Name: Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a vitrificação MicroSecure para criopreservação de embriões humanos usando canudos ionoméricos e flexipets estéreis. Este método simples elimina variações técnicas e garante taxas de sucesso reprodutíveis em laboratórios.

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MC Schiewe gostaria de agradecer ao Sr. Floresta Garner no Centro de Fertilidade de Las Vegas para sua perícia estatística na análise e avaliação dos dados anuais do CDC e SART. Além disso, os autores gostariam de agradecer o seu diretor médico, Dr. Robert E. Anderson, por seu apoio dedicado e fé nas nossas capacidades e conhecimentos técnicos.

<ol><li>Edgar, D. H., Gook, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+cryopreservation+%28slow+cooling+versus+vitrification%29+of+human+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod.+Update%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of cryopreservation (slow cooling versus vitrification) of human oocytes and embryos.</a> Hum. Reprod. Update. 16, 536-554 (2012).</li>
<li>Schiewe, M. C., Whitney, J. B., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+risk+of+monochorionic+dizygotic+twin+blastocyst+formation+associated+with+early+laser+zona+dissection+of+group+cultured+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Potential risk of monochorionic dizygotic twin blastocyst formation associated with early laser zona dissection of group cultured embryos.</a> Fertil. Steril. 103, 417-421 (2015).</li>
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<li>Lane, M., Schoolcraft, W. B., Gardner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+mouse+and+human+blastocysts+using+a+novel+cryoloop+container-less+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Vitrification of mouse and human blastocysts using a novel cryoloop container-less technique.</a> Fertil. Steril. 72, 1073-1078 (1999).</li>
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<li>Kuwayama, M., Vatja, G., Ieda, S., Kato, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+open+and+closed+methods+for+vitrification+of+human+embryos+and+elimination+of+potential+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and elimination of potential contamination.</a> Reprod. Biomed. Online. 11, 608-614 (2005).</li>
<li>Vanderzwalmen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Births+after+vitrification+at+morula+and+blastocyst+stages%3A+effect+of+artificial+reduction+of+the+blastocoelic+cavity+before+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification.</a> Hum. Reprod. 17, 744-751 (2002).</li>
<li>Schiewe, M. C. Quality control factors influencing the successful and reliable implementation of oocyte and embryo vitrification. <a target="_blank" href="http://www.intechopen.com/books/cryopreservation-in-eukaryotes/quality-control-factors-influencing-the-successful-and-reliable-implementation-of-oocyte-and-embryo-">Cryopreservation</a>. Marco-Jiménez, F., AkdemirKoç, H. , 1st Ed, InTech. Rijeka, Croatia. (2016).</li>
<li>Stachecki, J. J., Garrisi, J., Sabino, S., Caetano, J. P. J., Wiemer, K., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+safe%2C+simple%2C+and+successful+vitrification+method+for+bovine+and+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">A new safe, simple, and successful vitrification method for bovine and human blastocysts.</a> Reprod. Biomed. Online. 17, 360-367 (2008).</li>
<li>Panagiotidis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+versus+closed+vitrification+of+blastocysts+from+an+oocyte-donation+programme%3A+a+prospective+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biomed.+Online%22%5BJournal%5D)">Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocyte-donation programme: a prospective randomized study.</a> Reprod. Biomed. Online. 26, 470-476 (2013).</li>
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<li>Schiewe, M. C. MicroSecure vitrification for oocytes and embryos: optimum simplicity, security and cost and effectiveness combining FDA-approved products. J. Clin. Embryol. 13, 33-51 (2010).</li>
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<li>Seki, S., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+warming+rate+on+the+survival+of+vitrified+mouse+oocytes+and+on+the+recrystallization+of+intracellular+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on the recrystallization of intracellular ice.</a> Biol. Reprod. 79, 727-737 (2008).</li>
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<li>Whitney, J. B., Nugent, N. L., Anderson, R. E., Schiewe, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+center+validation+of+routine+blastocyst+biopsy+implementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Asst.+Reprod.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single center validation of routine blastocyst biopsy implementation.</a> J. Asst. Reprod. Genet. , (2016).</li>
<li>Liebermann, L., Conaghan, J. <a target="_blank" href="http://embryologists.com/jce161-artificial-collapse-prior-blastocyst-vitrification/">Artificial collapse prior blastocyst vitrification: improvement of clinical outcomes.</a> J. Clin. Embryol. 16, 107-118 (2014).</li>
<li>Parmegiani, L., Tatone, C., Cognigni, G. E., Bernardi, S., Troilo, E., Arnone, A., Maccarini, A. M., Di Emidio, G., Vitti, M., Filicori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+warming+increases+survival+of+slow-frozen+sibling+oocytes%3A+a+step+towards+a+single+warming+procedure+irrespective+of+the+freezing+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Rapid warming increases survival of slow-frozen sibling oocytes: a step towards a single warming procedure irrespective of the freezing protocol.</a> Reprod Biomed Online. , (2014).</li>
</ol>

MC Schiewe atua como membro do conselho científico para inovadoras Cryo Empresas e como Director Técnico da California Cryobank. A produção deste vídeo-artigo tenha sido pago por Ovation fertilidade. Os autores não têm acordos ou conflitos de interesses financeiros concorrentes a revelar sobre a vitrificação de gametas e embriões.

