Name: Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a realizar imunoensaios capilares automatizados para quantificação proteica com volumes reduzidos de amostra. Este método otimiza tempo de exposição e diluição de anticorpos para resultados reprodutíveis em poucas horas.

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Os autores gostaria de agradecer Keith Tarpley nos EPA escritório da equipe de pesquisa e desenvolvimento-Research Triangle Park (ORD-RTP) gráfico e mídia para o desenvolvimento, gravação e edição de vídeo instrucional. Também gostaríamos de agradecer a Deborah Pritchett de ProteinSimple útil conversas sobre otimização de nossos dados,. JM Guynn foi apoiado pelo Instituto de Oak Ridge para ciência e educação programa de pesquisa/participação nos Environmental Protection Agency.

Nota: Certifique-se de que todos os reagentes e amostras são preparadas de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s, descrito abaixo. Por favor, use equipamento de proteção pessoal adequada durante este procedimento, que inclui luvas de nitrilo, jaleco, sapatos fechados e óculos de segurança. Uma tabela de materiais específicos, reagentes e equipamentos necessários é fornecida separadamente. Concentração de proteínas totais das amostras deve ser determinada previamente usando metodologias estabelecidas que são compatíveis com o lisado buffer usado, tais como o ensaio de Bradford 11.
 1. preparação de amostras e reagentes o pacote padrão, como fornecido pelo fabricante <ol><li>para preparar a solução de trabalho de 400 milímetros de ditiotreitol (DTT), adicionar 40 µ l de água deionizada água para o tubo transparente que contém o fornecido pelo estoque do fabricante. É importante evitar a introdução de bolhas para a solução, misturando a solução com lenta e suave pipetagem.</li>
	Amortecedor da amostra <li>Adicionar 20 µ. L 10x e 20 µ l da solução preparada 400 mM DTT ao tubo rosa contendo fluorescente 5 X master mix (veja a Tabela de materiais). 
	Nota: O Master Mix (MM) é selada pelo fabricante com uma tampa de folha e deve ser perfurado por uma ponta da pipeta. Misture suavemente pipetando lento para evitar salpicos TDT na pipeta.</li>
	<li>, Em seguida, adicione 16 água µ l de água deionizada, 2 µ l de fornecido 10 X amortecedor da amostra e 2 µ l da solução preparada 400 mM DTT ao biotinylated branco escada tubo fornecido pelo fabricante. Misture delicadamente e transfira para um tubo de 0,6 mL de desnaturação.</li>
	<li>Preparar 0,1 x amortecedor da amostra diluindo o fornecido 10 X solução 1: 100 com água. Preparar o suficiente 0.1 x amortecedor da amostra para diluir as amostras.</li>
	<li>Calcular a quantidade de tampão de amostra x 0.1 é adicionado a uma amostra, o que dependerá da concentração final desejada da proteína total. Misturar 1 parte 5 x fluorescente MM com 4 peças diluído amostra para obter a concentração de proteína final desejada.
	<ol><li>Calcular volumes da seguinte forma: (i) Volume 5 x fluorescente MM = (concentração de proteína final desejado) / 5; (ii) volume de estoque de proteína = (concentração de proteína final desejado x volume Total necessário) / proteína estoque concentração; (iii) volume 0,1 x amortecedor da amostra = volume Total - 5 x volume de MM - proteína estoque volume.</li>
	</ol></li></ol> 2. Desnaturação de amostras e escada <ol><li>lugar preparado amostras e biotinilado escada em um bloco de calor de 95 ° C para os tubos de vórtice de 5 min. imediatamente após a incubação, executar um giro por ~ 5 s em uma centrífuga de mesa e um lugar na Ice. 
	Nota: Algumas proteínas podem exigir condições de desnaturação mais suaves (por exemplo, 70 o C por 10 min) para prevenir a agregação da proteína e melhorar a migração na matriz capilar. Considere essa opção se houver manchas pesadas no mais alto peso molecular (Veja o vídeo por exemplo).</li>
</ol> 3. Preparação de anticorpos <ol><li>, conforme determinado pela otimização (ver Resultados de representante e vídeo), preparar o dilution(s) desejado do anticorpo primário (por exemplo, 01:50, 1: 100) no anticorpo fornecido 2 diluente. 
	Nota: Os anticorpos são geralmente utilizados em altas concentrações para imunoensaio capilar-baseado do que para a mancha ocidental tradicional. O anticorpo secundário fornecido está pronto para usar sem diluição.</li>
</ol> 4. Preparação de S de Luminol e peróxido de <ol><li>preparar uma mistura 1:1 de S de luminol e peróxido de.</li>
	<li>Vortex para misturar e armazenar na Ice. 
