Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric

O objetivo geral desta técnica de microscopia confocal é obter imagens do pH e da área do vacúolo fagocítico de neutrófilos e do citoplasma. Este método permite o monitoramento e quantificação de mudanças dinâmicas no pH no vacúolo fagocítico e no citoplasma, e também no volume do vacúolo fagocítico. Essas medições mudam com a atividade da NADPH oxidase e podem ser usadas como marcadores substitutos de sua função e dos fluxos de íons através da membrana do vacúolo fagocítico.

A principal vantagem dessa técnica é que tanto o fagossomo quanto o citoplasma podem ser visualizados simultaneamente com um corante que possui uma ampla faixa de pH. Para iniciar este procedimento, prepare uma alíquota de éster succinimidílico carboxi-S-1 diluindo 50 microgramas em 100 microlitros de DMSO de alta qualidade. Vortex bem para misturar.

Em seguida, prepare um mililitro de um vezes 10 elevado ao oitavo calor morto ou HK Candida em bicarbonato de sódio 0,1 molar em um tubo de 15 mililitros. Adicione 100 microlitros de carboxi-S-1, uma gota de cada vez, à HK Candida enquanto mistura em um vórtice a 2.000 RPM. Depois disso, enrole o tubo com papel alumínio e coloque-o em um rolo em temperatura ambiente por uma hora.

Após uma hora, lave o HKC-S-1 três vezes por centrifugação a 2.250 vezes g por 10 minutos de cada vez. Para as duas primeiras lavagens, ressuspenda o pellet em 15 mililitros de bicarbonato de sódio 0,1 molar. Após a terceira lavagem, suspenda-o novamente em um mililitro de tampão BSS.

Transfira a suspensão HKC-S-1 para os tubos de alíquotas de 100 microlitros e armazene-os a menos 20 graus Celsius. Para opsonizar HKC-S-1 para neutrófilos humanos, adicione 100 microlitros de soro IGG humano a 100 microlitros de HKC-S-1 descongelado. Misture em uma coqueteleira a 37 graus Celsius e 1.1000 RPM por 60 a 90 minutos e, em seguida, em um rolo, a quatro graus Celsius por duas horas.

Depois disso, lave a amostra três vezes em tampão BSS por centrifugação a 17.000 vezes g por um minuto cada. Posteriormente, ressuspenda a amostra em 100 microlitros de tampão BSS. Para neutrófilos do sangue periférico humano, pegue 15 mililitros de sangue por punção venosa de um doador saudável e transfira-o para uma seringa de 20 mililitros contendo 90 microlitros de solução de heparina sódica a 1.000 UI por mililitro.

Usando uma ponta de pipeta, injete 1,5 mililitros de solução de dextrana a 10% na seringa. Inverta-o suavemente três vezes e deixe-o em pé no banco por 30 a 60 minutos. Após 30 a 60 minutos, o sangue deve se dividir aproximadamente ao meio, com uma camada superior de pelagem amarelada cor de palha e uma camada inferior contendo eritrócitos.

Empurre cuidadosamente a camada superior através de uma agulha ou remova-a com uma ponta de pipeta, depois transfira-a para um tubo de 15 mililitros e evite retirar a camada vermelha. Usando uma pipeta de cinco mililitros, adicione três a quatro mililitros de meio gradiente de densidade ao fundo do tubo, abaixo da camada de revestimento leucocitário, para obter duas camadas distintas. Em seguida, centrifugue a amostra a 900 vezes g durante 10 minutos.

Despeje o sobrenadante e deixe o pellet vermelho para trás. Em seguida, bata suavemente para perturbar o pellet. Em seguida, adicione sete mililitros de água destilada autoclavada ao pellet e inverta-o por 20 segundos para ressuspender o pellet.

Em seguida, adicione sete mililitros de solução salina 2x e inverta algumas vezes para misturar, lisando os glóbulos vermelhos restantes, depois centrifugue a amostra a 300 vezes g por cinco minutos. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet no tampão BSS para aproximadamente quatro vezes 10 elevado ao sexto por mililitro. Neste procedimento, pré-trate uma placa de microscopia de oito poços com 200 microlitros de poli-L-lisina em cada poço por 40 a 60 minutos em temperatura ambiente, depois remova a poli-L-lisina e lave os poços duas vezes com 200 microlitros de água destilada.