Hoje em dia, existe uma elevada expectativa de alcançar a sobrevivência blastocisto completa (&gt; 95%) e alcançar o sucesso semelhante ao implante de embriões frescos. Alguns grupos têm sugerido que as taxas de nascidos vivos de ciclos de transferência de embriões vitrificadas são talvez ainda mais elevados do que os blastocistos fresco quando o embrião criopreservado intacta é transplantado para um útero saudável, não-estimulada hormonalmente. Os nossos dados indicam claramente que a vitrificação eficaz e fiável mantém a viabilidade do embrião fresco. Além disso, provámos que a nossa asséptica, método fechado, chamado MicroSecure de vitrificação (uS-VTF), pode conseguir uma optimização dos resultados comparáveis ou superiores aos padrões comerciais (isto é, sistemas de dispositivo abertos) utilizados na indústria de FIV. Variação está associada com repetibilidade técnica e confiabilidade entre os indivíduos usando uma infinidade de vitrificação dispositivos / métodos. Por sua vez, isso resultou em inconsistencies entre os programas de aplicação de vitrificação. Portanto, não é surpreendente que dispositivo de familiaridade é um fator importante a respeito de proficiência laboratorial e resultados bem sucedidos. É este conceito de &quot;assinatura técnica&quot; 11 que explica por que a repetibilidade entre programas pode ser problemático. Não só o desenvolvimento de mais do que uma dúzia de dispositivos comerciais complicado este fenómeno, que criou preocupações de controle de qualidade. Felizmente, fechou sistemas de vitrificação, como uS-VTF, Rapid-I, e VitriSafe, estão agora a revelar-se igualmente eficaz para abrir sistemas de dispositivo de 12, 13, 14. MicroSecure VTF é um romance, técnica de vitrificação asséptica desenvolvida com facilidade técnica, confiabilidade e crio-segurança em mente. Ao combinar a utilização de dois dispositivos previamente aprovados pela FDA,-compatíveis, que é um sistema de vitrificação não comercial Wom a vantagem de ter um baixo custo estabelecido, em contraste com dispositivos especializados. Além disso, sua inviolável única e sistema de rotulagem de duas cores internalizado, bem como inúmeras outras vantagens de controle de qualidade, fizeram uS-VTF uma opção global atraente 11. Como um dispositivo de VTF não-comercial, no entanto, a sua aplicação generalizada indústria está evoluindo lentamente. Só através da publicação contínua da sua segurança, segurança e eficácia clínica vai ganhar uS-VTF utilização crescente. Em agosto de 2014, quando confrontados com a incapacidade de adquirir o original palha embrião de 0,3 mL fabricado com um non-wicking plugue interior, hidrofóbico, fomos capazes de modificar de forma confiável o método uS-VTF. Em suma, os novos sêmen de 0,3 mL / palhas embrião com seus tampões de algodão-PVP foram efetivamente adaptada. Isto foi simplesmente alcançado através da criação de um selo interno antes do tampão de algodão, evitando assim o contacto e fluido de drenagem com oponta VTF aberto (ou seja, o flexipette contendo o embrião ou ovos). Além disso, se 40-mm hastes de identificação não são acessíveis, o problema associado com a flutuabilidade das hastes mais leves de 30 mm pode ser counterweighted usando dois rolamentos de esferas. Estes passos adicionais fizeram a técnica um pouco menos simples, mas ainda altamente eficaz. Hoje, economia e eficácia estão se tornando cada vez mais preocupações importantes, como blastocistos biopsiados são tipicamente vitrificados individualmente até o seu estado euploidy é confirmado em um relatório genética. Blastocistos com um estatuto de aneuploidia não viáveis ​​confirmou normalmente descartadas, com o consentimento do paciente, dentro de algumas semanas. Assim, a maioria (&gt; 50%) dos dispositivos de VTF são descartados após um armazenamento de curto termo, causando um custo anual crescente na utilização de dispositivos comerciais. No geral, uS-VTF é um procedimento altamente eficaz, confiável e repetível para a criopreservação de blastocistos humanos. O securel projeto de controle de qualidade superioretiquetas y e segura armazena embriões / ovócitos ao eliminar a falha de recuperação e otimizar a sobrevivência pós-aquecimento e viabilidade, o que justifica o uso do sistema como uma abordagem universal para a vitrificação de embriões.

