida. No entanto, a coloração citoplasmática ainda é necessário para a identificação correcta dos fagossomas contendo Candida. Uma característica importante de um indicador de pH phagosomal é que ele não é irreversivelmente alterada pelo ambiente phagosomal reactivo. S-1 parece ser resistente ao meio de neutrófilos. Isto é mostrado por Levine et ai. 5 (ver suplementar de vídeo 4 de referência 5) que demonstram a fagocitose e a libertação subsequente de uma partícula marcada Cândida S-1-por um Hvcn1 - / - de neutrófilos. Quando fagocitados, a partícula muda de amarelo / laranja para vermelho (pH neutro a alcalino), mas quando a partícula é libertada por neutrófilos, ele retorna à sua cor original. É importante mencionar algumas das limitações associadas ao uso de S-1. O fato de que este corante tem dois espectros de emissão, permitindo meas raciométricaurement é uma vantagem, mas equipamento especializado é necessário para adquirir imagens; O microscópio utilizado para os experimentos devem ser capazes de gravar duas imagens simultaneamente ou com um atraso de tempo insignificante. Os autores assumem que o pesquisador tenta este protocolo tem experiência usando microscopia confocal, ou tem acesso a um profissional treinado. Não podemos listar todos os parâmetros microscópio específicos como eles serão diferentes para cada microscópio e precisam ser otimizados pelo pesquisador. O éster de acetoximetilo conjugado com S-1, que permite que o corante se difunda para dentro do citoplasma celular é degradada por esterases não-específicos no citoplasma da célula para formar a molécula fluorescente. Esterases, tal como fosfatase alcalina, estão presentes no soro humano e soro de bovino fetal, que são utilizadas para suplementar meios de cultura de células. Por conseguinte, o meio no qual as células são carregadas com S-1-AM (secção 4.5) não deve conter soro. Isso pode ser um desafio, se utilizando células que requerem uma mais nutrientes rich meio para sustentar a eles do que a solução salina balanceada utilizado ao longo deste protocolo. Da mesma forma, outros componentes do meio fluorescentes, tais como f enol vermelho, podem interferir com as medições de S-1. As barras de erro na Figura 3 indicam que há alguma variação nas medidas de proporção em cada pH. Um número adequado de repetições de cada experiência (pelo menos, n = 3) e o maior número de medições individuais em cada única experiência são necessários para ultrapassar a variação inter-vacuolar. Assim, é aconselhável para medir o pH de pelo menos 100 fagossomas para cada condição e como muitas áreas phagosomal que parecem conter apenas um Cândida. Os fagossomas para ser medido por quantificação deveriam ser aqueles que têm engolida completamente uma partícula Cândida (isto é, aqueles completamente cercado por citoplasma). Para mitigar contra desvios não intencionais na selecção de células / fagossomas para quantificação, todas as análises deverão ser realizadas enquantocego para as condições experimentais. Aqui, nós descrevemos o isolamento de neutrófilos por sedimentação com dextrano do sangue total por centrifugação seguido da camada de plasma através de um gradiente de densidade. Utilizamos esta técnica, uma vez que rapidamente e produz eficientemente uma população pura (&gt; 95%) de neutrófilos, embora existam outros métodos disponíveis, tais como toda a centrifugação de sangue através de outras fórmulas de gradiente de densidade ou selecção negativa de neutrófilos utilizando kits especializadas com anticorpos ou magnético miçangas. No entanto, este último pode ser proibitivamente caros para a maioria dos grupos que isolam os neutrófilos de forma rotineira. Além disso, utilizar o anticoagulante heparina no tubo de recolha de sangue, enquanto que outros investigadores podem ser mais acostumados a usar o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido citrato de sódio (ACD). Como existem muitos métodos diferentes para escolher, cabe à preferência pessoal do pesquisador. Além disso,quando o isolamento e a manipulação de neutrófilos eles devem ser manuseados com algum cuidado para evitar a activação excessiva. medidas de precaução incluir: somente usando utensílios de plástico, não de vidro; filtrar-esterilizar todos os buffers para remover qualquer endotoxina contaminante; quando os neutrófilos fiação certificar-se a centrífuga é bem equilibrado para evitar vibrações excessivas; limitar, tanto quanto possível, os neutrófilos tempo permanecer num sedimento após centrifugação; não manter os neutrófilos de solução de mais do que 5 x 10 6 / mL; e realizar o experimento, logo que possível após o isolamento. Este método pode ser adaptado para medir alterações na área de pH e phagosomal ao longo do tempo, usando um conjunto fase aquecida a 37 ° C no microscópio e tendo instantâneos uma vez a cada 30-60 s a partir da mesma posição, tal como descrito para as etapas de calibragem. Pode também ser, teoricamente, adaptado para experiências de maior taxa de transferência, tais como em placas de 96 poços, e para as experiências de citometria de fluxo, onde S-1 podeser utilizada como um indicador de pH 23. No entanto, nesses ambientes, a ênfase na atividade de células individuais é substituído por um efeito mais global sobre a população de células. Este método tem como objetivo fornecer uma configuração experimental relativamente simples no qual pesquisadores individuais podem adaptar-se a adequar a sua área de interesse. Os investigadores podem deseja explorar neutrófilos pH phagosomal e área enquanto também medir movimento de outros iões, por exemplo, a concentração de cálcio intracelular. Existem várias fluorescentes indicadores de Ca2 + prontamente disponíveis por microscopia confocal, como indo-1, que também tem espectros de emissão dual a 400 e 475 nm 24. Estes comprimentos de onda de emissão não se sobrepõem com o S-1 espectros de emissão, mas o comprimento de onda de excitação é no final ultravioleta (UV) do espectro, o que pode ser prejudicial para as células, e um laser de UV não é comum em todos os microscópios. Uma revisão abrangente dos diferentes indicadores paramedir o fluxo de cálcio intracelular é coberto por Takahashi et al. 25 e Hillson et al. 26. Em conclusão, existem outros métodos disponíveis para medir o pH phagosomal utilizando diferentes corantes fluorescentes como Nunes et al. demonstraram 13, bem como outros grupos 27, 28. Outros investigadores também foram utilizados S-1 para medir citosólica pH 29 ou pH phagosomal 14. No entanto, este protocolo é único para medir simultaneamente o pH de ambos citosol e fagossoma, o que proporciona a oportunidade de observar alterações em phagosomal área da secção transversal e para distinguir entre tipo selvagem e Hvcn1 - / - neutrófilos de rato, e neutrófilos humanos com e sem um trabalho de NADPH-oxidase.

