Name: Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprenda a observar e quantificar o comportamento de acasalamento em Bursaphelenchus xylophilus. Este método permite obter adultos virgens para estudos precisos de biologia comportamental em nematoides.

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Najie Zhu e Liqun Bai contribuíram igualmente para este trabalho. Este trabalho foi financiado pelo Fundo Especial para Pesquisa Científica Florestal na Public Welfare (201204501) ea National Science Foundation Natural da China (31170604, 31270688 e 31570638). Agradecemos ao Dr. Holighaus Gerrit e Dr. Danielle Hickford por suas sugestões úteis sobre Inglês escrito.

1. Aquisição de Virgin Adulto Nematóides <ol><li> Pinewood isolado nematóide e condições de cultura NOTA: O B. xylophilus isolar Nxy61 foi originalmente extraído de uma massoniana Pinus doente na área de Ningbo, província de Zhejiang, na China. <ol><li> Prepare Potato Dextrose Agar (PDA, consulte a Tabela de Materiais) placas para o cultivo de Botrytis cinerea. </li><li> Para inoculação, perfurar um pedaço de tapete de fungos com diâmetro de 10 mm a partir de um tapete de B. cinerea e colocá-lo no meio de uma nova placa de PDA. Cultura de B. cinerea por 5 d, a 25 ° C no escuro. </li><li> Cultura os nematóides de pinho em placa de Petri contendo preparado de B. cinerea a 25 ° C no escuro. </li></ol></li><li> Aquisição de B. xylophilus ovos <ol><li> Coloque um tubo de borracha fixada abaixo de um funil e prender o funil preparado em um rack para montar oaparelho de funil de Baermann. Colocar duas camadas de papel de filtro em vez de gaze na boca do funil. </li><li> Transferir as culturas de fungos com a configuração de funil e adicionar água até o tapete fúngico está imerso. Aguarde 2 h, e nematóides vai sair a partir da cultura fúngica, atravessar o papel de filtro, e se estabelecer na parte mais baixa do funil de Baermann. </li><li> Reunir o primeiro par de gotas de água a partir do fundo do tubo para um tubo de 15 ml e recolher os nemátodos, libertando lentamente o grampo no tubo. </li><li> Centrifugar as colecções acima a 3000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover a camada superior da água com uma pipeta e ressuspender com 1 ml de estéril duplamente destilada (dd) H 2 O. </li><li> Com uma pipeta, transferir a ressuspensão de cima para um prato de Petri de vidro novo (6 cm de diâmetro). Adicionar 3 ml de estéril dd H2O para a placa de Petri para assegurar que os nemátodos são capazes de nadar livremente. </li><li> Mantenha os nematóides nos glass uma placa de Petri durante 10 minutos a 25 ° C no escuro. Os ovos serão estabelecidas por fêmeas grávidas. Devido à sua superfície a glicoproteína, os ovos serão agarradas ao fundo da placa de Petri de vidro. </li><li> Retire a água e vermes cuidadosamente, sem perturbar os ovos. Adicionar 3 ml de estéril dd H2O ao prato de Petri de vidro imediatamente para evitar que os ovos de secar. </li><li> Repetir o passo 1.2.8 3x para remover todas as larvas e adultos, e obter os ovos puro. Adicionar um extra de 2 ml (5 mL no total) de estéril dd H2O para a placa de Petri. </li></ol></li><li> Aquisição dos juvenis quarta-fase (larvas J4) <ol><li> Chocar os ovos recolhidos durante 24 horas no escuro a 25 ° C para se obter larvas J2. </li><li> Transferir as larvas J2 com uma pipeta para um tubo de 15 ml, de centrifugação a 3000 xg durante 2 min, e remover a camada superior da água. </li><li> Ressuspender as larvas J2 com 200 mL de estéril dd H2O, e depois transferi-los paraa placa PDA contendo B. cinerea. </li><li> Cultura das larvas J2, durante 52 h a 25 ° C no escuro. Neste ponto de tempo, a maioria das larvas J2 terão desenvolvido na fase inicial de larvas J4. </li></ol></li><li> Aquisição de nematóides adultos virgens <ol><li> Prepare uma agulha para pegar nematóides pelo desenho de um capilar de vidro, depois de aquecer-lo sobre um queimador de álcool. NOTA: A ponta da agulha capilar tem normalmente de ser de 50 um de diâmetro, mais ou menos a largura do corpo de um nemátodo adulto, de modo que ele pode ser usado como uma ferramenta para retirar um único nemátodo. </li><li> Montar um funil de Baermann e extrair nematóides das culturas de fungos durante 2 h, como descrito nos passos 1.2.1 - 1.2.3. </li><li> Transfira a J4 com água em um prato limpo Petri. </li><li> Observe os nematóides sob um microscópio estereoscópico e distinguir entre machos e fêmeas por morfologia genital, como descrito por Mamiya e Kiyohara 8 (Figura 1 </strong&gt;). Pegar um nematóide do sexo desejado com a agulha capilar preparada e transferi-lo para a placa de fungos-cultura apropriado para homens ou fêmeas. NOTA: Existem mais mulheres que homens, com a porcentagem de fêmeas em 60 - 70%. A vulva da mulher é obviamente diferente da espícula macho. Em comparação com o adulto, a espícula ou vulva em J4 em estágio inicial é menor, mas eles ainda podem ser facilmente visto e distinto. O nemátodo está sempre em movimento na água, o que, por vezes, aumenta a dificuldade em distinguir machos e fêmeas. </li><li> Cultura das larvas J4 por mais 24 h a 25 ° C no escuro. NOTA: Todos os nematóides deve desenvolver em adultos, mas uma vez que são unmated, eles são considerados como adultos virgens. </li><li> Montar dois funis de Baermann e extrair os adultos virgens de as culturas de fungos durante 2 h, como descrito nos passos 1.2.1 - 1.2.3, e transferir os machos adultas virgens e fêmeas, em duas placas de Petri limpo separadas. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Observação e gravação de vídeo do comportamento de acasalamento <ol><li> Preparar várias lâminas côncavas e adicionar 200 ul de estéril dd H2O a cada um dos seus poços. </li><li> Pegar o macho preparado virgem adulto ou e feminino com uma agulha capilar e colocar apenas um nematóide na água de cada slide côncava. </li><li> Mantenha os adultos virgens no interior do poço durante 1 h para deixá-los se adaptar ao novo ambiente aquoso. </li><li> Emparelhar um macho virgem e feminino, transferindo um deles de um poço para outro usando uma pipeta. </li><li> Observar o comportamento de acasalamento da 1♀ 1♂ combinação + no slide côncava sob microscópio estereoscópico. </li><li> Para analisar a eficiência de acasalamento dos adultos virgens, calcular a sua taxa de cruzamento de sucesso (R) e compará-la com a de pares adultos selecionados aleatoriamente. Calcular R como a percentagem de repetições em que se observou a cópula em comparação com o número total de repetições estudados. </li><li&gt; Para investigar escolha de acasalamento e da concorrência intrasexual, grupo e observar nematóides virgens de duas combinações diferentes: 1♀ + 3♂ e 3♀ + 1♂. </li><li> Para a coleta de dados para análise qualitativa e quantitativa, filmar o comportamento de acasalamento usando microscopia de vídeo. Normalmente, todo o processo de acasalamento, a partir do momento em que os nemátodos são colocadas no poço do slide côncava para o momento em que eles se movem para longe após copulação, é completada dentro de 2 h. Portanto, o processo de acasalamento gravar continuamente durante pelo menos 2 h, como um replicado. Complete pelo menos 30 repetições no total para cada combinação. NOTA: Adicionar mais estéril dd H2O (normalmente 50 uL) a cada 0,5 h ao poço para compensar a evaporação durante o processo de gravação. </li></ol> 3. Recolha de Dados <ol><li> Veja todos os vídeos com cuidado sobre uma tela de computador e caracterizar as sub-comportamentos qualitativamente. </li><li> Medir o tempo de acasalamento usando thfunção e quadro-a-quadro do gravador de vídeo. subtrair manualmente o tempo a partir do ponto final. </li><li> Para a combinação 1♀ + 1♂, analisar cada gravação de vídeo e medir a duração dos seguintes eventos: <ol><li> Medir a duração de busca (ou seja, o tempo a partir de quando o macho e fêmea são introduzidos na cavidade da corrediça côncava para o momento em que se encontram e contactam entre si). </li><li> Medir o tempo de contacto de (isto é, o tempo desde o primeiro contacto com o momento em que o macho é precisamente posicionada na vulva da fêmea para a primeira cópula). </li><li> Medir a duração da cópula (isto é, o tempo a partir de quando o macho é precisamente posicionada na vulva da fêmea até que ele desliza para baixo a partir do corpo da fêmea após a ejaculação). Nota: Alguns nemátodos podem copular várias vezes em 2 h. Em tais casos, medir a duração da cópula da primeira cópula para o final do lasT uma, incluindo o tempo no meio. </li><li> Medir a duração da prolongado (isto é, o período após a cópula até o mergulho macho e fêmea de distância um do outro e estão separados por uma distância de mais do que o comprimento do corpo dos nemátodos (geralmente 1 mm)). </li></ol></li><li> Contagem da freqüência de cópula e duração de cada cópula ea duração média de todas as cópulas em 2 h para cada um dos diferentes combinações (ou seja, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂). </li><li> Calcular a taxa de sucesso de acasalamento para o primeiro contato (P) para as diferentes combinações como a taxa de sucesso de acasalamento após o primeiro contato, que é realizado imediatamente e sem qualquer interrupção. Na fase de contacto, vários contatos pode ser observado antes da cópula real. <ol><li> Quando a distância entre dois indivíduos é mais do que o comprimento do corpo, considere um contato para ser terminado. Para uma réplica, ficha P como 100% quando a cópula is observado imediatamente após o primeiro contato, sem interrupção, ou 0,00%, se não foi observada a cópula ou se houve cópula, mas depois de dois ou mais contatos. NOTA: Não foram 30 repetições para cada combinação descrita aqui. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
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<li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus%3A+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Path%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li>
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<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
<li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community+Wormbook%22%5BJournal%5D)">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li>
<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os testes comportamentais são um aspecto fundamental da ecologia química, neurobiologia, biologia molecular e genética. Nematóides e, em particular C. elegans, são usados extensivamente para estudos nessas áreas. O comportamento de acasalamento de C. elegans foi investigada anteriormente 10-11. No entanto, B. xylophilus é gonochoristic e diferente dos hermafroditas C. elegans, e seu processo de acoplamento tem diferentes características comportamentais 9. Recente...