A vitrificação é a tecnologia assistida maior impacto único reprodutiva na indústria de fertilização in vitro (FIV) desde o desenvolvimento da injeção intracitoplasmática de espermatozóides. Hoje, os blastocistos são criopreservadas sem a perda na viabilidade do embrião anteriormente associado com métodos slow-congelação convencionais 1. Com sobrevivência embrionária pós-aquecimento confiável, a indústria da infertilidade está se transformando em o uso preferencial de ciclos de transferência de embriões criopreservados, que produzem os resultados da gravidez semelhantes ou mais elevados do que a transferência de embrião tradicional fresco. Em associação com a biópsia do blastocisto e rastreio genético pré-implantação (PGS), vitrificação tornou-se uma ferramenta clínica vital para otimizar os resultados de nascidos vivos saudáveis através euploid única transferência do embrião 2, 3. Vitrificação embrião murino foi desenvolvido em meados dos anos 1980 4, </sup&gt; 5 e adaptado para agricultura animal até 1990 6. Com base na premissa de que as soluções de vitrificação formar um estado metaestável glasseous, livre de danificar a formação de cristais de gelo, que tem provado mais eficientemente preservar a integridade celular completa de embriões. Curiosamente, a aceitação promissora de vitrificação em embriologia humana não começou a ser realizado até o século 21. Publicações antigas que promovem o uso de vitrificação coincidiu com o desenvolvimento de originais &quot;abertos&quot; os dispositivos do sistema 7, 8, 9. No entanto, a adoção de vitrificação para a prática clínica foi lento, como veio num momento em que melhorias no congelamento lento blastocisto foram ocorrendo também. Bem sucedido convencional de congelamento de taxa lenta, em adição à vitrificação, foram alinhadas com melhoramentos em sistemas de cultura de embriões, assim como com a incorion de abordagens blastocele-colapso, o que aumentou tanto a sobrevida global dos trofectoderma e, posteriormente, o implante 10. Na última década, a tecnologia de vitrificação suplantou rapidamente práticas de congelamento convencionais. Em grande medida, isso deveu-se ao desenvolvimento de dispositivos de vitrificação especializados. Alguns destes dispositivos têm prejudicado a segurança global, eficiência e eficácia da vitrificação clínica através da introdução de falhas de projeto inerentes aos dispositivos utilizados na indústria de fertilização in vitro 11. Na verdade, as nuances de diferentes dispositivos introduzir variação técnico significativo entre os programas, comumente referido como &quot;assinaturas técnicas&quot; 12. Assim, revistas científicas, como o Journal of Experiments visualizados (JoVE), pode servir como um recurso valioso para demonstrar detalhes técnicos, o que ajudará a reduzir a variação resultado. Outro problema permanente é que éome embriologistas continuam a ser mal informado, ainda hoje, com base em alegações de que o &quot;arrefecimento ultra-rápida de embriões ou ovócitos em um&quot; sistema de vitrificação aberto &quot;(ou seja, o contato embrião direto com azoto líquido (LN 2)) é um pré-requisito para otimizar taxas de sucesso. &quot; Claramente, esta crença é impreciso, com base no sucesso comprovado de asséptica sistemas 13, 14, 15 fechado. Com base nos princípios cryobiological de vitrificação, a eficácia da vitrificação é mais altamente dependente taxas de aquecimento do que sobre as taxas de 16, 17, 18 de arrefecimento. De um modo geral, independente do dispositivo de vitrificação utilizado, a taxa de aquecimento deve exceder a taxa de arrefecimento para assegurar altas taxas de sobrevivência. Taxas de aquecimento elevadas minimizar a oportunidade para qualquer crescimento do gelo (ou seja, o recrystallization de impurezas nucleadas em crio soluções) durante a fase de devitrification do aquecimento. Concedida, a estabilidade da solução de vitrificação (ou seja, o tipo e concentração de agentes crioprotectores utilizados) podem ter um efeito de confusão, mas esta é tratada em uma publicação separada 11. Considerando as questões de taxa de refrigeração-aquecimento, MicroSecure de vitrificação (uS-VTF) foi desenvolvido em 2008 como um método barato, não-comercial, FDA-compliant que otimizou os aspectos da vitrificação de controle de qualidade. Era o único que ofereceu à prova de violação, internalizado, a rotulagem de duas cores. Além disso, através do carregamento e o armazenamento dos embriões directamente no flexipette estéril usada para pipetagem (isto é, sem pipetagem para uma superfície de dispositivo secundário) e usando palhetas ionomérico-resina que vedam completamente solda utilizando um aferidor automatizado, variação técnica tem sido eficazmente eliminada. Ao avaliar a completeness de dispositivos de vitrificação para uso potencial, existem vários fatores de controle de qualidade que devem ser levadas em consideração, incluindo: 1) A rotulagem potenciais etiquetas -Pode ser firmemente aderido? elas são à prova de falsificação? Será que eles oferecem duas cores potencial de identificação? Ele exige um rótulo secundário, e pode o rótulo ser facilmente removido para fins de manutenção de registros (ou seja, o paciente verificação) pós-aquecimento? 2) facilidade técnica embriões -Pode ser facilmente carregado no / para o dispositivo de uma forma atempada e simplesmente identificadas e rastreadas pós-aquecimento? 3) Processo simplicidade / repetibilidade -Será que o método de vitrificação oferta simplicidade e confiabilidade que facilmente permite a repetibilidade, o que minimiza a variação entre técnicos (internos) e programas (externos)? 4) LN 2 capacidade de armazenamento -Pode os dispositivos ser facilmente e com segurança tratadas e identificadas? É sua storaiva espaço potencial eficiente? Será que o dispositivo de oferta de segurança e protecção contra danos físicos ou possíveis contaminantes como um sistema fechado asséptica? 5) Potencial de Recuperação / sobrevivência -É o projeto do dispositivo propenso a potenciais problemas na recuperação garantida de embriões, e que de forma confiável vitrificar e manter completa integridade celular pós-aquecimento? A última preocupação determinada qualidade, a taxa de recuperação, foi efectivamente surpreendentemente minimizado em relatórios publicados; isso é feito geralmente escondendo o desfecho desfavorável (ou seja, embrião perdido ou ovo) em tipicamente boas taxas de sobrevivência. Qualquer dispositivo propenso a recuperação inconsistente (&lt;99%) está seriamente errado e constitui um passivo processual. Nossa asséptica, fechou método uS-VTF foi estrategicamente desenvolvido para explicar cada medida de controle de qualidade. No entanto, após 5 anos de sucesso clínico superior e validação 14, o procedimento teve to ser modificado. As palhetas de embrião de 0,3 mL originais (que possuem um tampão hidrofóbico) foram removidos da indústria de FIV e substituído com um canudo de sémen 0,3 mL possuindo um tampão de algodão / PVP padrão (isto é, sémen renomeado como uma palha / embrião). Este artigo descreve as etapas processuais e estratégias específicas necessárias para implementar uS-VTF de forma segura, simples e eficaz. Além disso, destaca-se a modificação (s) necessária para dar conta de forma confiável por limitações de fornecimento, até o momento em um recipiente de palha alternativa ideal é reintroduzido de volta para o laboratório clínico.