	Nota: É importante que esta mistura está preparada fresco para cada ensaio experimental. 250ul mistura total é necessária para executar um prato cheio.</li>
</ol> 5. Preparação da placa de ensaio <ol><li>, como mostrado na Figura 1, carregar as amostras e reagentes preparados acima na placa de ensaio. Consulte as instruções detalhadas abaixo para cada linha. Para minimizar a evaporação dos poços, certifique-se de que a tampa da placa é substituída entre adições reagente.</li>
	<li>Na linha A, pipetar 5 µ l de Biotinylated escada no poço A1. Para a linha restante, pipetar preparou amostras (5 µ l cada) em poços A2-A25. 
	Nota: É imperativo que o A1 contém bem sempre a escada, como o primeiro capilar no cartucho é otimizado para a execução desta norma.</li>
	<li>Na linha B, pipeta de 10 µ l de diluente 2 anticorpo em cada poço (B1-B25).</li>
	<li>Na linha C, pipetar 10 µ l de diluente 2 anticorpo em C1 bem. Na linha restante C poços, pipetar 10 µ l de anticorpo primário (poços C2-C25).</li>
	<li>Na linha D, pipetar 10 µ l de Streptavidin HRP em D1 bem. Na linha restante poços D, pipetar 10 µ l de anticorpo secundário (poços D2-D25).</li>
	<li>Em linha E, pipetar 10 µ l da mistura preparada na hora luminol-peróxido em cada poço (E1-E25).</li>
	<li>Finalmente, adicionar o tampão de lavagem 500 µ l por compartimento para cada uma das 3 principais linhas dos poços reserva. 
	Nota: É importante minimizar a formação de bolhas por pipetagem suavemente e não expulsando o volume final da ponta como bolhas podem interferir com o capilar de carregar e executar.</li>
	<li>, Uma vez que todos os poços são carregados, centrifugar a placa a ~ 1000 x g por 5 min à temperatura ambiente para remover bolhas e garantir que o líquido é no fundo dos poços. Pop qualquer visíveis bolhas com uma agulha limpa ou ponta da pipeta pequena (por exemplo, calibre 25 estéril &#34; top rep &#34; agulha).</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig1.jpg" /> Figura 1 . Modelo para a placa de ensaio de pipetagem. A codificação de cores representa adequados reagentes e amostras (total até 24) adicionadas à placa de ensaio. Adicionar biotinilado escada para poço A1 (laranja), preparou amostras de poços A2 até A25 (azul claro), anticorpo diluente 2 poços B25-B1 e C1 (verde claro), anticorpo primário para poços C2 até C25 (azul), streptavidin-HRP para bem D1 (rosa escuro), anticorpo secundário para poços de D2 até D25 (verde escuro) e mistura de luminol-peróxido de poços E1 até E25 (roxo). Tampão de lavagem é adicionado para as três primeiras fileiras da placa mid maior poços (azul escuro). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 6. começando o instrumento capilar imunoensaio <ol><li>certifique-se de que o instrumento e o computador que acompanha são ativados. Não aquecer o tempo é necessário.</li>
	<li>Abra o software de instrumentação no computador. Primeiro, selecione o &#34; ensaio &#34; guia no canto direito da janela e &#34; novo ensaio &#34; sob o &#34; Menu arquivo &#34; à esquerda. Selecione o tamanho e escala do tamanho (por exemplo, 12-230 kDa) cartucho tipo (por exemplo, 25 capilar) que foi usado para o ensaio especial. 
	Nota: Um maio também entrado parâmetros de ensaio, incluindo a concentração de proteína, tipo de anticorpo e diluição, se desejado, mas estes não são necessários para iniciar o ensaio.</li>
	<li>Abrir a porta no instrumento pressionando o botão na parte superior do painel laranja.</li>
	<li>Cuidadosamente remova o refil capilar da embalagem. Sem tocar os capilares de vidro, coloque o cartucho no suporte do cartucho. Verifique se o assento do cartucho, observando a luz interior muda de laranja para azul.</li>
	<li>Segure a placa no banco e cuidadosamente Retire o selo de evaporação da parte inferior da placa. Pop bolhas de qualquer vistas estes poços de matriz de separação com um smtodos a ponta da pipeta ou agulha limpa (por exemplo, calibre 25 estéril &#34; top rep &#34; agulha).</li>
	<li>Coloque a placa de ensaio sobre o suporte da placa, garantindo que é totalmente encaixado e feche a porta do instrumento.</li>
	<li>Clique o &#34; iniciar &#34; botão no software. 
	Nota: Se nenhum botão iniciar aparece, a conexão com o instrumento foi perdido. Escolha o instrumento no menu superior esquerdo e, em seguida, conectar-se. Um pop-up aparecerá com o número de série do instrumento; Selecione essa opção e, em seguida, clique em conectar. Botão iniciar deverá aparecer agora.</li>
	<li>Quando a execução é concluída, descartar a placa. Remova o cartucho e coloque em um recipiente de objectos cortantes para descarte, junto com agulhas que pode ter sido usado para pop bolhas. Deixe o poder ligada para evitar problemas de conexão, se o instrumento estiver sendo usado regularmente (por exemplo, pelo menos semanalmente).</li>
</ol> 7. Experimento de análise <ol><li>antes da análise, assegurar que são realizadas as seguintes verificações de qualidade.
