Imaging o neutrófilos fagossoma e citoplasma utilizando um indicador de pH Ratiometric
5 de abril de 2017
Este manuscrito descreve um método simples para medir o pH e phagosomal área, bem como o pH citoplasmática de neutrófilos humanos e de rato utilizando o indicador de medida proporcional seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ou S-1. Isto é conseguido usando microscopia de fluorescência confocal ao vivo de células e análise de imagem.
O objetivo geral desta técnica de microscopia confocal é obter imagens do pH e da área da vacuolo fagocítico e do citoplasma do neutrófilo. Este método permite o monitoramento e a quantificação de mudanças dinâmicas no pH do vacúolo fagocítico e do citoplasma, bem como do volume do vacúolo fagocítico. Essas medidas variam com a atividade da NADPH oxidase e podem ser usadas como marcadores indiretos de sua função e das trocas iônicas através da membrana do vacúolo fagocítico.
A principal vantagem desta técnica é que tanto o fagossomo quanto o citoplasma podem ser simultaneamente visualizados com um corante que possui uma ampla faixa de pH. Para iniciar este procedimento, prepare uma alíquota de carboxi-S-1 succinimidil éster diluindo 50 microgramas dele em 100 microlitros de DMSO de alta pureza. Agite bem em vórtex para homogeneizar.
Em seguida, prepare um mililitro de Candida morta pelo calor, ou HK, a uma concentração de um vezes 10 à oitava, em bicarbonato de sódio 0,1 molar em um tubo de 15 mililitros. Adicione 100 microlitros de carboxi-S-1, uma gota de cada vez, à Candida HK, sob agitação em vórtex a 2.000 RPM. Após isso, envolva o tubo com papel alumínio e coloque-o em um rolo agitador à temperatura ambiente por uma hora.
Após uma hora, lave as HKC-S-1 três vezes por centrifugação a 2.250 × g durante 10 minutos cada vez. Para as duas primeiras lavagens, re-suspenda o pellet em 15 mililitros de bicarbonato de sódio 0,1 molar. Após a terceira lavagem, re-suspenda-o em um mililitro de tampão BSS.
Transfira a suspensão de HKC-S-1 para tubos com alíquotas de 100 microlitros e armazene-os a menos 20 graus Celsius. Para opsonizar HKC-S-1 para neutrófilos humanos, adicione 100 microlitros de soro IGG humano a 100 microlitros de HKC-S-1 descongelado. Misture em agitador térmico a 37 graus Celsius e 1.100 RPM por 60 a 90 minutos, e depois em rolo, a quatro graus Celsius por duas horas.
Após isso, lave a amostra três vezes em tampão BSS por centrifugação a 17.000 vezes g durante um minuto cada vez. Posteriormente, re-suspenda a amostra em 100 microlitros de tampão BSS. Para neutrófilos do sangue periférico humano, colete 15 mililitros de sangue por punção venosa de um doador saudável e transfira para uma seringa de 20 mililitros contendo 90 microlitros de solução de heparina sódica a 1.000 UI por mililitro.
Usando uma ponteira de pipeta, injete 1,5 mililitros de solução de dextrana 10% na seringa. Inverta-a suavemente três vezes e, em seguida, deixe-a em posição ereta sobre a bancada por 30 a 60 minutos. Após 30 a 60 minutos, o sangue deverá se separar aproximadamente ao meio, com uma camada superior esverdeada de camada de buffy coat e uma camada inferior contendo eritrócitos.
Empurre cuidadosamente a camada superior através de uma agulha ou remova-a com a ponteira de uma pipeta, depois transfira-a para um tubo de 15 mililitros e evite retirar a camada vermelha. Usando uma pipeta de cinco mililitros, adicione três a quatro mililitros de meio de gradiente de densidade na parte inferior do tubo, abaixo da camada de buffy coat, para obter duas camadas distintas. Em seguida, centrifugue a amostra a 900 vezes g por 10 minutos.
Descarte o sobrenadante e deixe o pellet vermelho para trás. Em seguida, vorteie suavemente para dispersar o pellet. Depois, adicione sete mililitros de água destilada autoclavada ao pellet e inverta o tubo por 20 segundos para re-suspender o pellet.
Em seguida, adicione sete mililitros de salina 2x e inverta algumas vezes para misturar, lisando as células vermelhas remanescentes; então, centrifugue a amostra a 300 ×g por cinco minutos. Deseje o sobrenadante e re-suspenda o pellet em tampão BSS até aproximadamente quatro vezes 10 à sexta por mililitro. Neste procedimento, pré-trate uma placa de microscopia com oito poços com 200 microlitros de poli-L-lisina em cada poço, durante 40 a 60 minutos à temperatura ambiente; em seguida, remova a poli-L-lisina e lave os poços duas vezes com 200 microlitros de água destilada.