<table><tbody><tr><td>Cana de alumínio</td><td>IVM</td><td>XC055</td><td></td></tr><tr><td>Rolamentos de esferas, 3/32"</td><td>VXB.com</td><td>KIT15977</td><td>aço inoxidável</td></tr><tr><td>CBS sêmen/embrião palha, 0,3 mL</td><td>CryoBioSystems</td><td>25292</td> cor <td>estéril individual</td></tr><tr><td>, hastes de identificação, 30 mm</td><td>CryoBioSystems</td><td>019021-26</td><td>tubos de cultura ponderados</td></tr><tr><td>, 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td>Cônico</td></tr><tr><td>Tubos de cultura, 10 mL</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td>Snap-cap</td></tr><tr><td>Cryosleeves</td><td>Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Filter, 250 mL</td><td>Fisher Sci.</td><td>09-740-2A</td><td>0,22 &mu; m</td></tr><tr><td>Frascos, Cultura de Tecidos 50 mL</td><td>Falcon</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Flexipettes, 300 &mu; m ID</td><td>Cook Med.</td><td>K-FPIP-1300-10BS-5</td><td>Estéril, 20/pacote</td></tr><tr><td>de Pinça, Grande</td><td>Pinça Miltex</td><td>6-30TC</td><td></td></tr><tr><td>, Lasca - fina</td><td>Cálice Miltex</td><td>17-305</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IVM</td><td>PA003</td><td></td></tr><tr><td>Seladora Térmica, SYMS 1</td><td>CryoBioSystems</td><td>16399</td><td>110 V ou 220 V com adaptador</td></tr><tr><td>Mídia tamponada com hepes&nbsp;</td><td>Vida Global ou</td><td>LGGH-100; 100&nbsp; mL, ou</td><td>armazenado em 2 - 8 &ordm; C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>H-HTF; 90126; 100 mL</td><td>com etiquetas AA's não essenciais</td></tr><tr><td>, Cryo</td><td>GA International</td><td>CL-23T1</td><td>Várias cores</td></tr><tr><td>Tanque de Nitrogênio Líquido, 40&nbsp; L</td><td>MVE ou Taylor Warton</td><td>vários</td><td>armazenamentos de líquidos&nbsp;</td></tr><tr><td>LN2; Garrafa de dewar, 0.5&nbsp; L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-695</td><td></td></tr><tr><td>Pratos Custer de 6 poços</td> em aço inoxidável <td>Biogenics</td><td>015/020</td><td>plasticware por estojo</td></tr><tr><td>Bulbo de pipeta, Micro Cap</td><td>Drummond</td><td>Fisher#13681451</td><td>Orifício no ápice do bulbo</td></tr><tr><td>Placas de Petri, Placas</td> de Petri <td>Falcon</td><td>351006</td><td></td>de 35 mm</tr><tr>, Placas de Petri <td>Nunc</td><td>150288</td><td></td><td>de 58 mm</td></tr><tr><td>, 100 mm</td><td>Pontas</td> de Pipeta <td>Falcon 351029</td><td></td></tr><tr><td>, ART long</td><td>Fisher Sci.</td><td>02-707-80</td><td>10 - 100 &mu; L</td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond ou Falcon</td><td>vários</td> dispositivos de pipetagem <td>recarregáveis</td></tr><tr><td>, Pipetas</td><td>Cirúrgicas Stripper Cooper</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>, Sorológico 1&nbsp; Pipetas de</td><td>357521</td><td></td><td>Falcon</td> mL</tr><tr><td>, Sorológicas 2&nbsp; mL</td><td>Falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas, Sorológico 5&nbsp; mL</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas, Sorológico 10&nbsp; mL</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura, Microscópio Estereomicroscópio Cirúrgico Mayo</td><td>Miltex</td><td>5-SC-16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon, Olympus, Leica</td><td>várias</td><td></td></tr><tr><td>almofadas de gaze estéreis, 4" x 4"</td><td>Kendall Healthcare</td><td>6939</td><td></td></tr><tr><td>Soro sintético</td><td>Life Global, ou</td><td>LGPS-20; 20 mL, ou</td><td>armazenado em 2 - 8 &ordm; C</td></tr><tr><td></td><td>Irvine Scientific</td><td>SS-99193; 12 x 10 mL</td><td>lote de compra de baixa endotoxina</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>#S9378</td><td>Alíquota em 50&nbsp; frascos de mL, 1 ano; 
17,1 g/frasco + Meio a 50 mL; 
faz uma solução de 1 M; 
Filtro com 0,22 &micro; m unidade</td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Nalgene</td><td>5016-001</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Descongelamento</td><td>Inovadora Cryo Enterprises</td><td>BL-TS (&le; 1,0 M Sacarose)</td><td>T1, T2, T3, T4; tored em 2 - 8 &ordm; C para &le; 1 mês após a abertura</td></tr><tr><td>da solução de vitrificação*,**</td><td>Innovative Cryo Enterprises</td><td>BL-VS (&ge; 7,9 M [Glicerol/EG])V1</td><td>, V2, V3; armazenado a 2 - 8 &ordm; C para &le; 1 mês após a abertura</td></tr><tr><td colspan="4">* Aditivos crioprotetores não permeantes podem incluir: sacarose, ficoll e hialuronato de sódio&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">** Outras preparações comerciais são tipicamente etilenoglicol (EG)/dimetilsulfóxido (DMSO; 30% v/v; 4,8 M), mas podem ser EG/propilenoglicol (32% v/v; 5,2 M). Soluções mistas são normalmente usadas para reduzir as preocupações de criotoxicidade de uma solução molar alta. As soluções comerciais normalmente incluem uma solução ES e VS. A formulação da preparação comercial é tipicamente propriedade proprietária.</td></tr></tbody></table>