	<ol><li>Verificar padrões fluorescentes, selecionando o &#34; mostrar padrões &#34; ícone. Verifique se os padrões são corretamente identificados no &#34; gráfico de &#34; guia. Se eles estiverem incorretos, vá para o &#34; única exibição &#34; ícone, clique com o botão direito no pico correto e selecione &#34; força padrão &#34;, ou clique com o botão direito no pico incorreto e selecione &#34; não é um padrão &#34;. Executar esta verificação para cada capilar novo.</li>
		<li>Verify biotinilado escada clicando sobre o &#34; amostras &#34; e &#34; única exibição &#34; ícones. Selecione a escada na guia experiência. Se um pico é identificado incorretamente, clique direito em &#34; gráfico de &#34; e selecione &#34; pico de remover &#34;. 
		Nota: por exemplo, a escada biotinilado usada para o kit de kDa 12-230 deve mostrar 12, 40, 66, 116, 180 e 230 kDa picos de dimensionamento. Se esta etapa não é executada, o dimensionamento dos picos da amostra será calculado incorretamente, produzindo resultados espúrios.</li>
		<li>Vista e analisar picos de amostra. Derivar os dados da tabela de picos, incluindo peso molecular, a área do pico, altura do pico e sinal de ruído (S/N), conforme necessário para cálculos experimentais.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente. Este manuscrito foi revisado pelo nacional de saúde e laboratório de pesquisa de efeitos ambientais e aprovado para publicação. O conteúdo não reflete necessariamente as opiniões do US EPA nem faz menção de nomes comerciais ou produtos comerciais constituem endosso ou recomendação para o uso.

Por décadas, tem havido interesse sustentado no desenvolvimento de métodos de imunoensaio baseado em eletroforética capilar por causa da baixa amostra e reagente despesas, diminuída de processamento tempo quando comparado aos métodos tradicionais e alta compatibilidade para Automatize o procedimento4,15. Há um número de diferentes protocolos para a separação de proteínas que utilizaram capilares, incluindo polímero eletroforético, electrokinetic, peneirar e métodos isoelétrico que isolar proteínas pelas propriedades diferentes (respectivamente, carga eletrostática, equilíbrio de partição, peneirando Propriedades da matriz da separação e pH)16. Aqui, descrevemos um método de eletroforese capilar baseado em anticorpos (ou imunoensaio), usando um polímero peneirando a separação, que foi automatizada e comercialmente adotado3. As vantagens deste sistema incluem facilidade de uso e operação, padronizados e comercialmente disponíveis reagentes e medições confiáveis, sensíveis que exigem menos reagentes e amostras em comparação com ensaios de proteína tradicionais tais como borrão ocidental, ligado à enzima imunoensaio e outros formatos de4,3,5. Tem-se observado nas avaliações anteriores desta tecnologia que a escala do tamanho da proteína que pode ser avaliada tem sido limitada pela separação disponível matriz4, ofertas no entanto recentes têm expandido o mensurável variam de 2 a 440 kDa17 . Além disso, alguns buffers lisados são conhecidos por serem incompatíveis com o ensaio18, portanto seleção dos reagentes experimentais utilizado deve ser considerada antecipadamente.
Uma grande vantagem de um procedimento automatizado com componentes disponíveis comercialmente é a consistência dos resultados através de métodos padronizados e reagentes. Isso minimiza as chances de fracasso de ensaio, automatizando etapas críticas dentro do procedimento. No entanto, é importante notar que certas práticas devem ser respeitadas durante o protocolo para minimizar problemas com o imunoensaio baseado em eletroforética capilar. Em primeiro lugar, é fundamental que a mistura de luminol-S/peróxido é preparada fresco e imediatamente antes placa de carregamento. Sincronismo consistente irá resultar em luminescência consistente após o agente oxidante é adicionado, o que resultará em medições consistentes para um ensaio de anticorpo específico depois do ensaio. Além disso, é importante que os reagentes não-expirado são usados, que afeta principalmente a potência do agente oxidante. Além disso, é importante que a ordem de carregamento de amostras, anticorpos e outros reagentes ser rigorosamente seguidas (ver Figura 1). Qualquer reagente pipetado fora do lugar irá resultar em falha de ensaio e executar um desperdício.
