Metodologia para o Estudo da transferência horizontal de genes em Staphylococcus aureus

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma metodologia detalhada para estudar a transmissão horizontal do DNA em staphylococcus aureus, abordando as três principais vias de transferência. Conjugação, transdução e transformação natural. Este método trata da transferência horizontal de genes resistentes a antibióticos no patógeno humano estafilococos aureus.

A principal vantagem das técnicas apresentadas aqui é que podemos testar três modos principais de transferência, incluindo a transformação genética natural recentemente descoberta. Demonstrando o procedimento estará Le Thuy, um estudante de doutorado de nosso laboratório. Para iniciar o experimento, prepare cinco mililitros de cultura noturna da bactéria doadora e receptora em caldo de soja tríptico. Ou meio TSB com e sem 32 miligramas por litro de cloranfenicol, respectivamente.

Com agitação a 37 graus Celsius. No dia seguinte, ajuste a densidade óptica das culturas noturnas para uma com meio TSB fresco. Misture 0,5 mililitros da cultura do doador com 0,5 mililitros da cultura receptora.

E adicione um mililitro de solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, à mistura. Em seguida, usando um sistema de bomba de vácuo, transfira a mistura de bactérias para uma membrana de filtro de 0,45 micrômetro. Coloque as membranas do filtro em uma placa de ágar sangue de ovelha.

Incube as placas a 37 graus Celsius por um dia. Retire a membrana do filtro da placa e suspenda-a em 10 mililitros de PBS. Vortex a mistura por cerca de um minuto para coletar todas as bactérias presas na membrana.

Fazer uma diluição série de 10 vezes da suspensão bacteriana com TSB fresco. Placa de 100 microlitros das amostras diluídas 0, 10, 4 em ágar TSB. Ou placas TSA suplementadas com 32 miligramas por litro de cloranfenicol e oito miligramas por litro de tetraciclina para selecionar transconjugantes.

Coloque 100 microlitros da suspensão diluída em placas TSA com oito miligramas por litro de tetraciclina sozinho. Para contar o número total de destinatários. Após a incubação, analise as colônias duplamente resistentes quanto à presença do gene CFR por PCR de colônias e seus perfis de suscetibilidade.

Determinar o antibiograma medindo as concentrações inibitórias mínimas, CIM, dos antibióticos adequados, de acordo com o método padrão de microdiluição ou o método de difusão em disco. O perfil de suscetibilidade dos transconjugantes deve ser idêntico ao do receptor. Exceto para cloranfenicol e outros compostos afetados pelo gene CFR.

Para descartar a resistência à tetraciclina desenvolvida pela cepa doadora. Prepare uma cultura noturna de N315-45 em cinco mililitros de caldo nutritivo suplementado com 3,6 milimolares de cálcio. Prepare as subculturas diluindo a cultura noturna de um a 1.000 em um volume final de 10 mililitros em frascos de vidro de 50 mililitros.

Cultive a bactéria por uma hora a 37 graus Celsius com agitação, 180 rotações por minuto. Em seguida, prepare uma série de fagos diluídos MR83a em meio de cloreto de cálcio NB. Adicione 20 microlitros do fago diluído à cultura bacteriana.

Prepare uma cultura de controle sem infecção por fagos para servir como controle positivo para o crescimento de células bacterianas. Em seguida, cultive as culturas a 37 graus Celsius com agitação suave a 100 rotações por minuto durante a noite. No dia seguinte, selecione um ou dois frascos de cultura limpos com a maior diluição do fago adicionado.

Transfira as culturas para tubos de centrífuga de 15 mililitros. Adicione 250 microlitros de clorofórmio aos tubos e misture bem a cultura invertendo-os. Centrifugue a cultura a 5.000 vezes G por 20 minutos a 4 graus Celsius.

Transfira os sobrenadantes para tubos novos e armazene-os a 4 graus Celsius até o uso. Prepare o meio de ágar caldo nutriente e mantenha-o aquecido em banho-maria a 55 graus Celsius. Adicionar solução autoclavada de cloreto de cálcio a 0,5 molar ao meio até uma concentração final de 3,6 milimolares.