modificada vitrificação microsecure: um altamente procedimento seguro, simples e eficaz para criopreservação blastócitos humanos

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clínica vitrificação embrião evoluiu com o desenvolvimento de dispositivos de vitrificação únicas no século 21 e com o equívoco de que o resfriamento ultra-rápida em um sistema &quot;aberto&quot; (ou seja, direta LN 2 contato) era uma necessidade para otimizar o sucesso vitrificação. O dogma em torno da importância de taxas de resfriamento levou a práticas inseguras sujeitas à variação técnica e à criação de dispositivos de vitrificação, que desrespeitam importantes fatores de controle de qualidade (por exemplo, facilidade de uso, repetibilidade, a fiabilidade, segurança rotulagem, segurança e armazenamento). Compreender as falhas de outros dispositivos permitidos para o desenvolvimento de um método de uS-VTF segura, segura, repetível e confiável teve como objetivo minimizar a variação intra e inter-técnico de controle de qualidade. Igualmente importante, ele combinou a disponibilidade de dois dispositivos FDA compatíveis existentes: 1) a ionomï¿½ico palha resina embrião de 0,3 mL com internalizado, de duas cores, adulterar-protulagem telhado com potencial de solda da vedação repetível; e 2) encurtado, comumente utilizado, de 300 uM ID flexipettes estéreis para carregar directamente o embrião (s), a fim de criar um dispositivo de vitrificação global altamente eficaz. À semelhança de outros asséptica, fechou sistemas de vitrificação (por exemplo, alta Vitrificação de Segurança (HSV), Rapid-i, e VitriSafe) efetivamente usada na medicina reprodutiva, microSecure Vitrificação (uS-VTF) provou que ele pode atingir uma alta de sobrevivência pós-aquecimento e gravidez resultados com a sua atenção para a simplicidade, e reduziu a variação técnica. Embora a palha embrião 0,3 ml, contendo uma ficha interna hidrofóbica foi comercialmente substituído com uma palha sémen padrão possuindo pirrolidona algodão de polivinil (PVP) plugs, manteve a sua composição de resina ionomï¿½ico para garantir a vedação de solda. No entanto, os tampões de algodão pode pavio o conteúdo fluido-embrião do flexipettes em cima do contato. Um método uS-VTF modificado foi adaptado para incluir uma soldadura interna adicionalselar antes de o bujão no lado do dispositivo de carregamento. A etapa técnica adicionado ao procedimento de uS-VTF não afetou sua aplicação bem-sucedida, as taxas de sobrevivência tão elevadas (&gt; 95%) e as taxas de gravidez continuam até hoje.