Além desses passos críticos, principais questões experimentados com a técnica geralmente podem ser superados através de otimização. Com efeito, estas condições são específicas para cada combinação de sistema/anticorpo de modelo e, portanto, devem ser determinadas empiricamente para cada novo ensaio. Neste artigo, enfocamos três procedimentos comuns de otimização: tempo de exposição, titulação lisada e diluição do anticorpo primário. A capacidade de gerar resultados mensuráveis depende da análise de um tempo de exposição quando o substrato de luminol não é ser rapidamente esgotado, como resultado de depleção de substrato em perda de sinal. Lisado titulação determina a gama dinâmica linear de cada ensaio, que pode diferir com sistemas de modelo diferente, bem como anticorpos diferentes, mesmo para o mesmo destino de proteína. Diluições de anticorpo escolhidas em ou perto de saturar as concentrações garantir mudanças no sinal não serão afetadas por uma escassez de anticorpo livre, mas apenas por diferente quantidade de proteína disponível alvo epítopo. Outras considerações durante o processo de otimização podem incluir o tempo de incubação do anticorpo e empilhamento/amostra tempo de carregamento. Na maioria dos casos, as configurações padrão para o instrumento oferecem o melhor equilíbrio de resolução e sensibilidade. No entanto, em alguns casos, pobre resolução ou sensibilidade pode ser melhorada por ajustar esses parâmetros.
Capilar de imunoensaio eletroforética com base em métodos fornecem medições de proteína rápida, eficiente e reprodutível. Enquanto esses métodos têm sido utilizados principalmente em configurações de pesquisa e desenvolvimento, a coerência destas tecnologias tem potencial utilidade em aplicações clínicas e regulamentares. Por exemplo, a identificação de subpopulações sensíveis a tóxicos ambientais ou pacientes com progressão da doença pode basear-se nos biomarcadores de proteína medidos em matrizes acessíveis, como sangue, urina e saliva. Como reagente e queda de custos de operação e o número de amostras e alvos que podem ser avaliadas simultaneamente aumenta, provavelmente veremos métodos de imunoensaio baseado em eletroforética capilar usados para esses tipos de aplicativos.

Os imunoensaios electroforese capilares medem a expressão da proteína em lisados celulares usando sistemas de separação de tamanho ou carga e oferecem várias vantagens sobre os tradicionais imunoensaios. Por exemplo, quando comparado ao borrão ocidental, o procedimento automatizado baseado em capilar Elimina a necessidade de géis, dispositivos de transferência, e manual de lava. Além disso, a quantidade absoluta de proteína necessária é aproximadamente 10 vezes menor, tornando a sistemas baseados em capilar ideal para uso com tipos de células raras ou amostra limitada1,2. Os resultados são obtidos em menos de 3 h, usando sistemas automatizados e anteriormente tenha sido demonstrados mais quantitativa e reprodutível do que ocidental convencional borre procedimentos3,4,5. O processo para ensaios baseados em tamanho consiste em carregar amostras contendo sulfato dodecyl de sódio (SDS), ditiotreitol (DTT) e fluorescente etiquetado marcadores de peso molecular em colunas capilares contendo matrizes de empilhamento e separação. Tensão aplicada aos capilares separa as proteínas nas amostras de acordo com o tamanho, e a luz UV imobiliza as proteínas separadas na parede capilar. O capilar é então imuno-sondado com alvos primário anticorpo e horseradish peroxidase (HRP)-anticorpo secundário conjugado. Luminol e peróxido de catalisam a geração de luz quimioluminescente que é medida por uma câmera do dispositivo acoplado (CCD) de carga e analisada para dosar proteínas.
Apesar da relativa facilidade e velocidade de uma plataforma automatizada baseada em capilar eletroforética imunoensaio, otimização das condições de ensaio, tais como a concentração de proteína, anticorpo diluição e tempo de exposição é importante para a obtenção de precisas, reprodutíveis resultados. Em geral, os procedimentos a seguir devem ser executados para otimizar um ensaio para estes sistemas:
1) uma tela deve ser realizada para avaliar e escolher os anticorpos para o sinal e especificidade para o destino de proteína. Se disponível, a proteína purificada ou epítopo alvo pode ser usado para avaliar a especificidade; no entanto, ainda é importante avaliar o potencial sinal específico em proteínas totais provenientes do sistema de modelo.
2) em seguida, a gama dinâmica do ensaio precisa ser determinado. Em uma situação ideal, duplicação de sinal (medido usando a área do pico) é observada como a concentração da amostra é duplicada; no entanto, na prática, uma mudança proporcional no sinal de entrada de forma previsível (por exemplo, linear caber) é suficiente para quantificação de proteína. Além disso, essa otimização irá definir a concentração de proteína com sinal elevado, mas ainda dentro da escala linear para o modelo experimental.
3) determine a concentração de anticorpo usando a concentração de proteína fixo escolhida na etapa de otimização 2. À medida que aumenta a concentração de anticorpos, o sinal aumenta até que platôs na saturação. Uma concentração de anticorpo perto deste nível de saturação é necessária para a medição da concentração da proteína.
