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Adicione meios e anti-soros tratados com enzimas destruidoras de receptores diluídos em série em monocamadas de células de mamíferos, evitando a ligação inespecífica ao vírus.
Adicione uma suspensão do vírus influenza. Os anticorpos anti-soros, específicos para proteínas virais, ligam-se, neutralizando os vírus e impedindo a entrada celular.
A baixa concentração de anticorpos neutralizantes ou anticorpos não neutralizantes permitem a ligação ineficaz do antígeno viral, permitindo a ligação do vírus aos receptores celulares.
Descarte a mídia. Aplique meios contendo celulose, formando uma camada semi-sólida.
O vírus usa a maquinaria da célula hospedeira para formar partículas virais e causar lise celular.
A sobreposição restringe o movimento do vírus, facilitando a infecção localizada e criando buracos nas monocamadas celulares.
Remova a sobreposição. Fixe e permeabilize as células.
Lave com tampão. Adicione anticorpos que se ligam a antígenos virais dentro das células permeabilizadas.
Pipetar anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano que se ligam a anticorpos primários.
Introduzir substratos de peroxidase e peróxido de hidrogênio, resultando em um produto azul.
Poços de imagem para quantificar populações de células infectadas por vírus contra diluições de anti-soro.
Identifique diluições de anti-soros indicando uma redução especificada em uma população de células infectadas para determinar os títulos de neutralização.
Para realizar a neutralização do vírus, prepare a monocamada celular com dois ou três dias de antecedência e, em seguida, adicione 50 microlitros de VGM a cada poço da placa. Use as colunas 11 e 12 para o controle de vírus e controle de células, respectivamente. Adicionar alíquotas de 50 microlitros de uma diluição de 1 em 20 da enzima destruidora dos recetores ou do soro tratado com RDE à primeira fila das colunas 1 a 10.
Realize diluições seriais duplas transferindo 50 microlitros da linha A para a linha H e descartando 50 microlitros da linha H. Em seguida, adicione 50 microlitros de diluente a cada poço da coluna de controle da célula. Adicione 50 microlitros do vírus a cada poço da placa, exceto para a coluna de controle da célula. Incube a placa a 37 graus Celsius por duas a três horas. Em seguida, remova o inóculo e adicione a cobertura a cada poço. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius sem ser perturbada. Em seguida, fixe e manche as placas.
Para quantificar a neutralização, coloque uma placa de poço na área de varredura de um scanner de mesa. Digitalize a placa e execute o software leitor de placas de poço para calcular os títulos virais necessários.