O neutrófilo é a célula imune inata mais abundante no corpo. A sua função principal consiste em patrulha a corrente sanguínea e engolindo e digerindo as partículas estranhas que podem ocorrer em um processo conhecido como fagocitose 1, 2. As partículas são degradados num compartimento intracelular chamado o fagossoma. A activação de neutrófilos oxidase de NADPH, o NOX2 isoforma, inicia uma cascata de reaces bioquicas que culmina na morte do agente patogénico. Subunidades proteicas NOX2 prosseguir para formar um complexo de cadeia de transporte de electrões na membrana phagosomal 3. Uma vez activado, que transporta electrões de NADPH através da membrana para o oxigénio molecular no interior do fagossoma, produzindo aniões superóxido e das espécies reactivas de oxigénio adicional. Isto é conhecido como a explosão respiratória, e pensa-se ser essencial para matar microbiana eficiente e digestão 2 </sup&gt;. No entanto, este movimento exclusivo de carga negativa através da membrana logo inativar NOX2 se não fosse compensada pela carga positiva entrando e / ou carga negativa saindo do fagossoma. Tem sido bem estabelecido que a maioria de compensação de carga no neutrófilo é levada a cabo pelo canal de protões HVCN1 4, 5. Esse canal permite o movimento passivo de protões para baixo do seu gradiente electroquimico do citosol para o fagossoma. concentração de protões é reflectida pelo pH, assim, para um dado nível de actividade de oxidase, medindo o pH no fagossoma pode fornecer informações sobre a contribuição relativa de vias protónicos e não protónicos em compensação de carga. O fagossoma de neutrófilos humanos tem um pH alcalino de cerca de 8,5 durante 20-30 minutos após a fagocitose 5. Isto implica a existência de canais de iões não-protões adicionais em NOX2-induzida de compensação de carga, como a fusão e a libertação dos conteúdos dos grânulos acídicos e único compensação por HVCN1 iria manter um ambiente ácido, em contraste com o observado. O movimento de iões para compensar esta carga negativa podem também exercer mudanças no tamanho do fagossoma por osmose. Estes iões podem estar presentes na neutrófilos em altas concentrações fisiológicas: iões de potássio foram mostrados para mover no fagossoma 6, e o movimento iónico é cloreto de outro candidato importante para a função dos neutrófilos 7. A regulação de pH no fagossoma é vital para a actividade de protease antimicrobiana 5. Mieloperoxidase (MPO) parece ter uma actividade tima a um pH de 6, enquanto que para a catepsina G e da elastase, os níveis óptimos são pH 7-9 e pH 8-10, respectivamente 5. Por conseguinte, a mudança transitória em pH phagosomal pode fornecer nichos de actividade para as diferentes enzimas a diversãocção. Entender como pH está envolvida na morte microbiana neutrófilos pode fornecer informações úteis para a criação de novos agentes microbianos de aumento de neutrófilos. O fagossoma neutrófilos é um ambiente altamente reactivo. Isso torna difícil avaliar com precisão pH, porque corantes podem ser facilmente oxidado, levando a artefactos técnicos. Historicamente, o isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi o corante de escolha para medir o pH intracelular 8, 9. No entanto, existem algumas desvantagens para a sua utilização na medição de pH de neutrófilos phagosomal. Ele tem um pKa de 6,4 10, o que significa que só pode precisamente ser usado para avaliar os níveis de pH 5-7,5 8, uma vez que satura a pH &lt;8 11. Como o pH neutrófilos phagosomal pode tornar-se muito mais alcalino 5, FITC não pode capturar toda a gama de potenciais alterações de pH. Um outro signifiproblema não pode com FITC no contexto de neutrófilos é que ele é pensado para ser Foto-descoloração por MPO 12. O inibidor de MPO, azida de sódio, pode ser utilizado para limitar a fotodegradação 13, mas foi demonstrado que reduz a azida de sódio directamente o pH phagosomal de forma MPO-independente e é, portanto, inadequado para uso em tais ensaios 5. Em comparação com outros corantes intracelulares, S-1 tem um nível relativamente elevado de pKa de 7,5 a 10. Em condições ácidas, a molécula é protonado e produz um sinal de emissão entre 560 e 600 nm quando excitado a 488 nm ou acima. Quando a molécula é desprotonado em condições mais alcalinas, o comprimento de onda de emissão é de mais de 600 nm. A razão entre as intensidades de fluorescência a estes dois comprimentos de onda indica a mudança de emissão, o que é mais fiável do que as medições de fluorescência únicas, uma vez que não é afectado pela concentração de fluoróforo e estrutura celular. S-1 podem ser conjugados com material antigénico, tal como o zimosano 14, embora seja preferido o calor-morto (HK) Cândida albicans, como a maior área de superfície dá uma leitura de fluorescência mais consistente. Temos também utilizado uma modificação do método para estudar alterações temporais no pH (Figura 3) 5. Este método para a medição do pH citosólico pode ser facilmente aplicado a outros tipos de células, como descrito noutro local 15, 16, e as células com fagossomas mais alcalinas 14.