O processo usado para otimizar as concentrações de proteína, diluições de anticorpo e tempos de exposição para um ensaio de automatizado baseado em capilar tamanho6 é demonstrado utilizando extratos de células inteiras isolados de BEAS-2B, um humano transformado SV-40 brônquico linhagem de células epiteliais. Isolamento da proteína de extratos de células ou tecidos pode ser realizado usando um número de protocolos publicados7,8,9 e não será coberto aqui. Resultados de um experimento experimental usando as condições otimizadas são também relatados para total e fosforilados (serina 15, serina 20) p53 em culturas expostos a doxorrubicina (um comum agente quimioterapêutico que induz a apoptose de células10) em 1.2, 1.8, e mídia de 2,4 µ g/mL para 4 h antes da colheita. As áreas de pico de p53 são normalizadas para ɑ-tubulina, que é usado como um controle de carregamento.

<table><tbody><tr><td>Instrumento Wes</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td> <td>004-600</td><td></td></tr><tr><td>P53 DO-1 anticorpo primário</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>p53 fosforilado (ser 15) anticorpo primário</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9286</td><td></td></tr><tr><td>p53 fosforilado (ser 20) anticorpo primário</td> Tecnologia <td>de sinalização celular</td><td>9287</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo primário alfa-tubulina</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>3873</td><td>usado como controle de carga</td></tr><tr><td>Bússola Software</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)</td><td></td><td>fornecido com o kit mestre Wes</td></tr><tr><td>12-230 kDa</td><td>ProteinSimple (Santa Clara, CA)&nbsp;</td><td>PS MK02 (desde que substituído por um novo kit #)</td><td></td></tr><tr><td></td><td>www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html</td><td>INCLUI PART NO: Tampão de Lavagem (60 mL) 042-202 10X Tampão de Amostra (440 &mu; L) 042-195 Microplacas Pré-Preenchidas (8) PS-PP01 Cartuchos Capilares (8) PS-CC01 Diluente de Anticorpo II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1,5 mL) 042-233 Peróxido (1,5 mL) 042-234 Estreptavidin-HRP (132 &mu; L) 042-414 Pacote Padrão (8): Escada biotinilada, master mix fluorescente 5X, TDT e tubo vazio de 0,6 mL PS-ST01 Anticorpo Secundário Anti-Coelho 042-206 ou Anticorpo Secundário Anti-Camundongo 042-205</td><td></td></tr><tr><td>Nome&nbsp; </td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Cultura celular, tratamento e colheita (usando protocolos recomendados pelo fornecedor; protocolos não incluídos no manuscrito)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células BEAS-2B</td><td>American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>meio de crescimento de queratinócitos, KGM Gold</td><td>Lonza Ltd (Basileia, Suíça</td><td>)192152</td><td>para cultura de células</td></tr><tr><td>meio basal de queratinócitos, KBM Gold</td><td>Lonza Ltd (Basileia, Suíça)</td><td>192151</td><td>meio livre de soro para dosagem química</td></tr><tr>de<td>doxorrubicina</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>D1515</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Bradford Assays</td><td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>23200</td><td>para quantificação de proteínas</td></tr><tr><td>Kit de Extrato Nuclear</td><td>Active Motif (Carlsbad, CA)</td><td>D1515</td><td>usado para preparar lisados</td></tr><tr><td></td><td></td> de células <td>inteiras INCLUI:</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Tampão de Lise AM1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1M ditiotreitol (DTT)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Inibidor de Protease Coquetel</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>10X PBS& nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Inibidores da</td><td></td> fosfatase</tr></tbody></table>

procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

Novas tecnologias que utilizam os imunoensaios baseados em capilar prometem avaliação mais rápida e mais quantitativa de proteínas em comparação com os imunoensaios tradicionais. No entanto, semelhante a outros ensaios de proteína baseada em anticorpos, otimização dos parâmetros de imunoensaio baseado no capilar, tais como a concentração de proteína, anticorpo diluição e tempo de exposição é um requisito importante para a geração de significativos e confiáveis dados. Medições devem cair dentro da escala linear do ensaio onde as alterações no sinal são diretamente proporcionais às mudanças na concentração de lisado. O processo de escolha de concentrações adequadas de lisado, diluições de anticorpo e tempos de exposição na linha de células epiteliais brônquicas humanas, BEAS-2B, é demonstrado aqui. Ensaio de linearidade é mostrada em um intervalo de concentrações de proteína de extrato celular com anticorpos p53 e α-tubulina. Um exemplo de burnout sinal é visto as concentrações mais elevadas com longos tempos de exposição, e uma curva de diluição do anticorpo de α-tubulina é mostrada demonstrando a saturação. Além disso, resultados experimentais de exemplo são relatados para células tratados com doxorrubicina usando parâmetros otimizados.