O nematóide da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner e Buhrer) Nickle, é uma das espécies invasoras mais destrutivas, causando o murchamento e eventual morte dos pinheiros. Acredita-se que esse nematóide patogênico seja nativo dos EUA, mas foi transportado para vários países, incluindo China, Japão, Coréia do Sul e Portugal. Recentemente, também foi relatado na Espanha, matando milhões de pinheiros com enormes perdas econômicas e ameaçando a produção florestal e a estabilidade ecológica1-5.
Uma vez que um pinheiro hospedeiro é infectado por nematóides da madeira de pinheiro, milhares de milhões de descendentes são propagados rapidamente dentro do tronco. Isso causa disfunção do xilema, resultando em murcha e, eventualmente, na morte da árvore hospedeira6. No entanto, atualmente não existe uma maneira eficiente de controlar esta doença. O comportamento de acasalamento pode desempenhar um papel importante na alta fecundidade desse nematóide7. Portanto, investigamos o comportamento de acasalamento de B. xylophilus em laboratório, tentando encontrar uma maneira eficaz de perturbar seu acasalamento e diminuir sua fecundidade. 
Este protocolo destina-se a apresentar os métodos detalhados de como obter os adultos virgens de B. xylophilus e como observar e analisar o comportamento de acasalamento usando um gravador de vídeo e um estereomicroscópio. Este protocolo também pode ser usado como referência para estudos comportamentais de outros nematóides.