Despeje em placas de Petri de 90 milímetros NB placas de cloreto de cálcio. Prepare uma cultura noturna de N315 em cinco mililitros de cloreto de cálcio NB a 37 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, adicione 10 microlitros da cultura noturna em 200 microlitros de cloreto de cálcio NB e espalhe uniformemente na placa de cloreto de cálcio NB.

Pare de espalhar quando a superfície da placa estiver coberta com líquido. Em seguida, deixe o prato secar por cinco minutos. Faça uma diluição serial de um a 10 do fago previamente preparado usando meio de cloreto de cálcio NB.

Coloque três microlitros de cada diluição de fago na placa coberta com bactérias. Incube a placa durante a noite a 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, conte os números das placas e calcule o título de fagos usando a seguinte equação.

Prepare a cultura noturna de N315, COL ou MU50, em cinco mililitros de cloreto de cálcio NB a 37 graus Celsius com agitação a 180 rotações por minuto. Após a cultura durante a noite, diluir o fago em cloreto de cálcio NB a 109 PFU por mililitro. Em um frasco de vidro de 50 mililitros, misture 500 microlitros de cultura durante a noite, 500 microlitros de cloreto de cálcio NB fresco e um mililitro de fago 109 PFU por mililitro.

Incube a mistura a 37 graus Celsius com uma agitação suave a 100 rotações por minuto durante 30 minutos. Após a incubação, adicione 50 microlitros de citrato trissódico a 20% às culturas. Continue a agitação suave por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Prepare a infusão de coração cerebral derretido ou meio de ágar BHI e mantenha-o em banho-maria a 55 graus Celsius e trate o meio de ágar com 32 miligramas por litro de cloranfenicol. Em seguida, transferir a mistura de fagos de bactérias para um balão de 100 mililitros. Adicione 50 mililitros de ágar BHI quente suplementado com 32 miligramas por litro de cloranfenicol e misture bem.

Despeje a mistura nas placas de Petri de 90 milímetros. Incube a placa a 37 graus Celsius. Teste ainda mais as colônias geradas, os transdutores, quanto à resistência, transferindo as colônias para novas placas de ágar BHI suplementadas com 32 miligramas por litro de cloranfenicol.

Confirmar a presença do gene CFR por PCR de colónias. Cultive a célula receptora durante a noite, em cinco mililitros de TSB a 37 graus Celsius com agitação. Na manhã seguinte, transfira 0,5 mililitros da cultura noturna para um tubo de 1,5 mililitro.

Precipitar as células por centrifugação. Em seguida, suspenda as células com 10 mililitros de meio CS2 em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, crescem as bactérias a 37 graus Celsius com agitação a 180 rotações por minuto durante oito horas até a fase exponencial tardia.

Colha as células por centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mililitros de meio CS2 fresco. Adicionar 10 microgramas de plasmídeo purificado ou de ADN genómico à suspensão celular.

Agite a cultura a 180 rotações por minuto. Em seguida, colete as células por centrifugação. Ressuspenda as células em 10 mililitros de meio BHI.

Misture a suspensão celular com 90 mililitros de suplemento de ágar BHI derretido com 32 miligramas por litro de cloranfenicol, E cinco microgramas por litro de tetraciclina no experimento de controle. Despeje a mistura nas placas de Petri de 90 milímetros, esfrie rapidamente e deixe o ágar solidificar. Replique as colônias usando palitos de dente em placas contendo antibióticos apropriados para confirmar suas características de resistência.

O protocolo de conjugação é útil para transmissão intra-espécie, onde o Staphylococcus epidermidis foi usado como doador de CFR. E a cepa Staphylococcus aureus N315 foi usada como receptora. O protocolo usado para transmissão entre espécies produz resultados semelhantes usando o mesmo vetor conjugativo em diferentes doadores conjugativos.

Este é o primeiro artigo em que os detalhes da transformação natural são descritos. A metodologia fornecida seria útil para o pesquisador estudar a transmissão e disseminação da resistência a antibióticos, bem como determinante primário no patógeno humano estafilococos aureus.