<table><tbody><tr><td>Candida albicans ATCC 10231 Vitroids&nbsp; 80 UFC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RQC14003-10EA</td><td>Coloque diretamente em uma placa de ágar espalhada de acordo com as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>Caldo YPD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td>Siga as instruções do fabricante, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Dextran Grau clínico MW = 200,000-300,000</td><td>MP Biomedicals</td><td>2101514</td><td>Use luvas&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de heparina sódica para infusão (sem conservantes), 1.000 UI/mL&nbsp;</td><td>Fannin, Wockhardt UK Ltd</td><td>FP1077</td><td>Compramos da farmácia de internação UCH</td></tr><tr><td>SNARF-1 Ácido Carboxílico, Acetato, Éster Succinimidílico - Embalagem Especial</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>SS22801</td><td>Use luvas</td></tr> 5<tr><td>-(e-6)-Carboxy SNARF-1, Éster Acetoximetílico, Acetato</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>C1272</td><td>Use luvas</td></tr><tr><td>Vivaglobin solução humana IgG&nbsp; 160 mg/mL CSL</td><td> Behring</td><td>recebeu como presente</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Soro de rato normal</td><td>Abcam</td><td>ab7486</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Linfoprep (meio gradiente de densidade)</td> <td>Alere Ltd</td><td>1114547</td><td>Mantenha-se estéril e longe da luz solar direta, pode ser substituído por Ficoll-Paque</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetila (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>Existem vários provedores</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Vários existem fornecedores</td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Etanol Absoluto&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Difenileno iodônio (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cloreto de zinco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td>Existem vários fornecedores, não dilua em tampões à base de fosfato, pois precipitará</td></tr><tr><td>a lisina Poli L Sigma</td><td></td><td>P4707</td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Confocal de varredura a laser microscópio (Zeiss LSM 700)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>O microscópio deve ser capaz de excitar a 555 nm e medir a emissão em dois canais simultaneamente (560-600 nm, >610 nm)</td></tr><tr><td>Ibidi &micro; slide 8 bem ibiTreat</td><td>Thistle Scientific</td><td>IB-80826</td><td>Outras placas de imagem apropriadas podem ser substituídas</td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>Qualquer sonicador apropriado será suficiente</td></tr><tr><td>TC20 Contador de Células Automatizado</td><td>BioRad</td><td></td><td>Existem vários fornecedores</td></tr><tr><td>Tubos LoBind de proteína de 1,5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td>Especialmente usado como Candida pode aderir a eppendorfs normais</td></tr></tbody></table>

imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de ph ratiometric

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Os neutrófilos são cruciais para hospedar defesa inata e, consequentemente, constituem uma importante área de pesquisa médica. O fagossoma, o compartimento intracelular onde a matança e digestão de partículas engoliram ter lugar, é a principal arena para neutrófilos matar patógeno que exige uma regulamentação apertada. Phagosomal pH é um aspecto que é cuidadosamente controlada, por sua vez, regula a actividade de protease antimicrobiana. Muitos corantes sensíveis ao pH fluorescentes têm sido usados ​​para visualizar o ambiente phagosomal. S-1 tem várias vantagens sobre outros corantes sensíveis ao pH, incluindo o seu espectro de emissão dual, a sua resistência à foto-branqueamento, e o seu pKa elevado. Usando este método, temos demonstrado que o fagossoma neutrófilos é invulgarmente alcalina em comparação com outros fagócitos. Ao utilizar diferentes conjugações bioquímicas do corante, a fagossoma podem ser delineados a partir do citoplasma de modo que as mudanças no tamanho e forma do fagossoma pode ser avaliada. Isso permite que fou ainda a monitorização do movimento iónico.

A Figura 1 apresenta instantâneos dos neutrófilos a partir de diferentes origens para demonstrar ambientes phagosomal variados. Para facilitar a análise quantitativa, é importante para semear poços com um número adequado de células: demasiados fará com que as células de camada sobre a outra, o que torna difícil visualizar fagossomas fechados com precisão; muito poucos vontade, é claro, proporcionar menos resultados, particularmente porque nem todos os neutrófilos vai fagocitam. A Figura 2 é uma imagem que é sobre-saturado; este pode ser avaliado dividindo a imagem entre seus dois canais (usando o software microscópio recomendado na Lista de Materiais ou equivalente) - pontos vermelhos mostram onde foi detectado o máximo de fluorescência. Isto pode ser combatido através da redução da intensidade do laser. As curvas de calibrao utilizando os vários sistemas tampão são mostrados na Figura 3, adaptado de Levine et ai. 5 &lt;/ Sup&gt;. As barras de erro mostram que há alguma variação na fluorescência entre as leituras. A figura 4 dá um exemplo de como os dados para pH phagosomal e área poderia ser apresentada. Esta abordagem permite que cada medição individual a ser visualizado com um boxplot-acabada. No entanto, os dados podem também ser exibidos em um gráfico de barras do histograma. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig1.jpg" /> Figura 1: Imagens instantâneo apropriado de neutrófilos de seres humanos e ratinhos. Para o lado direito é uma chave visuais qualitativas da cor de aproximada os fagossomas S-1-coradas correspondentes ao pH. A cor amarela indica mais acidez, enquanto o vermelho indica mais alcalinidade. (A) mostra Hvcn1 - / - neutrófilos medula óssea de ratinho 20 min após a fagocitose. Os phagosomes aparecer muito vermelho, alcalina, e inchado. A seta vermelha na parte inferior direita daimagem aponta para um Cândida intracelular, enquanto que a seta no topo esquerda aponta para uma partícula extracelular. (B) mostra os neutrófilos de medula óssea de ratinho de tipo selvagem que ingeriram Candida; eles são muito menos alcalino do que Hvcn1 - / - células. (C) mostra neutrófilos de sangue periférico humano, ao mesmo ponto após a fagocitose. Eles aparecem ligeiramente mais alcalino do que as células de rato de tipo selvagem, mas os phagosomes ainda não são tão grande e vermelho como o Hcvn1 - / - células. (D) mostra neutrófilos humanos que têm fagocitados Cândida na presença de 5 uM de iodónio de difenileno (DPI). Todos os fagossomas são muito ácida, com um pH de 6 ou menos; o medicamento inibe a NADPH-oxidase, de modo que não existe movimento de iões de compensação. Os protões libertados a partir dos grânulos acídicos que se fundem com a fagossoma fazer com que o pH ácido 20, e aumento do recrutamento da V-ATPase ao thphagosomal membrana e, após tratamento com o DPI 9. O citoplasma também aparece mais alcalina em comparação com as células a partir das outras condições. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig2.jpg" /> Figura 2: O excesso de saturação de Hvcn1 - / - de ratinho neutrófilos de medula óssea. É importante excluir a partir das imagens de análise em que os dados de fluorescência são sobre-saturada. Tal como descrito na secção 5.3, a imagem compósita é dividida em duas imagens (parte superior esquerda, seta vermelha) com ambos os canais apresentados individualmente. Neste software, indicador de gama é verificada em (na parte inferior esquerda, seta vermelha), então quaisquer pixels que são mais saturado são vermelho brilhante. Não é sobre-saturação presente em ambos os canais (1 e 2). A magnificação de algumas células e extracelular Candida é mostrado no canto inferior direito, com as setas que apontam para as áreas afectadas. Analisando estes pontos levaria a uma medida ratiometric falsa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig3.jpg" /> Figura 3: Curvas de calibração padrão para a conversão de S-1 proporções de fluorescência para medições de pH. As curvas padrão para Candida isoladamente em diferentes tampões (marcados como &quot;Tris&quot;) e, quando as células são permeabilizadas com saponina ( &quot;saponina&quot;) são muito semelhantes, mostrando que o S-1 de leitura dentro e fora da célula (fagossoma e extracelular médio) são comparáveis. As barras de erro representam a média ± SD. A curva em S-1 / relação de pH é reduzido quando testado in o citoplasma ( &quot;citoplasma&quot;), que devem ser levados em consideração na análise de imagem. Esta figura foi modificado a partir de Levine et ai. 5. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig4.jpg" /> Figura 4: Quantificação do pH phagosomal e área. Esta figura apresenta um exemplo de apresentação de dados. Os gráficos foram gerados utilizando o software de programação R. A: mostra proporção phagosomal e correspondente pH para A (Hvcn1 - / - de ratinho neutrófilos de medula óssea), B: neutrófilos de medula óssea de ratinho de tipo selvagem, C: neutrófilos de sangue periférico humano, e D: humano neutrófilos com 5 uM DPI n = 3/300. medições individuais são mostrados como quadrados pequenos, com uma sobreposição de boxplot com medium e variação interquartil. Uma barra vermelha representa a média. Como se vê nas imagens na Figura 1, Hvcn1 - / - células têm fagossomas muito alcalinas, em comparação com rato de tipo selvagem e os neutrófilos humanos. Eles também têm uma área maior phagosomal (Figura 4B, n = 3/300). fagossomas neutrófilos humanos são ligeiramente mais alcalino e maior do que os neutrófilos de rato de tipo selvagem, enquanto que os neutrófilos humanos incubados com DPI têm fagossomas muito ácidas e pequenas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table><tbody><tr><td colspan="4"> Solução salina equilibrada (BSS) tampão </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 156 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 3 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 2 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,25 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 2 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 10 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> pH 7,4 com NaOH ou HCl </td></tr><tr><td colspan="4"> caldo YPD </td></tr><tr><td> caldo YPD </td><td> 50 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Água destilada </td><td> 1? L </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Autoclave a 121 ° C durante 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> Para agar YPD: antes da autoclavagem, adicionar 15 g / L de ágar </td></tr><tr><td colspan="4"> Solução de Dextrano 10% </td></tr><tr><td> grau clínico dextrano </td><td></td><td> 50 g </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td> &lt;td&gt; </td><td> 4,5 g </td><td></td></tr><tr><td> Água destilada </td><td></td><td> 500 ml </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Adicionar ao frasco de vidro e autoclave a 121 ° C durante 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> 2x solução salina </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 18 g </td><td></td></tr><tr><td> Água destilada </td><td></td><td> 1? L </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Adicionar ao frasco de vidro e autoclave a 121 ° C durante 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> Estoque Saponina 10% </td></tr><tr><td> tampão BSS </td><td></td><td> 50 ml </td><td></td></tr><tr><td> saponina </td><td></td><td> 5 g </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> tampão BSS calor a 37 ° C, adicionar saponina e misturar. </td></tr><tr><td colspan="4"> Adiciona-se 0,1% de azida de sódio como conservante, mistura armazenar a 4 ° C. </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td colspan="4"> buffers de calibração </td></tr><tr><td colspan="4"> Candida curva padrão </td></tr><tr><td colspan="4"> Em primeiro lugar faz-se estoque de cada tampão de 0,15 M </td></tr><tr><td colspan="4"> Adicione-se uma solução 0,15 M de NaCl </td></tr><tr><td colspan="4"> 15 mL de volume final: 5 mL de 0,15 M de solução tampão desejado + 10 mL de soluo de NaCl 0,15 M </td></tr><tr><td> pH 3 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> glicina 50 mM </td><td></td></tr><tr><td> pH 4 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> 50 mM de acetato </td><td></td></tr><tr><td> pH 5 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> 50 mM de acetato </td><td></td></tr><tr><td> pH 6 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> 50 mM de acetato </td><td></td></tr><tr><td> pH 7 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> Tris 50 mM </td><td></td></tr><tr><td> pH 8 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> Tris 50 mM </td><td></td></tr><tr><td> pH 9 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> Tris 50 mM </td><td></td></tr><tr><td> pH 10 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> glicina 50 mM </td><td></td></tr><tr><td> pH 11 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> fosfato 50 mM </td><td></td></tr><tr><td> pH 12 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> fosfato 50 mM </td><td></td></tr><tr><td> pH 13 </td><td> 100 mM de NaCl </td><td> fosfato 50 mM </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Curva padrão citosólica </td></tr><tr><td colspan="4"> Use previamente feitos 0,15 M soluções tampão de estoque </td></tr><tr><td colspan="4"> Adicione-se uma solução 0,15 M de KCl </td></tr><tr><td colspan="4"> 15 mL de volume final: 5 mL de 0,15 M de solução de + 10 mL de 0,15 M de KCl tampão desejado </td></tr><tr><td colspan="4"> estoque 10 mM de nigericina em etanol, adicionar 15 ul de cada solução volume final </td></tr><tr><td> pH 3 </td><td> 100 mM de KCl </td&gt; <td> glicina 50 mM </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 4 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> 50 mM de acetato </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 5 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> 50 mM de acetato </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 6 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> 50 mM de acetato </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 7 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> Tris 50 mM </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 8 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> Tris 50 mM </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 9 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> Tris 50 mM </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 10 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> glicina 50 mM </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 11 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> fosfato 50 mM </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 12 </td&gt; <td> 100 mM de KCl </td><td> fosfato 50 mM </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td> pH 13 </td><td> 100 mM de KCl </td><td> fosfato 50 mM </td><td> nigericina 10 uM </td></tr><tr><td colspan="4"> pH de todas as soluções de calibração, quer com HCl ou NaOH </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Composição de buffers. Esta tabela descreve as composições apropriadas dos diferentes tamps utilizados no protocolo. Arquivo de código suplementar. Este arquivo contém um número de macros, escrito por AP Levine, que são necessários para análise de imagem. Os autores seriam felizes para tentar resolver quaisquer consultas associadas à utilização deste código. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55107/Phagosomal_measurement.txt" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

