Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

O objetivo geral do método de vitrificação de embriões MicroSecure é fornecer um procedimento de vitrificação fechada asséptica seguro, simples, mas eficaz, para embriões humanos. Este método foi desenvolvido para minimizar as variáveis de controle de qualidade na vitrificação de embriões humanos, garantindo assim um sucesso confiável e reprodutível. A principal vantagem dessa técnica é que ela se esforça para eliminar variações técnicas entre biólogos e laboratórios.

Nossa técnica é tão simples de executar que achamos que o maior desafio para nossos alunos é aprender a pipetar embriões sem perdê-los. A ideia por trás do nosso método era eliminar a necessidade de dispositivos especializados, adaptando dois itens comumente usados aprovados pela FDA. Um canudo de armazenamento ionomérico rotulado internamente e um flexipet estéril.

A demonstração visual dessa técnica é extremamente útil, pois destaca as dicas básicas que garantem sua aplicação bem-sucedida. Antes de iniciar o procedimento, coloque o canudo de sêmen estéril de 0,3 ml na superfície de teflon do eletrodo de um selador de impulso de mesa básico, bem na frente do plugue, para criar uma vedação interna. Pressione a alça para ativar o aquecimento, soltando a alça quando a luz vermelha estiver apagada e um bipe for ouvido.

Em seguida, empurre o plugue de algodão para frente contra a vedação interna antes de concluir a configuração. Para criodiluição e carregamento de blastocisto das amostras, remova a placa de cultura do paciente da incubadora e confirme todas as identificações de amostras com uma fonte secundária. Sob um estereomicroscópio, use um flexipet de vitrificação, conhecido como ponta de vit, para mover os blastocistos para gotículas individuais na linha superior de uma placa criogênica correspondente.

Em seguida, pré-preencha o flexipet com 3 microlitros de solução V1 e dispense metade do conteúdo no primeiro embrião. Aspire o embrião e transfira-o para a primeira gota de lavagem V1. Em seguida, pipete o embrião duas a três vezes ao redor do perímetro da gota e limpe o conteúdo residual da pipeta fora da gota na superfície do prato.

Em seguida, mova o blastocisto para uma gota de retenção V1 individual e pré-carregue a ponta vit com a próxima solução V2 antes de pipetar os embriões adicionais com uma nova ponta vit. Depois de lavar todos os blastocistos nas gotículas V2 e V3 como acabamos de demonstrar, limpe a solução residual e as bolhas da ponta vit fora da gota de retenção V3 e encha completamente a ponta com solução V3 limpa ao redor do primeiro embrião. Expulsar aproximadamente 1 microlitro do volume e aspirar o blastocisto e a solução V3 restante completamente na ponta do vit.

Agora, remova a ponta da pipeta e use uma gaze estéril para secar a solução V3 residual da superfície externa da ponta vit. A secagem da superfície externa da ponta é crítica e não incorre em nenhum risco adicional de perda de embriões. Em seguida, insira a ponta primeiro na extremidade aberta do canudo pré-selado e inverta o canudo, com a ponta da etiqueta para baixo.

Observe a ponta no plugue interno. Deixe um espaço aéreo de 1 cm na extremidade aberta e, em seguida, sele-o com segurança. Quando todos os canudos estiverem selados, mergulhe-os diretamente no nitrogênio líquido em um frasco de aço inoxidável e guarde os canudos no cálice aberto preso à bengala do paciente.

Para eluição e diluição de crio-solução, colocar a placa de diluição de seis poços correspondente no centro de uma platina de estereomicroscópio e uma placa de Petri de 60 mm contendo um banho de aquecimento de sacarose a 37 graus Celsius em um lado do microscópio. Em seguida, isole o canudo a ser aquecido e segure o selo superior do canudo acima do nível do líquido para confirmar a identidade da amostra. Use uma tesoura de maionese para prender o canudo abaixo do tampão interno, para manter a ponta do vit submersa no nitrogênio líquido.