Tempo de exposição - Neutralização de sinal de determinação
Neutralização de sinal pode ocorrer quando o substrato de luminol e peróxido é esgotado muito rapidamente. Isto pode ser determinado examinando-se os dados em tempos de exposição diferentes de quimioluminescência. O software de análise, vá para "Editar – &#62; análise – &#62; imagens". As exposições variam de 5 a 480 s. O eixo y em um electroferograma relata sinal/hora, assim que os dados de cada exposição devem ter um coeficiente de sinal/hora semelhante. Este coeficiente diminui com exposições sequencialmente mais longas se luminol torna-se empobrecido, como pode ser visto com o anticorpo DO-1 de p53 (Figura 2). Por causa da depleção de substrato, este ensaio pode ser considerado mensurável até a 0,2 µ g / µ l concentração somente em exposições de s o 5-30. Portanto, no presente exemplo, 15 s estava determinado a ser o tempo de exposição de análise de dados ideal para p53.
Lisado titulação - Determinar a gama dinâmica linear
É importante que medidas sejam tomadas dentro do intervalo dinâmico linear de cada ensaio, onde as alterações no sinal medido pela área do pico são proporcionais às mudanças na quantidade de proteína na amostra. Usando o tempo de exposição ideal dos 15 escolhidos s na seção anterior, o ensaio de linearidade é demonstrada para p53 e ɑ-tubulina sobre maior do que um 15-fold intervalo de concentração (Figura 3). Em nossa experiência, um valor de2 R de &#62; 0.9 de uma regressão linear caber é considerado de aceitável para uma escala de diluição da proteína purificada de uma quantidade conhecida (se o ensaio é uma medida quantitativa absoluta) ou amostra a lisado de proteína alvo desconhecido (se ensaio é uma medida quantitativa relativa).
Otimização de diluição de anticorpo
Usando anticorpos em concentrações de impregnação ajuda a garantir que quaisquer alterações de sinal medidas são devidas somente às mudanças na quantidade de proteína. Como demonstração, duas linha de celular BEAS-2B toda célula extrai (0,2 µ g / µ l da proteína total carregado no ensaio) foram analisados com concentrações de anticorpos ɑ-tubulina serialmente diluída que variam de 01:25 - 1:800 (Figura 4). Sinal quimioluminescente (aqui, medida como a área do pico) foi plotada contra a diluição do anticorpo. Observou-se a saturação perto as 01:50 diluição onde a curva começa um platô perceptível.
Julgamento experimental - tratamento de doxorrubicina em células de BEAS-2B
Usando as condições de ensaio otimizado, cultura de células de BEAS-2B foi tratada com três diferentes concentrações de doxorrubicina (1.2, 1.8 e 2.4 µ g/mL) para 4h (Figura 5, tabela 1). Ativação de p53 através de modificações borne-translational Medeia diversas respostas celulares, incluindo a detenção do ciclo celular, senescência e apoptose12. Especificamente, a fosforilação da serina 15 tem sido atribuída a ativação transcricional de p53, resultando na apoptose depois de doxorrubicina tratamento13. Nesta demonstração, ɑ-tubulina normalizado pico áreas são apresentadas como dobra de controle. Curiosamente, 3.5 a 4-fold um aumento da fosforilação de p53 em serina aumentos de 15 e 2 vezes no nível de p53 phosphorylated em serina 20 foram observados após exposição de 4h a doxorrubicina. Estes resultados indicam que a ativação do p53; no entanto, nenhuma dose-resposta é visto para as concentrações escolhidas (por outro lado, a menor dose testada suscitou a resposta mais alta). P53 total não demonstrou uma resposta clara de tratamento neste sistema de modelo. Observamos anteriormente ativação da fosforilação de p53 na ausência de aumento dos níveis de p53 total em condições similares em zinco-Tratado de células 2B BEAS14.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3.jpg"> 
Figura 2 . Comparação de imagens de exposição para detectar o sinal de estresse. Lane exibições mostrar diminuindo as concentrações de proteína para BEAS-2B lysates sondado com p53 DO-1 anticorpo a uma diluição de 1: 500. Coeficientes de sinal de quimioluminescência, relatados como alturas ou no software do instrumento, são sobrepostos. Ao contrário as alturas, as intensidades de banda visual automaticamente são geradas e ajustadas pelo instrumento para auxiliar a visualização das bandas e são não comparável de um painel para outro. Note a diminuição do sinal de quimioluminescência aumentos de tempo de exposição, com o sinal começa a desaparecer (divisão pico) para as duas exposições mais longas, indicando depleção de substrato. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig2v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3.jpg"> 
Figura 3 . Lisada titulação mostrando os pontos de vista da pista. Lisado titulação mostrando a lane exibições (A) do lisado quando analisados com 1: 500 p53 DO-1 ou 01:50 ɑ-tubulina BEAS-2B. Ao contrário os valores de área do pico, as intensidades de banda visual são automaticamente geradas e ajustadas pelo instrumento para auxiliar a visualização das bandas e são não comparável de um painel para outro. Análise de regressão linear (B) confirma que os ensaios são lineares ao longo de toda a gama testada, de 0,01 a 0,20 µ g / µ l e 0,025 para 0,40 µ g / µ l, com valores de R2 de 0.999 e 0.985, respectivamente. As concentrações de proteína total no meio do intervalo linear foram escolhidas para acomodar variação de proteína alvo potencial em qualquer direção (por exemplo, 0,2 µ g / µ l para α-tubulina). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig3v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig4.jpg"> 