Em seguida, adicione 200 microlitros da suspensão de células preparadas a cada poço e incube-o em temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Depois disso, prepare uma alíquota de éster S-1-AM adicionando 100 microlitros de DMSO de alta qualidade a um tubo e vórtice para misturar. Em um tubo pequeno, adicione 1,7 mililitros de tampão BSS e 20 microlitros de S-1-AM e vortex a mistura.

Em seguida, lave os poços duas vezes com 200 microlitros de tampão BSS e substitua o tampão por solução S-1-AM. Tome cuidado para não perturbar a monocamada de células presa ao fundo do poço, pipetando suavemente o líquido pela parede dos poços. Em seguida, incubar a amostra à temperatura ambiente durante, pelo menos, 25 minutos.

Em seguida, lave os poços duas vezes com 200 microlitros de tampão BSS. Para testar um inibidor, faça uma mistura principal do medicamento apropriado no tampão BSS e lave os poços duas vezes com ele. Em seguida, sonicar o HKC-S-1 opsonizado por aproximadamente três segundos a cinco mícrons e adicionar 10 microlitros a cada poço, depois incubar a placa a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos, deixando as células prontas para serem visualizadas para instantâneos de fagocitose.

Usando um microscópio confocal, ajuste o comprimento de onda do laser para que as células sejam excitadas em 555 nanômetros e a emissão seja detectada por dois detectores em 560 a 600 nanômetros e mais de 610 nanômetros. Em seguida, visualize as células usando uma lente de imersão em óleo 63X. Use uma imagem de digitalização de bloco na configuração contínua para exibir o bloco central.

Usando a intensidade de fluorescência e o ganho dos canais detectores, ajuste o foco e a intensidade do laser e o ganho dos dois canais para otimizar a imagem. Depois disso, divida a imagem usando as configurações para visualizar os dois canais. Antes do início do experimento, verifique se não há saturação da intensidade de fluorescência no citoplasma ou vacúolos, que apareceriam como pontos vermelhos.

Nesse caso, reduza a intensidade do laser para que haja um número mínimo de pontos vermelhos, mas as células e os fagossomos sejam brilhantes e claros o suficiente para serem vistos. Neste procedimento, abra o ImageJ e carregue o arquivo de imagem escolhido para análise na barra de ferramentas. Para combinar os dois canais, use Imagem, Cor e, em seguida, Criar composto.

Clique com o botão direito do mouse para escolher um arquivo para armazenar os resultados. Em seguida, clique na ferramenta Linha na barra de ferramentas e clique duas vezes para aumentar a largura para dois. Desenhe uma linha na largura de um fagossomo e clique com o botão direito para medir o pH.

O pH citoplasmático pode ser medido da mesma maneira, traçando uma linha através do citoplasma. Depois de terminar as medições, clique com o botão direito do mouse para escolher Salvar arquivo. Para medir a área do fagossomo, use o quarto ícone ao longo da barra de ferramentas para desenhar à mão livre ao redor da área.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse para selecionar Área de medida. Aqui está uma chave visual qualitativa da cor aproximada dos fagossomos corados com S-1 correspondentes ao pH. A cor amarela indica mais acidez, enquanto o vermelho indica mais alcalinidade.

Esta imagem mostra neutrófilos da medula em camundongos sem o canal Hvcn1 20 minutos após a fagocitose. Os fagossomos parecem muito vermelhos, alcalinos e inchados. A seta vermelha aqui aponta para uma Candida intracelular, enquanto esta seta aponta para uma Candida extracelular.

Esta imagem mostra neutrófilos da medula óssea de camundongos do tipo selvagem que ingeriram Candida. Eles são muito menos alcalinos do que os neutrófilos knockout para Hvcn1. Esta imagem mostra neutrófilos do sangue periférico humano no mesmo momento após a fagocitose.

Eles parecem um pouco mais alcalinos do que as células do tipo selvagem de camundongo, mas os fagossomos ainda não são tão grandes e vermelhos quanto as células nocaute para Hvcn1, e esta imagem mostra neutrófilos humanos que fagocitaram Candida na presença de cinco difenileno iodônio micromolar. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente quatro a cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter cuidado ao isolar os neutrófilos para que eles não sejam ativados.

Para determinar se os efeitos que se vê nas mudanças no pH vacuolar ou citosólico ou no volume vacuolar são devidos a mudanças na explosão respiratória, essa explosão respiratória pode ser medida de outras maneiras que medem diretamente a produção de radicais livres ou o consumo de oxigênio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar neutrófilos humanos e, em seguida, corar e visualizar o fagossomo e o citoplasma. Não se esqueça de que trabalhar com amostras de sangue humano pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas e roupas de proteção devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.