Procedimento e estratégias de otimização de chave para um método automatizado capilar imunoensaio eletroforética com base em

Um imunoensaio baseado no capilar, usando uma plataforma comercial para medir as proteínas alvo de preparações de proteína total é demonstrado. Além disso, o ensaio parâmetros de tempo de exposição, concentração de proteína e diluição de anticorpo são otimizados para um sistema de modelo de cultura de células.

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um imunoensaio de eletroforese capilar usando uma plataforma comercial. Esta plataforma distinguirá e quantificará alvos de proteínas de uma amostra biológica que pode ser obtida de tecidos de cultura de células e biofluidos. O processo examina proteínas com base no tamanho que varia de dois a 440 quilodaltons.

A vantagem desse procedimento automatizado em relação aos procedimentos tradicionais, como um Western blot, é que os imunoensaios eletroforéticos capilares eliminam a necessidade de géis, dispositivos de transferência e lavagens manuais. Além disso, a quantidade absoluta de proteína necessária é aproximadamente 10 vezes menor, tornando o procedimento ideal para tipos de células raras ou amostras limitadas. Além disso, os resultados são obtidos em menos de três horas usando sistemas automatizados e demonstraram ser mais quantitativos e reprodutíveis do que os procedimentos convencionais de Western blot.

Prepare as amostras e reagentes do kit, incluindo tampão de amostra, ditiotreitol, master mix fluorescente e escada biotinilada de acordo com a bula do produto do fabricante. Prepare as amostras de proteína usando seu método favorito. Aqui, isolamos o extrato de células inteiras de culturas de células BEAS-2B.

Diluir as amostras de proteínas com tampão de amostra. Misture uma parte de mistura principal fluorescente de cinco X com quatro partes de amostra diluída para atingir a concentração final de proteína desejada. Um exemplo de cálculo é mostrado para fazer 70 microlitros de 0,2 micrograma por microlitro de concentração final de proteína, começando com uma concentração de estoque de proteína de 1,2 micrograma por microlitro.

A mistura master é 1/5 do volume total, neste caso, 14 microlitros. Para calcular o volume de estoque de proteína necessário, multiplique a concentração final desejada pelo volume total e divida pela concentração de estoque de proteína. Subtraia o master mix e os volumes de estoque do volume total para calcular o volume do buffer de amostra.

Desnature as amostras preparadas e escada aquecendo a 95 graus centígrados por cinco minutos. Observe que algumas proteínas podem exigir condições de desnaturação mais suaves. Por exemplo, 70 graus por 10 minutos para evitar a agregação de proteínas e melhorar a migração.

Considere esta opção se houver manchas pesadas nos pesos moleculares mais altos. Prepare as diluições de anticorpos desejadas no diluente fornecido. Observe que os anticorpos são geralmente usados em concentrações mais altas para imunoensaio capilar do que para Western blotting tradicional.

Prepare uma mistura individual de luminol e peróxido fresco a cada uso. Pipetar as amostras e os reagentes para a placa de ensaio, utilizando os volumes indicados no modelo. O código de cores representa o carregamento adequado de reagentes e amostras para a placa de ensaio.

Pipeta de escada biotinilada para o poço A1, amostras preparadas para os poços A2 a A25. O diluente de anticorpos fornecido para os poços B1 a B25 e C1. Anticorpo primário para os poços C2 a C25. Estreptavidina HRP para o poço D1. Anticorpo secundário para os poços D2 a D25.

E mistura de peróxido de luminol para os poços E1 a E25. Adicione tampão de lavagem às três primeiras fileiras dos poços maiores da placa intermediária. Ligue o instrumento de imunoensaio capilar e abra o software que o acompanha.

Carregue o cartucho capilar e a placa de ensaio na máquina de acordo com as instruções do fabricante e inicie a execução. Quando a execução estiver concluída, verifique se os padrões fluorescentes estão corretamente identificados e corrija se necessário. Além disso, verifique se a escada biotinilada mostra os picos de dimensionamento corretos para o kit usado.