Em seguida, adicione 200 microlitros da suspensão celular preparada em cada poço e incube à temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Depois disso, prepare uma alíquota de éster S-1-AM adicionando 100 microlitros de DMSO de alta pureza a um tubo e agite em vórtex para homogeneizar. Em um tubo pequeno, adicione 1,7 mililitros de tampão BSS e 20 microlitros de S-1-AM e agite a mistura em vórtex.
Em seguida, lave as cavidades duas vezes com 200 microlitros de tampão BSS e substitua o tampão pela solução S-1-AM. Tenha cuidado para não perturbar a monocamada celular aderida ao fundo das cavidades, pipetando suavemente o líquido pela parede das cavidades. Posteriormente, incube a amostra à temperatura ambiente por pelo menos 25 minutos.
Em seguida, lave as cavidades duas vezes com 200 microlitros de tampão BSS. Para testar um inibidor, prepare uma mistura-mestra da droga apropriada em tampão BSS e lave as cavidades duas vezes com essa solução. Em seguida, sonique o HKC-S-1 opsonizado por aproximadamente três segundos a cinco microns e adicione 10 microlitros do material a cada cavidade, depois incube a placa a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos, deixando as células prontas para serem observadas em imagens de momentos da fagocitose.
Usando um microscópio confocal, ajuste o comprimento de onda do laser para que as células sejam excitadas em 555 nanômetros e a emissão seja detectada por dois detectores entre 560 e 600 nanômetros e acima de 610 nanômetros. Em seguida, visualize as células usando uma objetiva de imersão a óleo de 63X. Utilize uma varredura em mosaico na configuração contínua para visualizar o quadro central.
Usando a intensidade da fluorescência e o ganho dos canais do detector, ajuste o foco e a intensidade do laser e o ganho dos dois canais para otimizar a imagem. Em seguida, divida a imagem usando as configurações para visualizar ambos os canais. Antes do início do experimento, verifique se não há saturação da intensidade de fluorescência no citoplasma ou nas vacúolos, o que apareceria como pontos vermelhos.
Se for o caso, reduza a intensidade do laser de modo que haja um número mínimo de pontos vermelhos, mas as células e fagossomos estejam suficientemente brilhantes e nítidos para serem vistos. Neste procedimento, abra o ImageJ e carregue o arquivo de imagem escolhido para análise na barra de ferramentas. Para combinar os dois canais, use Imagem, Cor e, em seguida, Tornar Composto.
Clique com o botão direito para escolher um arquivo para armazenar os resultados. Em seguida, clique na Ferramenta de Linha na barra de ferramentas e clique duas vezes para aumentar a largura para dois. Trace uma linha através da largura de um fagossomo e clique com o botão direito para medir o pH.
O pH citoplasmático pode ser medido da mesma forma traçando uma linha através do citoplasma. Após concluir as medições, clique com o botão direito para escolher Salvar Arquivo. Para medir a área do fagossomo, use o quarto ícone na barra de ferramentas para desenhar livremente ao redor da área.
Posteriormente, clique com o botão direito para selecionar Medir Área. Abaixo encontra-se uma chave visual qualitativa com a cor aproximada dos fagossomos corados com S-1 correspondentes ao pH. A cor amarela indica maior acidez, enquanto a vermelha indica maior alcalinidade.
Esta imagem mostra neutrófilos da medula óssea de camundongos que não possuem o canal Hvcn1, 20 minutos após a fagocitose. Os fagossomos aparecem muito vermelhos, alcalinos e inchados. A seta vermelha aponta para uma Candida intracelular, enquanto esta seta aponta para uma Candida extracelular.
Esta imagem mostra neutrófilos da medula óssea de camundongo tipo selvagem que ingeriram Candida. Eles são muito menos alcalinos do que os neutrófilos de camundongo com deleção de Hvcn1. Esta imagem mostra neutrófilos do sangue periférico humano no mesmo ponto temporal após a fagocitose.
Eles parecem ligeiramente mais alcalinos do que as células selvagens de camundongo, mas os fagossomos ainda não são tão grandes e vermelhos quanto nas células com deleção de Hvcn1, e esta imagem mostra neutrófilos humanos que fagocitaram Candida na presença de cinco micromolares de iodônio difenilenico. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente quatro a cinco horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado ao isolar os neutrófilos para que eles não sejam ativados.
Para determinar se os efeitos observados em alterações no pH vacuolar ou citosólico ou no volume vacuolar são devidos a mudanças no surto respiratório, esse surto respiratório pode ser medido por outros métodos que quantifiquem diretamente a produção de radicais livres ou o consumo de oxigênio. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar neutrófilos humanos, bem como corar e imaginar o fagossomo e o citoplasma. Não se esqueça de que o trabalho com amostras de sangue humano pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e roupas protetoras, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.
