Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus

O objetivo geral deste procedimento é observar o comportamento de acasalamento do nematóide da madeira de pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus. Este método pode ajudar a avançar os estudos psicológicos do nematóide. Ele lida especificamente com a observância do comportamento de acasalamento do nematóide da madeira do pinheiro.

A principal vantagem dessa técnica é que adultos virgens podem ser obtidos, o que torna muito mais fácil observar o comportamento de acasalamento dos adultos. As implicações dessa técnica se estendem puramente ao estudo mais amplo dos nematóides, porque eles têm comportamentos semelhantes aos ciclos de vida. Pois a demonstração deste método é crítica, pois a aquisição de nematóides adultos virgens é difícil porque as restrições de nematóides de desenvolvimento exigem prática e não é fácil distinguir com precisão machos de fêmeas em juvenis de primeiro estágio.

Para cultivar nematóides de madeira de pinheiro, primeiro prepare placas de ágar dextrose de batata. Para inocular uma placa, perfure um pedaço de tapete fúngico com um diâmetro de 10 milímetros de um tapete de betritus senaria e coloque-o no meio de uma nova placa de PDA. Cultive o tapete fúngico por cinco dias a 25 graus Celsius no escuro.

Após cinco dias, adicione os nematóides da madeira de pinho à placa de Petri preparada e cultive-os por três dias a 25 graus Celsius no escuro. Para isolar os nematóides do fungo, primeiro prepare uma ferramenta de coleta. Coloque um tubo de borracha clamped abaixo de um funil, e segure o funil preparado em um rack para montar o aparelho de funil baermann.

Em seguida, coloque duas camadas de papel de filtro em vez de gaze na boca do funil. Agora, transfira as culturas de fungos para a configuração do funil e adicione água até que o tapete de fungos esteja imerso. Após duas horas, os nematóides sairão da cultura fúngica, atravessarão o papel de filtro e se estabelecerão na parte mais baixa do funil de Baermann.

Colete os nematóides colocando um tubo de 15 mililitros abaixo do funil e, em seguida, soltando lentamente o grampo para coletar algumas gotas de água, que conterão os nematóides. Centrifugar as colecções de nemátodos a 3 000 g durante dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, espare o nível superior de água e ressuspenda os vermes em um mililitro de água.

Transfira a suspensão dos nematóides para um prato de vidro de seis centímetros e adicione três mililitros de água para ajudar os nematóides a nadar livremente. Agora, colete ovos para fazer caldos virgens. Transfira o prato para uma incubadora escura e deixe as fêmeas grávidas botarem ovos por 10 minutos.

Por causa de sua superfície de glicoproteína, os ovos grudam no vidro. Em seguida, remova a água com as minhocas com cuidado para evitar mexer nos ovos grudados no prato. Em seguida, adicione rapidamente 3 mililitros de água ao prato para evitar que os ovos sequem.

Repita este processo de limpeza dos ovos pelo menos três vezes, para remover todas as larvas e adultos e obter os ovos puros. Para a coleta de ovos puros lavados, adicione cinco mililitros de água e prossiga com o desenvolvimento dos ovos no escuro a 25 graus Celsius. 24 horas após o início da cultura dos ovos, colete as larvas J2 eclodidas.

Transfira cuidadosamente as larvas J2 para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, centrifugar a recolha a 3 000 g durante dois minutos. Espalhe a camada superior de água e adicione de volta 200 microlitros de água.

Em seguida, cultive as larvas J2 em uma placa de PDA preparada com um tapete de fungo. Após 52 horas, a maioria das larvas J2 terá se desenvolvido em larvas J4 em estágio inicial. Monte um funil de Baermann e extraia os nematóides das culturas fúngicas por duas horas, conforme descrito anteriormente.

Enquanto espera, prepare uma agulha para pegar os vermes. Desenhe uma ponta de um capilar de vidro aquecido em um queimador de álcool. A ponta precisa ter cerca de 50 mícrons de diâmetro, aproximadamente a largura do corpo de um nematóide adulto.

Após duas horas, transfira as larvas J4 para uma placa de Petri limpa, conforme descrito anteriormente. Agora, faça sexo com os nematóides sob um microscópio estereoscópico. Cerca de dois terços das larvas são geralmente fêmeas.

A vulva da fêmea é obviamente diferente da anatomia do macho, mas como os vermes são muito ativos, a sexagem exigirá prática. O passo mais crítico para este protocolo é distinguir e separar com precisão os machos das fêmeas no primeiro estágio inicial. Caso contrário, haverá mistura e mal, uma vez que se tornem adultos.

E isso dificulta a observação do acasalamento. Gradualmente, pegue e transfira os vermes para uma gota d'água em uma lâmina para machos ou fêmeas. Para garantir o sucesso, duas pessoas diferentes devem verificar novamente a alocação de sexo.

Agora, transfira a gota de água contendo os vermes sexados para a placa de cultura fúngica apropriada. Em seguida, cultive as virgens por mais 24 horas antes de estudar seu comportamento de acasalamento. Para observar o comportamento de acasalamento do nematóide da madeira de pinheiro, primeiro prepare várias lâminas côncavas adicionando 200 microlitros de água a cada um de seus poços.

Em seguida, escolha um único adulto virgem preparado e transfira-o para uma lâmina preparada. Mantenha os adultos virgens dentro do poço por uma hora para que eles se adaptem ao novo ambiente aquoso. Depois de uma hora, adicione um único adulto virgem do sexo oposto ao poço, usando uma pipeta.

Em seguida, observe o comportamento de acasalamento sob um microscópio estéreo e filme o comportamento para análise quantitativa. Todo o processo de acasalamento geralmente termina em duas horas. A cada 30 minutos, adicione 50 microlitros de água para compensar a evaporação.

Para investigar a escolha de acasalamento e a competição intersexual, agrupe e observe nematóides virgens de duas combinações diferentes. A taxa de sucesso de acasalamento de adultos virgens foi de cerca de 87%, muito maior do que a dos adultos selecionados aleatoriamente. Os pares levaram em média 83 minutos para completar todo o processo de acasalamento, que contém quatro fases diferentes.

Procurando, contatando, copulando e demorando. Nessas fases, muitos padrões específicos de comportamento podem ser observados. Quando uma fêmea conheceu vários machos, houve uma escolha óbvia de acasalamento.

A fêmea geralmente usa a cabeça para entrar em contato com um macho, geralmente na cabeça, corpo, cauda e região genital. A fêmea então copulou com o macho, ou o deixou rapidamente, e nadou até outro macho. As taxas de sucesso de acasalamento foram medidas após o primeiro contato para as diferentes combinações de nematóides.

A competição intersexual também ocorreu. Quando uma fêmea virgem foi misturada com três machos virgens, os machos tentaram se aproximar e entrar em contato com a fêmea o máximo possível, para ter a chance de acasalar com ela. Quando a vulva estava ocupada, os outros machos tentavam perturbar o processo de acasalamento usando violentos balanços corporais ou arrastando para separá-los.

A competição intersexual feminina foi vista como mais ou menos semelhante à competição intersexual masculina. Por causa da competição intersexual, as frequências de cópula com as diferentes combinações foram significativamente diferentes. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para a exploração da ecologia comportamental em nematóides.

Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em 12 dias, se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de separar com precisão os machos das fêmeas, os juvenis do estágio inicial para obter adultos virgens.