1.341 blastocistos vitrificados foram aquecidos entre 2012 a junho de 2014, e 1.341 embriões recuperados (100%), enquanto 1.316 sobreviveram (98,1%). blastocistos biopsiados experimentado ao longo de sobrevivência de 99,5%. Ao transferir predominantemente única, geneticamente testados, euploid, embriões vitrificados, fomos capazes de alcançar algumas das mais altas taxas de implantação e taxas de nascidos vivos nos EUA, independentemente da idade (Figura 3) 20, de acordo com recentes estatísticas nacionais notificados pelo Centro de Controle de Doenças e da Sociedade para Tecnologias de reprodução assistida (Tabelas 1 e 2). Avaliando um paciente população bom prognóstico (menos de 35 anos) para os ciclos criopreservados sozinho (Tabela 1), nosso laboratório superou a média nacional para ambas as taxas de implantação (ou seja, a eficiência de um embrião para estabelecer uma gravidez) e, finalmente, viver taxas de natalidade mais de 30%. Além disso, a validação / verificação inicial dos nossos palhas de armazenamento modificados em meados de 2014 usando 70, blastocistos aneuploides re-vitrificados investigação de consentida resultou na recuperação de 100% e 100% de sobrevivência. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54871/54871fig1.jpg"> Figura 1. Configuração MicroSecure VTF. O prato VTF (A) é montado com 3 linhas distintas de soluções de vitrificação, que utilizam 3 gotas de lavagem antes da colocação em distintas, gotículas de retenção numerados. Além disso, as pipetas com pontas individuais VTF encurtadas (isto é, flexipettes 300 mícrons ID) são protegidas e organizados num suporte de tubos de isopor (B), que pode ser rodado para a utilização adequada. Note-se que um conjunto descartável representante pipetagem micropipeta lâmpada está descansando na prateleira de isopor. arget = "_ blank"&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54871/54871fig2.jpg"> Figura 2. Modificado Blastocyst Grading System. Nosso sistema de blastocisto classificação Gardner modificado explica a hérnia induzida de células TE para facilitar a biópsia do blastocisto. A modificação considera a eclosão prematura de blastocistos completos (A: Grau 3 = menos de 10% hérnia) e blastocistos expandidos (B: Grau 4 = até 50% hérnia), enquanto um blastocisto incubação (C) tem mais de 50% hérnia 16. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 54871fig3.jpg "/&gt; Figura 3. gravidez resultados comparativos. Ao longo de um intervalo cumulativa de 1,5 anos, os dados de gravidez foram comparados para avaliar os efeitos de transferência de blastocistos euplóides vitrificados-aquecido (n = 172 ciclos / 144 transferências) em comparação com os ciclos não-PGS (n = 160 ciclos / 153 transferências) que envolvem predominantemente fresco transfere 18. Para os nossos propósitos experimentais, estes dados revelam claramente que blastocistos biopsiados vitrificados pelo procedimento uS-VTF manter a sua viabilidade. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54871/54871fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Fonte de dados </td><td> # Cycles </td><td> A média de # de embriões transferidos </td><td> Implantação de taxas (%) </td><td> Taxas de nascidos vivos (%) </td></tr><tr><td> Lab NB * </td><td> 144 </td><td> 1.2 </td><td> 74.00% </td><td> 74.50% </td></tr><tr><td> Média nacional </td><td> 20423 </td><td> 1.7 </td><td> 39.60% </td><td> 44.10% </td></tr><tr><td colspan="5"> * Os dados foram calculados com base no desempenho dos 2014 Orange County Fertilidade, sul da Califórnia Centro de Fertilidade e do California Centro Southern para clínicas de medicina reprodutiva usando o laboratório de fertilidade Ovation atual (NB Lab), que fundou o procedimento microSecure vitrificação em 2008. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. 2014 CDC Assistida Estatísticas Reprodutivos. dados gravidez transferência de embriões congelados de mulheres com menos de 35 anos de idade de três relatórios clínicas médicas usando o nosso Lab NB comparação com a média nacional dos EUA 2013, de mais de 450 clínicas de relatórios. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Médias SART Nacionais </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clinic - Estado </td><td> Mulheres </td><td> Mulheres </td><td> Mulheres </td><td> Mulheres </td></tr><tr><td></td><td> &lt;35 anos </td><td> 35-37 anos </td><td> 38-40 anos </td><td> 41-42 anos </td></tr><tr><td> SCCRM-CA * </td><td> 63,1% </td><td> 58,3% </td><td> 40,6% </td><td> 32,3% </td></tr><tr><td> CCRM-CO * </td><td> 64,7% </td><td> 61,5% </td><td> 40,4% </td><td> 32,2% </td></tr><tr><td> RMA-NJ * </td><td> 63,2% </td><td> 59,7% </td><td> 34,6% </td><td> 18,7% </td></tr><tr><td> Média nacional </td><td> 48,6% </td><td> 38,3% </td><td> 24,3% </td><td> 12,3% </td></tr><tr><td colspan="5"> SCCRM-sul da Califórnia Centro de Medicina Reprodutiva; Centro CCRM-Colorado por de Medicina Reprodutiva; e RMA-Reproductive Medicine Associates </td></tr><tr><td colspan="5"> * Estas clínicas principais foram todos predominantemente implementado ciclos de transferência de embriões vitrificados, em associação com o teste genético pré-implantação, em sua prática padrão de atendimento para otimizar o sucesso de nascidos vivos por embrião transplantado. </td></tr></tbody></table> Tabela 2. 2014 taxas de nascidos vivos cumulativos, como relatado pela Sociedade de Tecnologias de Reprodução Assistida (SART), para a Clínica SCCRM usando o nosso Ovation Fertilidade Lab em Newport Beach, CA, em contraste com vários outros programas respeitados, bem como com o SART médias nacionais.

MicroSecure Vitrification foi desenvolvido como um sistema de dispositivo de vitrificação fechado asséptico não comercial que está em conformidade com as boas práticas de fabricação e manuseio de tecidos da FDA. Devido à retirada de canudos de embriões com tamponamento hidrofóbico da indústria, o procedimento de vitrificação foi modificado para incluir uma vedação interna antes do tampão de algodão interno padrão.