Visão Geral
Este manuscrito descreve um método para medir o pH e a área fagosômicos, bem como o pH citoplasmático de neutrófilos humanos e de camundongo, utilizando o indicador ratiométrico seminaphthorhodafluor (SNARF)-1. A técnica emprega microscopia de fluorescência confocal em células vivas e análise de imagens para monitorar alterações dinâmicas no pH e no volume da vacuolo fagocítico.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunologia
Contexto
- Compreender a função dos neutrófilos é essencial para obter informações sobre as respostas imunes.
- A fagocitose envolve mudanças dinâmicas no pH e no volume da vacuolo.
- SNARF-1 é um corante sensível ao pH adequado para imagem em células vivas.
- A microscopia confocal permite a obtenção de imagens com alta resolução de processos celulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para medir o pH em neutrófilos.
- Avaliar a relação entre alterações de pH e a atividade da NADPH oxidase.
- Fornecer uma ferramenta para estudar os fluxos iônicos através das membranas dos vacúolos fagocíticos.
Métodos Utilizados
- Preparação do éster succinimidilado de carboxi-S-1 para medição de pH.
- Opsonização de Candida morto pelo calor para interação com neutrófilos.
- Isolamento de neutrófilos humanos a partir de sangue periférico.
- Imageamento de células vivas usando microscopia confocal para capturar fagocitose.
Resultados Principais
- Medição bem-sucedida do pH fagosomal e citoplasmático em neutrófilos.
- Correlação demonstrada entre alterações de pH e atividade da NADPH oxidase.
- Fornecimento de informações sobre a dinâmica da fagocitose.
- Validação do uso do SNARF-1 para imagem simultânea de pH em diferentes compartimentos celulares.
Conclusões
- Este método oferece uma ferramenta valiosa para o estudo da função dos neutrófilos.
- Amplia a compreensão das respostas imunes no nível celular.
- Aplicações futuras podem incluir a investigação de outros tipos de células imunes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite o monitoramento em tempo real da dinâmica do pH fagosomal em neutrófilos, fornecendo uma leitura quantitativa da atividade da NADPH oxidase e do fluxo iônico através das membranas fagosomais. Essas medições funcionam como biomarcadores funcionais para avaliar as respostas das células do sistema imunológico inato em modelos pré-clínicos de imunologia e doenças infecciosas. O indicador ratiométrico de pH S-1 permite a imagem simultânea do fagossomo e do citoplasma, apoiando a desvinculação mecanicista de compostos imunomoduladores ao associar a atividade da explosão respiratória à maturação fagosomal.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a alcalinização fagosomal dependente da NADPH oxidase como parâmetro funcional para validação de alvos em vias mediadas por neutrófilos.
- Valor Operacional: Fornece um ensaio de imagem em células vivas para correlacionar modulações genéticas ou farmacológicas de canais iônicos com alterações no pH fagosomal.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de pH e volumétricas que permitem triagem de alto conteúdo de compostos que afetam a maturação do fagossomo.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio da detecção ratiométrica com dupla emissão, reduzindo artefatos decorrentes da concentração do corante ou da variabilidade na excitação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a modelagem de sistemas relevantes para doenças por meio da comparação da dinâmica do pH fagosomal em neutrófilos humanos e de camundongo sob condições controladas.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento longitudinal das alterações no tamanho e na forma do fagossomo, apoiando a confiança preditiva em estudos de eficácia pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho da biologia de descoberta como um ensaio funcional para avaliação do engajamento do alvo e modulação da via em programas de imunologia centrados em neutrófilos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre reguladores fagosomais ao associar a atividade da NADPH oxidase a alterações mensuráveis de pH e volume.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para campanhas de triagem de compostos que visam a maturação do fagossomo ou o fluxo iônico.
- Análises: Oferece medições de fluorescência ratiométricas que permitem a normalização e comparação entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos de neutrófilos in vitro a modelos pré-clínicos por meio de respostas conservadas de pH fagosomal.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para equipes de imunologia e doenças infecciosas que estudam mecanismos efetores inatos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao fornecer insights mecanicistas sobre a regulação do fagossomo e o acoplamento da explosão respiratória.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade do ensaio por meio da detecção ratiométrica de pH e protocolos padronizados de isolamento de neutrófilos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao reduzir a ambiguidade mecanicista na triagem de imunomoduladores.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em perfis funcionais de atividade de neutrófilos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de neutrófilos, microscopia confocal de células vivas e análise de razão de fluorescência.
- Depende do acesso a sistemas de microscopia confocal com detecção em dois canais e excitação a laser apropriada.
- Necessita padronização entre laboratórios para os procedimentos de preparação de neutrófilos, opsonização e carregamento com corante.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a fagócitos não-neutrofílicos ou modelos alternativos de patógenos.
- Inclui limitações práticas, como a ativação dos neutrófilos durante o isolamento e a necessidade de manipulação cuidadosa de amostras de sangue humano.