<table><tbody><tr><td>B. xylophilus isolado Nxy61</td><td></td><td></td><td>Extraído de Pinus massoniana na área de Ningbo da China</td></tr><tr>Cepa <td></td><td></td> de<td>mofo cinza</td><td>Obtido da Academia Florestal da China</td></tr><tr><td>Baermann funil</td><td>Sengong</td> falcon tubos Sengong <td></td><td></td></tr><tr><td></td> centrífuga <td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>estéril dd H2O</td><td></td><td></td><td>Esterilizado por alta pressão de vapor a 121 & C por 30 min.</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA meio</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>incubadora</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluxo laminar Sengong</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>capilar de vidro</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estereoscópio</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>microscópio estéreo invertido</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>lâminas côncavas</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Um método para observar e quantificar o comportamento de acasalamento do nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, foi criada sob microscópio estereoscópico. Para melhorar a eficiência de acoplamento de B. Xylophilus e aumentar as chances de observação de acasalamento, os adultos virgens foram cultivadas e utilizadas para a investigação. Os ovos foram obtidas, mantendo os nemátodos em água e permitindo que as fêmeas a pôr ovos durante 10 min. Os juvenis de segundo estádio (J2) foram sincronizadas por incubação dos ovos durante 24 h a 25 ° C no escuro, e o início J4 foram obtidos por cultura do J2 com bolor cinzento, Botrytis cinerea, por outro 52 h. Neste ponto do tempo, a maioria dos nematóides J4 podia ser claramente distinguida como sendo do sexo masculino ou feminino com sua morfologia genital. O macho e fêmea J4 foram recolhidas e cultivadas separadamente em dois pratos de Petri diferentes durante 24 h para obter nemátodos adultos virgens. Um macho e uma fêmea virgem virgem foram emparelhados em uma gota de watER no poço de uma lâmina côncava. O comportamento de acasalamento foi filmado com um gravador de vídeo sob microscópio estereoscópico. todo o período do processo de acasalamento foi de 82,8 ± 3,91 min (média ± SE) e pode ser dividido em 4 fases distintas: pesquisa, contactando, copulando, e remanescentes. Os médios minutos de duração foram 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, respectivamente. Onze sub-comportamentos foram descritos: cruzeiro, aproximando-se, encontrando, tocando, hooping, localizar, prender, ejacular, separar, quietude, e roaming. Curiosamente, óbvia a concorrência intra-sexual foi observada quando uma fêmea foi agrupada com 3 machos ou um macho com 3 fêmeas. Este protocolo é útil e valioso, não só na investigação do comportamento de acasalamento de B. xylophilus, mas também em atuar como referência para estudos etológicas dos outros nematóides.

A taxa de sucesso de acasalamento (R) de adultos virgem foi de 86,67%, em média, o que foi significativamente mais elevado do que o dos adultos seleccionadas aleatoriamente: 13,33 ± 4,65% (M = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figura 2). Esta descoberta sugere que é mais fácil de observar o comportamento de acasalamento de B. xylophilus com adultos virgens do que com adultos selecionados aleatoriamente. <p class="jove_content" fo:keep-together....

Um protocolo para investigar o comportamento de acasalamento do nematoide da madeira do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, é apresentado. As características comportamentais de B. xylophilus são descritas no processo de acasalamento.