Este manuscrito descreve um método simples para medir o pH e phagosomal área, bem como o pH citoplasmática de neutrófilos humanos e de rato utilizando o indicador de medida proporcional seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Isto é conseguido usando microscopia de fluorescência confocal ao vivo de células e análise de imagem.

Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

O objetivo geral desta técnica de microscopia confocal é obter imagens do pH e da área da vacuolo fagocítico e do citoplasma do neutrófilo. Este método permite o monitoramento e a quantificação de mudanças dinâmicas no pH do vacúolo fagocítico e do citoplasma, bem como do volume do vacúolo fagocítico. Essas medidas variam com a atividade da NADPH oxidase e podem ser usadas como marcadores indiretos de sua função e das trocas iônicas através da membrana do vacúolo fagocítico.A principal vantagem desta técnica é que tanto o fagossomo quanto o citoplasma podem ser simultaneamente visualizados com um corante que possui uma ampla faixa de pH. Para iniciar este procedimento, prepare uma alíquota de carboxi-S-1 succinimidil éster diluindo 50 microgramas dele em 100 microlitros de DMSO de alta pureza. Agite bem em vórtex para homogeneizar.Em seguida, prepare um mililitro de Candida morta pelo calor, ou HK, a uma concentração de um vezes 10 à oitava, em bicarbonato de sódio 0,1 molar em um tubo de 15 mililitros. Adicione 100 microlitros de carboxi-S-1, uma gota de cada vez, à Candida HK, sob agitação em vórtex a 2.000 RPM. Após isso, envolva o tubo com papel alumínio e coloque-o em um rolo agitador à temperatura ambiente por uma hora.Após uma hora, lave as HKC-S-1 três vezes por centrifugação a 2.250 × g durante 10 minutos cada vez. Para as duas primeiras lavagens, re-suspenda o pellet em 15 mililitros de bicarbonato de sódio 0,1 molar. Após a terceira lavagem, re-suspenda-o em um mililitro de tampão BSS.Transfira a suspensão de HKC-S-1 para tubos com alíquotas de 100 microlitros e armazene-os a menos 20 graus Celsius. Para opsonizar HKC-S-1 para neutrófilos humanos, adicione 100 microlitros de soro IGG humano a 100 microlitros de HKC-S-1 descongelado. Misture em agitador térmico a 37 graus Celsius e 1.100 RPM por 60 a 90 minutos, e depois em rolo, a quatro graus Celsius por duas horas.Após isso, lave a amostra três vezes em tampão BSS por centrifugação a 17.000 vezes g durante um minuto cada vez. Posteriormente, re-suspenda a amostra em 100 microlitros de tampão BSS. Para neutrófilos do sangue periférico humano, colete 15 mililitros de sangue por punção venosa de um doador saudável e transfira para uma seringa de 20 mililitros contendo 90 microlitros de solução de heparina sódica a 1.000 UI por mililitro.Usando uma ponteira de pipeta, injete 1,5 mililitros de solução de dextrana 10% na seringa. Inverta-a suavemente três vezes e, em seguida, deixe-a em posição ereta sobre a bancada por 30 a 60 minutos. Após 30 a 60 minutos, o sangue deverá se separar aproximadamente ao meio, com uma camada superior esverdeada de camada de buffy coat e uma camada inferior contendo eritrócitos.Empurre cuidadosamente a camada superior através de uma agulha ou remova-a com a ponteira de uma pipeta, depois transfira-a para um tubo de 15 mililitros e evite retirar a camada vermelha. Usando uma pipeta de cinco mililitros, adicione três a quatro mililitros de meio de gradiente de densidade na parte inferior do tubo, abaixo da camada de buffy coat, para obter duas camadas distintas. Em seguida, centrifugue a amostra a 900 vezes g por 10 minutos.Descarte o sobrenadante e deixe o pellet vermelho para trás. Em seguida, vorteie suavemente para dispersar o pellet. Depois, adicione sete mililitros de água destilada autoclavada ao pellet e inverta o tubo por 20 segundos para re-suspender o pellet.Em seguida, adicione sete mililitros de salina 2x e inverta algumas vezes para misturar, lisando as células vermelhas remanescentes; então, centrifugue a amostra a 300 ×g por cinco minutos. Deseje o sobrenadante e re-suspenda o pellet em tampão BSS até aproximadamente quatro vezes 10 à sexta por mililitro. Neste procedimento, pré-trate uma placa de microscopia com oito poços com 200 microlitros de poli-L-lisina em cada poço, durante 40 a 60 minutos à temperatura ambiente; em seguida, remova a poli-L-lisina e lave os poços duas vezes com 200 microlitros de água destilada.Em seguida, adicione 200 microlitros da suspensão celular preparada em cada poço e incube à temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Depois disso, prepare uma alíquota de éster S-1-AM adicionando 100 microlitros de DMSO de alta pureza a um tubo e agite em vórtex para homogeneizar. Em um tubo