Consulte o guia de referência rápida do fabricante ou o manual do produto para obter mais detalhes. A otimização das condições do ensaio, como tempo de exposição, concentração de proteínas e diluição de anticorpos, é importante para obter resultados precisos e reprodutíveis. Essas condições são específicas para cada combinação de anticorpos do sistema modelo e, portanto, devem ser determinadas empiricamente para cada novo ensaio.

A capacidade de gerar resultados quantitativos depende da análise de um tempo de exposição no qual o substrato de luminol não está sendo rapidamente esgotado, pois o esgotamento do substrato resulta em perda de sinal ou esgotamento do sinal. Isso pode ser determinado examinando os dados em diferentes tempos de exposição à quimioluminescência, conforme mostrado na figura dois. As exposições com o instrumento utilizado variaram de cinco a 480 segundos.

As visualizações de pista mostraram concentrações decrescentes de proteínas para extratos BEAS-2B sondados com anticorpo p53 DO-1 em uma diluição de um a 500. Os coeficientes de sinal de quimioluminescência relatados como alturas de pico no software do instrumento são sobrepostos. As intensidades das bandas visuais são ajustadas automaticamente pelo instrumento e não são comparáveis de um painel para outro.

O coeficiente de sinal diminui com exposições sequencialmente mais longas se o luminol se esgotar, como visto aqui. O sinal começa a desaparecer e o pico se divide nas duas exposições mais longas. Por isso, optou-se por um curto tempo de exposição de 15 segundos para a análise dos dados.

A entrada total de proteínas também deve ser otimizada para cada ensaio específico e sistema modelo. Para avaliação quantitativa, as medições devem ser feitas dentro da faixa dinâmica linear de cada ensaio. Onde as mudanças no sinal, medidas pela área do pico, são proporcionais às mudanças na quantidade de proteína na amostra.

A titulação do lisado mostra as vistas da pista do lisado BEAS-2B quando sondado com um a 500 p53 DO-1 ou um a 50 anticorpo alfa-tubulina. A análise de regressão linear confirma que os ensaios são lineares em toda a faixa testada. As concentrações totais de proteína no meio da faixa linear foram escolhidas para acomodar a variação potencial da proteína-alvo em qualquer direção.

Como consideração final de otimização, a diluição adequada do anticorpo primário deve ser avaliada. O uso de anticorpos em concentrações de suturação ajuda a garantir que quaisquer alterações de sinal medidas sejam devidas apenas a mudanças na quantidade de proteína. Duas amostras de proteína BEAS-2B, representadas pelos pontos azuis e laranja, foram sondadas com anticorpo alfa-tubulina diluído em série.

O sinal de quimioluminescência, medido como área de pico, foi plotado em relação à diluição de anticorpos. A saturação foi observada perto da diluição de um a 50, onde a curva inicia um platô perceptível. Um a 50 foi, portanto, escolhido como a diluição ideal para este anticorpo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve se sentir confortável para preparar amostras, carregar amostras e executar análises no instrumento de imunoensaio baseado em capilar ProteinSimple Wes. Depois de dominar este procedimento, toda a execução pode ser realizada em três horas com 25 amostras. Ao analisar uma corrida, é importante realizar o controle de qualidade para cada capilar e amostra.

Isso inclui a verificação de padrões fluorescentes em uma escada biotinilada. Se os picos forem identificados incorretamente, o software de análise deve ser usado principalmente para identificar picos corretos e eliminar picos identificados incorretamente. Como acontece com todas as técnicas de biologia molecular no laboratório, use equipamento de proteção individual adequado para proteger você e suas amostras.

Isso inclui jaleco, luvas, óculos de segurança e sapatos fechados. É importante ter em mente que a otimização deve ser realizada para cada novo alvo medido ou quando diferentes fontes de amostra são usadas. As etapas de validação e acompanhamento incluem a avaliação da especificidade e do sinal do anticorpo usando proteína ou epítopo purificado.

Testar a faixa dinâmica do ensaio usando uma série de diluições de amostra e otimizar a diluição de anticorpos avaliando a saturação do sinal em uma faixa de concentração de anticorpos. Uma vez otimizado, este procedimento imunológico capilar deve fornecer um método mais rápido e quantitativo de medir a proteína-alvo de amostras biológicas em comparação com os métodos tradicionais, como o Western blot.