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

O objetivo geral deste procedimento é observar o comportamento de acasalamento do nematóide da madeira de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus. Este método pode ajudar a avançar os estudos psicológicos do nematóide. Ele lida especificamente com a observância do comportamento de acasalamento do nematóide da madeira do pinheiro.A principal vantagem dessa técnica é que adultos virgens podem ser obtidos, o que torna muito mais fácil observar o comportamento de acasalamento dos adultos. As implicações dessa técnica se estendem puramente ao estudo mais amplo dos nematóides, porque eles têm comportamentos semelhantes aos ciclos de vida. Pois a demonstração deste método é crítica, pois a aquisição de nematóides adultos virgens é difícil porque as restrições de nematóides de desenvolvimento exigem prática e não é fácil distinguir com precisão machos de fêmeas em juvenis de primeiro estágio.Para cultivar nematóides de madeira de pinheiro, primeiro prepare placas de ágar dextrose de batata. Para inocular uma placa, perfure um pedaço de tapete fúngico com um diâmetro de 10 milímetros de um tapete de betritus senaria e coloque-o no meio de uma nova placa de PDA. Cultive o tapete fúngico por cinco dias a 25 graus Celsius no escuro.Após cinco dias, adicione os nematóides da madeira de pinho à placa de Petri preparada e cultive-os por três dias a 25 graus Celsius no escuro. Para isolar os nematóides do fungo, primeiro prepare uma ferramenta de coleta. Coloque um tubo de borracha clamped abaixo de um funil, e segure o funil preparado em um rack para montar o aparelho de funil baermann.Em seguida, coloque duas camadas de papel de filtro em vez de gaze na boca do funil. Agora, transfira as culturas de fungos para a configuração do funil e adicione água até que o tapete de fungos esteja imerso. Após duas horas, os nematóides sairão da cultura fúngica, atravessarão o papel de filtro e se estabelecerão na parte mais baixa do funil de Baermann.Colete os nematóides colocando um tubo de 15 mililitros abaixo do funil e, em seguida, soltando lentamente o grampo para coletar algumas gotas de água, que conterão os nematóides. Centrifugar as colecções de nemátodos a 3 000 g durante dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, espare o nível superior de água e ressuspenda os vermes em um mililitro de água.Transfira a suspensão dos nematóides para um prato de vidro de seis centímetros e adicione três mililitros de água para ajudar os nematóides a nadar livremente. Agora, colete ovos para fazer caldos virgens. Transfira o prato para uma incubadora escura e deixe as fêmeas grávidas botarem ovos por 10 minutos.Por causa de sua superfície de glicoproteína, os ovos grudam no vidro. Em seguida, remova a água com as minhocas com cuidado para evitar mexer nos ovos grudados no prato. Em seguida, adicione rapidamente 3 mililitros de água ao prato para evitar que os ovos sequem.Repita este processo de limpeza dos ovos pelo menos três vezes, para remover todas as larvas e adultos e obter os ovos puros. Para a coleta de ovos puros lavados, adicione cinco mililitros de água e prossiga com o desenvolvimento dos ovos no escuro a 25 graus Celsius. 24 horas após o início da cultura dos ovos, colete as larvas J2 eclodidas.Transfira cuidadosamente as larvas J2 para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar a recolha a 3 000 g durante dois minutos. Espalhe a camada superior de água e adicione de volta 200 microlitros de água.Em seguida, cultive as larvas J2 em uma placa de PDA preparada com um tapete de fungo. Após 52 horas, a maioria das larvas J2 terá se desenvolvido em larvas J4 em estágio inicial. Monte um funil de Baermann e extraia os nematóides das culturas fúngicas por duas horas, conforme descrito anteriormente.Enquanto espera, prepare uma agulha para pegar os vermes. Desenhe uma ponta de um capilar de vidro aquecido em um queimador de álcool. A ponta precisa ter cerca de 50 mícrons de diâmetro, aproximadamente a largura do corpo de um nematóide adulto.Após duas horas, transfira as larvas J4 para uma placa de Petri limpa, conforme descrito anteriormente. Agora, faça sexo com os nematóides sob um microscópio estereoscópico. Cerca de dois terços das larvas são geralmente fêmeas.A vulva da fêmea é obviamente diferente da anatomia do macho, mas como os vermes são muito ativos, a sexagem exigirá prática. O passo mais crítico para este protocolo é distinguir e separar com precisão os machos das fêmeas no primeiro estágio inicial. Caso contrário, haverá mistura e mal, uma vez que se tornem adultos.E isso dificulta a observação do acasalamento. Gradualmente, pegue e transfira os vermes para uma gota d'água em uma lâmina para machos ou fêmeas. Para garantir o sucesso, duas pessoas diferentes devem verificar novamente a alocação de sexo.Agora, transfira a gota de água contendo os vermes sexados para a placa de cultura fúngica apropriada. Em seguida, cultive as virgens por mais 24 horas antes de estudar seu comportamento de acasalamento. Para observar o comportamento de acasalamento do nematóide da madeira de pinheiro, primeiro prepare várias lâminas côncavas adicionando 200 microlitros de água a cada um de seus poços.Em seguida, escolha um único adulto virgem preparado e transfira-o para uma lâmina preparada. Mantenha os adultos virgens dentro do poço por uma hora para que eles se adaptem ao novo ambiente aquoso. Depois de uma hora, adicione um único adulto virgem do sexo oposto ao poço, usando uma pipeta.Em seguida, observe o comportamento de acasalamento sob um microscópio estéreo e filme o comportamento para análise quantitativa. Todo o processo de acasalamento geralmente termina em duas horas. A cada 30 minutos, adicione 50 microlitros de água para compensar a evaporação.Para investigar a escolha de acasalamento e a competição intersexual, agrupe e observe nematóides virgens de duas combinações diferentes. A taxa de sucesso de acasalamento de adultos virgens foi de cerca de 87%, muito maior do que a dos adultos selecionados aleatoriamente. Os pares levaram em média 83 minutos para completar todo o processo de acasalamento, que contém quatro fases diferentes.Procurando, contatando, copulando e demorando. Nessas fases, muitos padrões específicos de comportamento podem ser observados. Quando uma fêmea conheceu vários machos, houve uma escolha óbvia de acasalamento.A fêmea geralmente usa a cabeça para entrar em contato com um macho, geralmente na cabeça, corpo, cauda e região genital. A fêmea então copulou com o macho, ou o deixou rapidamente, e nadou até outro macho. As taxas de sucesso de acasalamento foram medidas após o primeiro contato para as diferentes combinações de nematóides.A competição intersexual também ocorreu. Quando uma fêmea virgem foi misturada com três machos virgens, os machos tentaram se aproximar e entrar em contato com a fêmea o máximo possível, para ter a chance de acasalar com ela. Quando a vulva estava ocupada, os outros machos tentavam perturbar o processo de acasalamento usando violentos balanços corporais ou arrastando para separá-los.A competição intersexual feminina foi vista como mais ou menos semelhante à competição intersexual masculina. Por causa da competição intersexual, as frequências de cópula com as diferentes combinações foram significativamente diferentes. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para a exploração da ecologia comportamental em nematóides.Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em 12 dias, se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de separar com precisão os machos das fêmeas, os juvenis do estágio inicial para obter adultos virgens.