pequeno, adicione 1,7 mililitros de tampão BSS e 20 microlitros de S-1-AM e agite a mistura em vórtex.Em seguida, lave as cavidades duas vezes com 200 microlitros de tampão BSS e substitua o tampão pela solução S-1-AM. Tenha cuidado para não perturbar a monocamada celular aderida ao fundo das cavidades, pipetando suavemente o líquido pela parede das cavidades. Posteriormente, incube a amostra à temperatura ambiente por pelo menos 25 minutos.Em seguida, lave as cavidades duas vezes com 200 microlitros de tampão BSS. Para testar um inibidor, prepare uma mistura-mestra da droga apropriada em tampão BSS e lave as cavidades duas vezes com essa solução. Em seguida, sonique o HKC-S-1 opsonizado por aproximadamente três segundos a cinco microns e adicione 10 microlitros do material a cada cavidade, depois incube a placa a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos, deixando as células prontas para serem observadas em imagens de momentos da fagocitose.Usando um microscópio confocal, ajuste o comprimento de onda do laser para que as células sejam excitadas em 555 nanômetros e a emissão seja detectada por dois detectores entre 560 e 600 nanômetros e acima de 610 nanômetros. Em seguida, visualize as células usando uma objetiva de imersão a óleo de 63X. Utilize uma varredura em mosaico na configuração contínua para visualizar o quadro central.Usando a intensidade da fluorescência e o ganho dos canais do detector, ajuste o foco e a intensidade do laser e o ganho dos dois canais para otimizar a imagem. Em seguida, divida a imagem usando as configurações para visualizar ambos os canais. Antes do início do experimento, verifique se não há saturação da intensidade de fluorescência no citoplasma ou nas vacúolos, o que apareceria como pontos vermelhos.Se for o caso, reduza a intensidade do laser de modo que haja um número mínimo de pontos vermelhos, mas as células e fagossomos estejam suficientemente brilhantes e nítidos para serem vistos. Neste procedimento, abra o ImageJ e carregue o arquivo de imagem escolhido para análise na barra de ferramentas. Para combinar os dois canais, use Imagem, Cor e, em seguida, Tornar Composto.Clique com o botão direito para escolher um arquivo para armazenar os resultados. Em seguida, clique na Ferramenta de Linha na barra de ferramentas e clique duas vezes para aumentar a largura para dois. Trace uma linha através da largura de um fagossomo e clique com o botão direito para medir o pH.O pH citoplasmático pode ser medido da mesma forma traçando uma linha através do citoplasma. Após concluir as medições, clique com o botão direito para escolher Salvar Arquivo. Para medir a área do fagossomo, use o quarto ícone na barra de ferramentas para desenhar livremente ao redor da área.Posteriormente, clique com o botão direito para selecionar Medir Área. Abaixo encontra-se uma chave visual qualitativa com a cor aproximada dos fagossomos corados com S-1 correspondentes ao pH. A cor amarela indica maior acidez, enquanto a vermelha indica maior alcalinidade.Esta imagem mostra neutrófilos da medula óssea de camundongos que não possuem o canal Hvcn1, 20 minutos após a fagocitose. Os fagossomos aparecem muito vermelhos, alcalinos e inchados. A seta vermelha aponta para uma Candida intracelular, enquanto esta seta aponta para uma Candida extracelular.Esta imagem mostra neutrófilos da medula óssea de camundongo tipo selvagem que ingeriram Candida. Eles são muito menos alcalinos do que os neutrófilos de camundongo com deleção de Hvcn1. Esta imagem mostra neutrófilos do sangue periférico humano no mesmo ponto temporal após a fagocitose.Eles parecem ligeiramente mais alcalinos do que as células selvagens de camundongo, mas os fagossomos ainda não são tão grandes e vermelhos quanto nas células com deleção de Hvcn1, e esta imagem mostra neutrófilos humanos que fagocitaram Candida na presença de cinco micromolares de iodônio difenilenico. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente quatro a cinco horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado ao isolar os neutrófilos para que eles não sejam ativados.Para determinar se os efeitos observados em alterações no pH vacuolar ou citosólico ou no volume vacuolar são devidos a mudanças no surto respiratório, esse surto respiratório pode ser medido por outros métodos que quantifiquem diretamente a produção de radicais livres ou o consumo de oxigênio. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar neutrófilos humanos, bem como corar e imaginar o fagossomo e o citoplasma. Não se esqueça de que o trabalho com amostras de sangue humano pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e roupas protetoras, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