Bata firmemente a tesoura contra o frasco dewar várias vezes para desalojar a ponta da parede lateral interna do canudo como precaução de controle de qualidade e levante o canudo no ar ambiente em uma orientação horizontal ao lado ou abaixo da superfície do estereoscópio. Segurando a extremidade não rotulada do canudo, corte o canudo no plugue interno. Em seguida, levante o canudo acima do prato de banho de aquecimento e despeje a ponta vit no banho em um ângulo de 60 graus, até que a ponta esteja completamente extrudada.

A base do flexipet deve ficar acima da parede lateral do prato. Após 5 a 10 segundos, transfira a base da pipeta para um dispositivo de pipetagem de microcap. Inicie um cronômetro de cinco minutos.

Ao visualizar o microscópio, use um dedo indicador para cobrir o orifício do bulbo e aperte suavemente o bulbo para liberar o blastocisto vitrificado da ponta vit na lavagem T1. Depois de confirmar a liberação do blastocisto, limpe a solução V3 residual e as bolhas por pressão positiva, evacuando o conteúdo para o centro de um poço de descarte não utilizado. Transfira a ponta vit para uma pipeta sterber, movendo o embrião para a segunda gota T1 sob óleo pelos quatro minutos restantes.

Durante a incubação, pré-encha o flexipet com a próxima solução e, em seguida, dilua o blastocisto nas gotículas T2, 3 e 4 em intervalos de três minutos. Por fim, equilibre os blastocistos na gota T5 por cinco minutos em uma superfície de 37 graus Celsius, antes de devolvê-los à incubadora. O Sistema de Classificação de Blastocisto de Gardner Modificado considera os blastocistos completos como tendo menos de 10% de herniação das células do trofectoderma, enquanto os blastocistos com até 50% de hérnia são classificados como expandidos.

Os blastocistos que demonstram uma hérnia superior a 50% são considerados eclodidos. Usando os métodos de criopreservação e aquecimento demonstrados, altos níveis de nascidos vivos por início de ciclo foram consistentemente alcançados com ou sem testes genéticos pré-implantação. Embora esses sucessos sejam consideravelmente maiores, usando blastocistos euplóides pré-selecionados.

De fato, avaliando uma população de pacientes com bom prognóstico apenas para ciclos criopreservados, esses dados de transferência de embriões congelados demonstram melhores taxas de sucesso do que a média nacional para as taxas de implantação e nascidos vivos em mais de 30%Ao transferir blastocistos vitrificados euplóides geneticamente testados predominantemente, algumas das maiores taxas de implantação e taxas de nascidos vivos nos Estados Unidos, independentemente da idade, foram alcançados, em comparação com as estatísticas nacionais recentes relatadas pelo Centro de Controle de Doenças para duas outras clínicas de fertilidade respeitadas e os dados divulgados pela Society for Assisted Reproductive Technologies. A vitrificação MicroSecure é um novo procedimento asséptico desenvolvido para facilidade técnica, confiabilidade e criosegurança em mente. Este sistema de vitrificação simples e não comercial oferece uma alternativa altamente eficaz e de baixo custo aos dispositivos de vitrificação.

Desde o seu desenvolvimento, o método MicroSecure garantiu mais de 99,9% de recuperação embrionária e mais de 95% de sobrevivência completa do blastocisto. Isso permitiu a transformação de nossa prática clínica em quase todos os ciclos de transferência de embriões criopreservados nos últimos três anos. Modificamos efetivamente nosso procedimento para incluir uma vedação interna na frente do tampão de algodão dos canudos de sêmen ionomérico para ainda produzir vedações de solda confiáveis e excelentes resultados pós-aquecimento.

Existem muitos sistemas de dispositivos diferentes usados nas indústrias de tecnologia reprodutiva assistiva hoje, mas nenhum outro dispositivo oferece a simplicidade e a repetibilidade técnica para eliminar essencialmente a variação do usuário e fornecer segurança otimizada, como a vitrificação MicroSecure.