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Biology

Biologia

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Os ensaios comportamentais fornecem ferramentas poderosas para a compreensão da função neuronal. Aqui apresentamos vários protocolos para quantificar o comportamento alimentar predatório encontrado no nematóide modelo Pristionchus pacificus e seus parentes. Além disso, fornecemos métodos para analisar adaptações alimentares predatórias, incluindo estruturas bucais e dentes.

Ensaiar comportamentos alimentares predadores em<em&gt; Pristionchus</em&gt; E outros nematóides

Demonstramos um ensaio para analisar as pistas ambientais e genéticas que influenciam o comportamento de acasalamento na mosca da fruta Drosophila melanogaster .

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

O uso de um chip adaptado"olfativo" para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

Comportamento do companheiro-guardando desempenha um papel importante na reprodução de copépodes intertidais do gênero Tigriopus. No entanto, métodos para estudar esse comportamento não foram bem descritos. Aqui descrevemos os métodos para: cultura 1) individual de virgem Tigriopus animais e 2) a análise quantitativa de seu comportamento de companheiro-a guardar.

Cultivo individual de copépodes Tigriopus e análise quantitativa de seu comportamento companheiro-guarda

Neste protocolo, métodos para a realização de cruzamentos de consanguinidade e para avaliar o sucesso dessas cruzes, são descritos para a formiga Vollenhovia emeryi. Estes protocolos são importantes para as experiências que visa compreender a base genética dos sistemas de determinação do sexo em Hymenoptera.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

O esperma deve navegar com sucesso através do oviduto para fertilizar um oócito. Aqui, nós descrevemos um ensaio para medir a migração do esperma dentro do útero hermafrodita de C. elegans . Este ensaio pode fornecer dados quantitativos sobre a distribuição de espermatozóides dentro do útero após o acasalamento, bem como na velocidade, rotação direcional e frequência de reversão.

Medindo a orientação e a motilidade do esperma dentro do intervalo reprodutivo hermafrodita dos elegans de Caenorhabditis

Aqui, introduzimos um método de imersão detalhado da interferência de RNA em Bursaphelenchus xylophilus para facilitar o estudo das funções genéticas.

Aplicação de interferência de RNA no Nematode pinewood, Bursaphelenchus xylophilus

Este protocolo estabelece métodos para extrair e quantificar as respostas ao feromônio sexual volátil em C. elegans, fornecendo ferramentas para estudar a comunicação química e a trajetória de navegação.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

O protocolo descreve a infecção in vivo e in vitro do nematoide Pinus pinaster e sua análise volatilomática por meio de Cromatografia Gasosa (GC) e GC acoplada à Espectrometria de Massas (GC-MS).

Infecção de Pinus In Vivo e In Vitro com o Nematóide Bursaphelenchus xylophilus e Isolamento de Voláteis Induzidos

O presente protocolo descreve um método para induzir a dispersão de juvenis de terceiro estágio (juvenis pré-dauer, JIII.) de Bursaphelenchus xylophilus em criptobiose por meio da regulação osmótica de íons cloreto de potássio (KCl). Este método pode fornecer suporte técnico para pesquisas sobre os mecanismos de resistência ao estresse de B. xylophilus.

Induzindo a entrada de juvenis de dispersão de terceiro estágio de Bursaphelenchus xylophilus na criptobiose por meio da regulação osmótica

Aprenda a observar e quantificar o comportamento de acasalamento em Bursaphelenchus xylophilus. Este método permite obter adultos virgens para estudos precisos de biologia comportamental em nematoides.

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus

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