Figura 4 . Diluição de anticorpo α-tubulina curvas para dois separados BEAS-2B proteína lysates com e sem normalização da linha de base. Um definitivo Departture de linearidade é visto a 01:50 (0,02) diluição, indicando a saturação. 01:50, portanto, foi escolhida como a diluição ideal para este anticorpo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55911/55911fig5.jpg"> 
Figura 5. Efeito do tratamento com doxorrubicina (Glauce) 4h no total e serina fosforilado expressão de proteína p53 de células BEAS-2B. Áreas de pico são normalizadas para α-tubulina e plotadas como dobra de controle (CTL). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55911/55911tbl1.jpg"> 
Tabela 1. Efeito do tratamento com doxorrubicina (Glauce) 4h no total e serina fosforilado expressão de proteína p53 de células BEAS-2B. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55911/55911tbl1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a>

Um imunoensaio baseado no capilar, usando uma plataforma comercial para medir as proteínas alvo de preparações de proteína total é demonstrado. Além disso, o ensaio parâmetros de tempo de exposição, concentração de proteína e diluição de anticorpo são otimizados para um sistema de modelo de cultura de células.

Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um ensaio imunológico por eletroforese capilar utilizando uma plataforma comercial. Esta plataforma distinguirá e quantificará alvos proteicos a partir de uma amostra biológica que pode ser obtida de tecidos de cultivo celular e fluidos biológicos. O processo examina proteínas com base no tamanho, que variam de dois a 440 quilodaltons.A vantagem desse procedimento automatizado em relação aos procedimentos tradicionais, como o Western blot, é que os ensaios imunoenzimáticos eletroforéticos capilares eliminam a necessidade de géis, dispositivos de transferência e lavagens manuais. Além disso, a quantidade absoluta de proteína necessária é aproximadamente 10 vezes menor, tornando o procedimento ideal para tipos celulares raros ou amostras limitadas. Adicionalmente, os resultados são obtidos em até três horas utilizando sistemas automatizados e demonstraram ser mais quantitativos e reprodutíveis do que os procedimentos convencionais de Western blot.Prepare as amostras e os reagentes do kit, incluindo tampão de amostra, ditiotreitol, mistura mestra fluorescente e marcador biotinilado, conforme instruções do inserto do produto do fabricante. Prepare as amostras de proteína utilizando seu método preferido. Aqui, isolamos extrato de células inteiras de culturas celulares BEAS-2B.Dilua as amostras de proteína com o tampão amostra. Misture uma parte da mistura mestra fluorescente 5X com quatro partes da amostra diluída para atingir a concentração final desejada de proteína. Um exemplo de cálculo é mostrado para preparar 70 microlitros de concentração final de 0,2 micrograma por microlitro de proteína, partindo de uma concentração estoque de proteína de 1,2 microgramas por microlitro.A mistura mestra corresponde a 1/5 do volume total, neste caso, 14 microlitros. Para calcular o volume do estoque de proteína necessário, multiplique a concentração final desejada pelo volume total e divida pela concentração do estoque de proteína. Subtraia os volumes da mistura mestra e do estoque do volume total para calcular o volume do tampão amostral.Desnaturar as amostras e a escada preparadas aquecendo a 95 graus centígrados por cinco minutos. Observe que algumas proteínas podem exigir condições de desnaturação mais suaves. Por exemplo, 70 graus por 10 minutos para prevenir agregação proteica e melhorar a migração.Considere esta opção se houver arraste acentuado nos pesos moleculares mais altos. Prepare as diluições desejadas do anticorpo no diluente fornecido. Observe que os anticorpos geralmente são usados em concentrações mais elevadas para imunoensaios baseados em capilaridade do que para o Western blot tradicional.Prepare uma mistura um para um de luminol e peróxido, sempre fresca, a cada uso. Pipete as amostras e os reagentes na placa do ensaio utilizando os volumes indicados no modelo. A codificação por cores representa o carregamento correto dos reagentes e amostras na placa do ensaio.Pipete a escada biotinilada para o poço A1 e as amostras preparadas para os poços A2 a A25. Adicione o diluente de anticorpo fornecido aos poços B1 a B25 e ao poço C1. Adicione o anticorpo primário aos poços C2 a C25. Adicione a estreptavidina HRP ao poço D1. Adicione o anticorpo secundário aos poços D2 a D25.Adicione a mistura de luminol-peróxido aos poços E1 a E25. Adicione tampão de lavagem às três primeiras linhas dos poços maiores do centro da placa. Ligue o instrumento de imunoensaio por capilaridade e abra o software correspondente.Carregue o cartucho capilar e a placa de ensaio na