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

O objetivo geral do método de vitrificação de embriões MicroSecure é fornecer um procedimento de vitrificação fechada asséptica seguro, simples, mas eficaz, para embriões humanos. Este método foi desenvolvido para minimizar as variáveis de controle de qualidade na vitrificação de embriões humanos, garantindo assim um sucesso confiável e reprodutível. A principal vantagem dessa técnica é que ela se esforça para eliminar variações técnicas entre biólogos e laboratórios.Nossa técnica é tão simples de executar que achamos que o maior desafio para nossos alunos é aprender a pipetar embriões sem perdê-los. A ideia por trás do nosso método era eliminar a necessidade de dispositivos especializados, adaptando dois itens comumente usados aprovados pela FDA. Um canudo de armazenamento ionomérico rotulado internamente e um flexipet estéril.A demonstração visual dessa técnica é extremamente útil, pois destaca as dicas básicas que garantem sua aplicação bem-sucedida. Antes de iniciar o procedimento, coloque o canudo de sêmen estéril de 0,3 ml na superfície de teflon do eletrodo de um selador de impulso de mesa básico, bem na frente do plugue, para criar uma vedação interna. Pressione a alça para ativar o aquecimento, soltando a alça quando a luz vermelha estiver apagada e um bipe for ouvido.Em seguida, empurre o plugue de algodão para frente contra a vedação interna antes de concluir a configuração. Para criodiluição e carregamento de blastocisto das amostras, remova a placa de cultura do paciente da incubadora e confirme todas as identificações de amostras com uma fonte secundária. Sob um estereomicroscópio, use um flexipet de vitrificação, conhecido como ponta de vit, para mover os blastocistos para gotículas individuais na linha superior de uma placa criogênica correspondente.Em seguida, pré-preencha o flexipet com 3 microlitros de solução V1 e dispense metade do conteúdo no primeiro embrião. Aspire o embrião e transfira-o para a primeira gota de lavagem V1. Em seguida, pipete o embrião duas a três vezes ao redor do perímetro da gota e limpe o conteúdo residual da pipeta fora da gota na superfície do prato.Em seguida, mova o blastocisto para uma gota de retenção V1 individual e pré-carregue a ponta vit com a próxima solução V2 antes de pipetar os embriões adicionais com uma nova ponta vit. Depois de lavar todos os blastocistos nas gotículas V2 e V3 como acabamos de demonstrar, limpe a solução residual e as bolhas da ponta vit fora da gota de retenção V3 e encha completamente a ponta com solução V3 limpa ao redor do primeiro embrião. Expulsar aproximadamente 1 microlitro do volume e aspirar o blastocisto e a solução V3 restante completamente na ponta do vit.Agora, remova a ponta da pipeta e use uma gaze estéril para secar a solução V3 residual da superfície externa da ponta vit. A secagem da superfície externa da ponta é crítica e não incorre em nenhum risco adicional de perda de embriões. Em seguida, insira a ponta primeiro na extremidade aberta do canudo pré-selado e inverta o canudo, com a ponta da etiqueta para baixo.Observe a ponta no plugue interno. Deixe um espaço aéreo de 1 cm na extremidade aberta e, em seguida, sele-o com segurança. Quando todos os canudos estiverem selados, mergulhe-os diretamente no nitrogênio líquido em um frasco de aço inoxidável e guarde os canudos no cálice aberto preso à bengala do paciente.Para eluição e diluição de crio-solução, colocar a placa de diluição de seis poços correspondente no centro de uma platina de estereomicroscópio e uma placa de Petri de 60 mm contendo um banho de aquecimento de sacarose a 37 graus Celsius em um lado do microscópio. Em seguida, isole o canudo a ser aquecido e segure o selo superior do canudo acima do nível do líquido para confirmar a identidade da amostra. Use uma tesoura de maionese para prender o canudo abaixo do tampão interno, para manter a ponta do vit submersa no nitrogênio líquido.Bata firmemente a tesoura contra o frasco dewar várias vezes para desalojar a ponta da parede lateral interna do canudo como precaução de controle de qualidade e levante o canudo no ar ambiente em uma orientação horizontal ao lado ou abaixo da superfície do estereoscópio. Segurando a extremidade não rotulada do canudo, corte o canudo no plugue interno. Em seguida, levante o canudo acima do prato de banho de aquecimento e despeje a ponta vit no banho em um ângulo de 60 graus, até que a ponta esteja completamente extrudada.A base do flexipet deve ficar acima da parede lateral do prato. Após 5 a 10 segundos, transfira a base da pipeta para um dispositivo de pipetagem de microcap. Inicie um cronômetro de cinco minutos.Ao visualizar o microscópio, use um dedo indicador para cobrir o orifício do bulbo e aperte suavemente o bulbo para liberar o blastocisto vitrificado da ponta vit na lavagem T1. Depois de confirmar a liberação do blastocisto, limpe a solução V3 residual e as bolhas por pressão positiva, evacuando o conteúdo para o centro de um poço de descarte não utilizado. Transfira a ponta vit para uma pipeta sterber, movendo o embrião para a segunda gota T1 sob óleo pelos quatro minutos restantes.Durante a incubação, pré-encha o flexipet com a próxima solução e, em seguida, dilua o blastocisto nas gotículas T2, 3 e 4 em intervalos de três minutos. Por fim, equilibre os blastocistos na gota T5 por cinco minutos em uma superfície de 37 graus Celsius, antes de devolvê-los à incubadora. O Sistema de Classificação de Blastocisto de Gardner Modificado considera os blastocistos completos como tendo menos de 10% de herniação das células do trofectoderma, enquanto os blastocistos com até 50% de hérnia são classificados como expandidos.Os blastocistos que demonstram uma hérnia superior a 50% são considerados eclodidos. Usando os métodos de criopreservação e aquecimento demonstrados, altos níveis de nascidos vivos por início de ciclo foram consistentemente alcançados com ou sem testes genéticos pré-implantação. Embora esses sucessos sejam consideravelmente maiores, usando blastocistos euplóides pré-selecionados.De fato, avaliando uma população de pacientes com bom prognóstico apenas para ciclos criopreservados, esses dados de transferência de embriões congelados demonstram melhores taxas de sucesso do que a média nacional para as taxas de implantação e nascidos vivos em mais de 30%Ao transferir blastocistos vitrificados euplóides geneticamente testados predominantemente, algumas das maiores taxas de implantação e taxas de nascidos vivos nos Estados Unidos, independentemente da idade, foram alcançados, em comparação com as estatísticas nacionais recentes relatadas pelo Centro de Controle de Doenças para duas outras clínicas de fertilidade respeitadas e os dados divulgados pela Society for Assisted Reproductive Technologies. A vitrificação MicroSecure é um novo procedimento asséptico desenvolvido para facilidade técnica, confiabilidade e criosegurança em mente. Este sistema de vitrificação simples e não comercial oferece uma alternativa altamente eficaz e de baixo custo aos dispositivos de vitrificação.Desde o seu desenvolvimento, o método MicroSecure garantiu mais de 99,9% de recuperação embrionária e mais de 95% de sobrevivência completa do blastocisto. Isso permitiu a transformação de nossa prática clínica em quase todos os ciclos de transferência de embriões criopreservados nos últimos três anos. Modificamos efetivamente nosso procedimento para incluir uma vedação interna na frente do tampão de algodão dos canudos de sêmen ionomérico para ainda produzir vedações de solda confiáveis e excelentes resultados pós-aquecimento.Existem muitos sistemas de dispositivos diferentes usados nas indústrias de tecnologia reprodutiva assistiva hoje, mas nenhum outro dispositivo oferece a simplicidade e a repetibilidade técnica para eliminar essencialmente a variação do usuário e fornecer segurança otimizada, como a vitrificação MicroSecure.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