imaging-neutrophil-phagosome-cytoplasm-using-ratiometric-ph

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

Este vídeo demonstra um ensaio para monitorar eventos independentes de fagocitose de glóbulos vermelhos mediados por macrófagos. As hemácias humanas opsonizadas com imunoglobulina G (IgG) de camundongo são incubadas com macrófagos de camundongo e observadas em microscópio confocal. As hemácias são engolfadas por macrófagos por meio de uma formação de copo fagocítico e direcionadas para degradação lisossômica.

Imagem em tempo real da fagocitose de macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados por IgG

Este vídeo demonstra uma técnica de microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) de alta resolução para visualização em tempo real da formação e fechamento de fagossomos durante a fagocitose mediada por macrófagos de glóbulos vermelhos opsonizados (RBCs) opsonizados por IgG presos à superfície de um prato de fundo de vidro. Os macrófagos estendem os pseudópodes ao redor das hemácias e os engolfam dentro dos fagossomos, destacando-os da superfície do vidro.

Visualização baseada em microscopia TIRF da formação e fechamento de fagossomos

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

O pH fagossômico influencia a maturação do fagossomo, a produção de oxidantes, a morte fagossômica, bem como a apresentação do antígeno. Aqui descrevemos um método raciométrico para medir as mudanças de pH no curso do tempo e no ponto final em fagossomos individuais em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência.

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Aqui descrevemos uma técnica baseada em microscópio para visualizar e quantificar as primeiras cascatas de eventos durante a fagocitose de patógenos como os fungos Candida albicans e partículas maiores que 0,5 μm, incluindo zimosana e grânulos revestidos de IgG.

Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a atividade antifúngica de células imunes humanas primárias em tempo real usando fluorescente Aspergillus repórter conídios em conjunto com microscopia de vídeo ao vivo de células e citometria de fluxo. Dados gerados fornecer informações sobre hospedeiras cell- interacções Aspergillus tais como actividade fungicida, a fagocitose, a migração de células e inibição do crescimento de fungos.

Imagens ao vivo de antifúngicos Atividade por neutrófilos humanos primários e monócitos em resposta à<em&gt; A. fumigatus</em

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Doenças neurodegenerativas estão associadas a funções de microglia disreguladas. Este artigo descreve um ensaio in vitro de fagocitose de células neuroblastoma por macrófagos iPSC. As leituras quantitativas de microscopia são descritas tanto para imagens de lapso de tempo de células vivas quanto para imagens de alto conteúdo de células fixas.

Ensaio de imagem quantitativa in vitro para fagocitose de células de neuroblastoma morto por iPSC-Macrófagos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Aprenda a medir o pH fagossomal e citoplasmático em neutrófilos humanos e de camundongo utilizando o indicador ratiométrico SNARF-1 e microscopia confocal. Este método permite monitorar mudanças dinâmicas de pH e volume vacuolar.

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