máquina de acordo com as instruções do fabricante e inicie a corrida. Quando a corrida for concluída, verifique se os padrões fluorescentes foram corretamente identificados e corrija, se necessário. Além disso, confirme se a escada biotinilada apresenta os picos de dimensionamento corretos para o kit utilizado.Consulte o guia de referência rápida ou o manual do produto do fabricante para obter mais detalhes. A otimização das condições do ensaio, como tempo de exposição, concentração de proteína e diluição de anticorpos, é importante para obter resultados precisos e reprodutíveis. Essas condições são específicas para cada combinação de sistema modelo e anticorpo e, portanto, devem ser determinadas empiricamente para cada novo ensaio.A capacidade de gerar resultados quantitativos depende da análise de um tempo de exposição no qual o substrato luminol não esteja sendo rapidamente esgotado, pois o esgotamento do substrato resulta na perda do sinal ou na queima do sinal. Isso pode ser determinado examinando os dados em diferentes tempos de exposição à quimioluminescência, conforme mostrado na figura dois. As exposições com o instrumento utilizado variaram de cinco a 480 segundos.As imagens das pistas mostraram concentrações decrescentes de proteína para extratos de BEAS-2B sondados com o anticorpo p53 DO-1 em uma diluição de um para 500. Os coeficientes do sinal quimioluminescente, relatados como alturas de pico no software do instrumento, estão sobrepostos. As intensidades das bandas visuais são ajustadas automaticamente pelo instrumento e não são comparáveis entre um painel e outro.O coeficiente do sinal diminui com exposições sequencialmente mais longas se o luminol se esgotar, como visto aqui. O sinal começa a desaparecer e o pico se divide nas duas exposições mais longas. Por causa disso, um tempo de exposição curto de 15 segundos foi escolhido para a análise dos dados.A quantidade total de proteína aplicada também deve ser otimizada para cada ensaio e sistema modelo específico. Para avaliação quantitativa, as medições devem ser realizadas dentro da faixa dinâmica linear de cada ensaio. Em que as alterações no sinal, medidas pela área do pico, são proporcionais às alterações na quantidade de proteína na amostra.A titulação do lisado mostra as imagens das pistas do lisado de BEAS-2B quando incubado com anticorpo p53 DO-1 na proporção de um para 500 ou com anticorpo alpha-Tubulina na proporção de um para 50. A análise de regressão linear confirma que os ensaios são lineares em toda a faixa testada. As concentrações totais de proteína no centro da faixa linear foram escolhidas para acomodar variações potenciais da proteína-alvo em qualquer direção.Como consideração final de otimização, deve-se avaliar a diluição adequada do anticorpo primário. O uso de anticorpos em concentrações saturantes ajuda a garantir que quaisquer alterações no sinal medidas se devam unicamente a mudanças na quantidade de proteína. Duas amostras de proteína BEAS-2B, representadas pelos pontos azuis e laranjas, foram incubadas com anticorpo contra alfa-Tubulina em diluições seriadas.O sinal de quimioluminescência, medido como área do pico, foi representado graficamente em função da diluição do anticorpo. Observou-se saturação próxima à diluição de um para 50, onde a curva começa a apresentar um platô acentuado. Assim, a diluição de um para 50 foi escolhida como a diluição ideal para este anticorpo.Após assistir a este vídeo, você deverá sentir-se seguro ao preparar amostras, carregar amostras e executar análises no instrumento de imunoensaio baseado em capilares ProteinSimple Wes. Uma vez que você domine este procedimento, toda a corrida poderá ser realizada em três horas com 25 amostras. Ao analisar uma corrida, é importante realizar controle de qualidade para cada capilar e amostra.Isso inclui a verificação de padrões fluorescentes em uma escada biotinilada. Se os picos forem identificados incorretamente, o software de análise deve ser usado principalmente para identificar os picos corretos e eliminar os picos identificados incorretamente. Como em todas as técnicas de biologia molecular no laboratório, use os equipamentos de proteção individual adequados para proteger a si mesmo e às suas amostras.Isso inclui jaleco de laboratório, luvas, óculos de proteção e calçados fechados. É importante ter em mente que a otimização deve ser realizada para cada novo alvo que for medido ou quando diferentes fontes de amostras forem utilizadas. Os passos de validação e acompanhamento incluem a avaliação da especificidade do anticorpo e do sinal utilizando proteína purificada ou epítopo.Testando a faixa dinâmica do ensaio utilizando uma série de diluições da amostra e otimizando a diluição do anticorpo mediante avaliação da saturação do sinal em uma faixa de concentração de anticorpo. Uma vez otimizado, este procedimento imunológico capilar deve fornecer um método mais rápido e mais quantitativo para medir a proteína-alvo em amostras biológicas, em comparação com métodos tradicionais como o Western blot.

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Research

JoVE Journal

Biology

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