Neste vídeo, demonstramos um método de criovitrificação ultrarrápida para preservar amostras biológicas. O método envolve o uso de uma combinação de crioprotetores para proteger o tecido biológico dos danos causados pelo congelamento, evitando a formação de cristais de gelo intracelulares.

Criopreservação baseada em vitrificação: uma técnica de resfriamento ultrarrápido para preservar espécimes biológicos em temperaturas muito baixas para armazenamento de longo prazo

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de vitrificação de embriões de coelho colhidos no estágio de desenvolvimento desejado usando etilenoglicol e dimetilsulfóxido como crioprotetores e palha criogênica como sistema de transporte. Os embriões vitrificados têm alta taxa de sobrevivência e podem ser armazenados por um longo período até o uso.

Vitrificação de embriões de coelho usando palha criogênica: uma técnica de resfriamento ultrarrápido para preservar embriões de coelho para armazenamento a longo prazo

As técnicas reprodutivas assistidas (ARTs) estão em avaliação contínua para melhorar os resultados e reduzir os riscos associados. Este manuscrito descreve um procedimento de transferência de embriões minimamente invasivo com um protocolo de criopreservação eficiente que permite o uso de coelhos como um modelo animal ideal de reprodução humana.

Transferência de embriões minimamente invasivos e vitrificação embrionária na fase de embrião ideal em modelo de coelho

Aqui nós apresentamos um protocolo morfométricos lapso de tempo para acompanhar a intensidade do encolhimento de blastocisto e re-expansão durante as intervenções de previtrification e recuperação pós-aquecimento. A aplicação do protocolo, é possível em vitro laboratórios fertilização equipados com microscópios de lapso de tempo e recomenda-se no desenvolvimento de um método de vitrificação de blastocistos ideal.

Morfométricos protocolo para a avaliação objetiva do comportamento de blastocisto durante a vitrificação e aquecimento passos

A biópsia e a vitrificação do Blastocyst são exigidas para conduzir eficientemente o teste genético do pré-implante. Uma aproximação que implica a abertura seqüencial da zona pelúcida e a recuperação de 7-8 pilhas do trofectoderma no dia 5-7 pós-inseminação limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal.

Biópsia e vitrificação humana do Blastocyst

Este manuscrito descreve um protocolo para a vitrificação de volume mínimo de oócitos imaturos de gatos com mídias de laboratório sobre suportes comerciais. Abrange cada passo desde o isolamento oócito desde gônias ex vivo até vitrificação e aquecimento.

Vitrificação de Volume Mínimo de Oócitos Felinos Imaturos

A criopreservação oócito é reconhecida por várias sociedades científicas internacionais como o padrão ouro para a preservação da fertilidade em mulheres pós-púbertas. Estratégias clínicas e laboratoriais adequadas garantem a máxima eficácia, eficiência e segurança dos tratamentos de preservação da fertilidade.

Preservação da Fertilidade Através da Vitrificação de Oócitos: Perspectivas Clínicas e Laboratoriais

O protocolo visa fornecer um método padrão para a vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e juvenis. Inclui todos os passos desde a preparação dos meios de amadurecimento in vitro até a cultura pós-aquecimento. Os oócitos são vitrificados na fase MII usando o Cryotop para garantir o volume essencial mínimo.

Vitrificação de Oócitos Maduros In Vitro coletados de ovários adultos e prepubertais em ovelhas

Um protocolo para a vitrificação de tecido ovariano, como um método alternativo de criopreservação ao protocolo de congelamento lento amplamente utilizado, é apresentado.

Vitrificação do tecido do córtex ovariano para atingir um estado vítreo de agregação

Aqui, apresentamos o protocolo Spatula Montevideo para vitrificação de embriões pré-implantacionais de camundongos e ovelhas, consistindo em uma espátula caseira e utilizando soluções caseiras. Os embriões são rapidamente equilibrados em duas soluções crioprotetoras de concentração crescente, carregadas na espátula, imersas em nitrogênio líquido e, finalmente, seladas com um canudo de 0,5 mL.

Espátula Montevidéu Dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos

Aprenda a vitrificação MicroSecure para criopreservação de embriões humanos usando canudos ionoméricos e flexipets estéreis. Este método simples elimina variações técnicas e garante taxas de sucesso reprodutíveis em laboratórios.

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos (Vídeo) | JoVE Journal

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

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