Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

O objetivo geral desta técnica de citometria espectral é distinguir diferentes fluorocromos usando todos os seus espectros de emissões. Além disso, este protocolo permite a implementação da autofluorescência como um parâmetro independente, permitindo uma análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia e do desenvolvimento da biologia de células-tronco, como identificar populações de células raras.

A principal vantagem desta técnica é sua capacidade única de analisar simultaneamente um grande número de parâmetros e gerenciar a autofluorescência de tecidos sólidos. Embora esse método seja usado para a preparação de uma suspensão de célula única derivada do intestino e do coração, ele também pode ser aplicado a outros órgãos, como pulmão, esqueleto, músculo, fígado, gordura e rim. Para começar, isole e lave o intestino delgado de um camundongo adulto.

Em seguida, coloque o lenço sobre uma toalha de papel e, usando uma tesoura afiada, remova cuidadosamente os adesivos de Peyer. Abra o intestino cortando-o longitudinalmente e divida-o em pedaços de um centímetro. Em seguida, transfira o tecido para um béquer cheio de 30 mililitros de HBSS suplementado com dez por cento de FCS e incube-o a 37 graus Celsius com agitação constante por 30 minutos.

Quando a incubação estiver concluída, transfira a suspensão celular para um tubo de plástico de 15 mililitros e agite-a vigorosamente por cinco minutos. Em seguida, incube a suspensão no gelo por dez minutos para permitir que fragmentos grandes e não dissociados sedimentem. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo e gire as células a 120 vezes G por sete minutos.

Uma vez peletizadas, suspendemos as células em dez mililitros de um por cento FCS em HBSS e as contamos usando uma câmara de Neubauer. Antes da coloração celular, transfira uma vez dez para as sextas células intestinais para um tubo de cinco mililitros para preparar um controle negativo. Para preparar uma amostra, adicione uma vez dez ao sexto das células intestinais, seguido por dois mililitros de HBSS com um por cento de FCS a um novo tubo de cinco mililitros e centrifugue a suspensão a 120 vezes G, a quatro graus Celsius, por cinco minutos.

Após descartar o sobrenadante, suspendemos as células em 50 microlitros da solução de anticorpos. Enrole o tubo de papel alumínio e incube as células a quatro graus Celsius por 20 minutos. Quando a incubação estiver concluída, adicione dois mililitros de um por cento FCS em HBSS à amostra e centrifugue-a a 120 vezes G, quatro graus Celsius, por cinco minutos.

Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 microlitros de 0,5 microgramas por mililitros de solução de iodeto de propídio. Depois de decapitar um embrião de camundongo, mergulhe seu corpo em uma placa de Petri, forrada com uma toalha de papel pré-molhada e preenchida com 50 mililitros de um por cento de FCS em HBSS. Sob um estereomicroscópio, faça uma incisão no lado direito do tórax do embrião e abra cuidadosamente o tórax, evitando danificar o coração.

Pegue os grandes vasos e retire o coração conectado aos pulmões e ao timo. Transfira os órgãos para uma placa de Petri de 35 mililitros preenchida com dois mililitros de um por cento de FCS em HBSS. Em seguida, isole o coração dos órgãos circundantes e do tecido conjuntivo.

Depois de lavar o coração, mergulhe-o em um mililitro de solução enzimática pré-aquecida e, usando uma pinça fina e um bisturi, pique o órgão em pedaços de um milímetro cúbico sob um estereomicroscópio. Adicione mais um mililitro de solução enzimática pré-aquecida e transfira o tecido fragmentado para um tubo tampado de cinco mililitros. Incubar a amostra na posição horizontal a 37 graus Celsius durante 15 minutos.

Uma vez concluída a incubação, homogeneizar o tecido por pipetagem repetitiva da suspensão com uma pipeta P1000. Em seguida, coloque as amostras, posicionadas verticalmente, de lado até que os fragmentos dos tecidos não digeridos sedimentem. Transfira o sobrenadante para um tubo de 50 mililitros.

Adicione dois mililitros de dez por cento de FCS em HBSS e mantenha as células isoladas no gelo. Em seguida, adicione dois mililitros de solução enzimática pré-aquecida ao tubo de cinco mililitros contendo o sedimento do tecido não digerido e continue a digerir o tecido como mostrado anteriormente até que nenhum tecido remanescente seja observado. Centrifugar a suspensão celular obtida a 120 vezes G durante dez minutos.

Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de um por cento de FCS em HBSS, livre de cátions de cálcio e magnésio. Para corar as células cardíacas, transfira 200 microlitros da suspensão celular para poços de uma placa redonda de fundo de 96 poços. Centrifugar a placa a 480 vezes G durante um minuto e rejeitar o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda as células cardíacas em 100 microlitros da solução de anticorpos. Embrulhe o prato em papel alumínio e incube-o a quatro graus Celsius por 20 minutos. Uma vez concluída a incubação, lave as células cardíacas com 200 microlitros de um por cento de FCS em HBSS livre de cálcio e magnésio e centrifugue a suspensão a 480 vezes G por um minuto.

Em seguida, ressuspenda as células em 200 microlitros de um por cento de FCS em HBSS livre de íons de cálcio e magnésio e transfira a suspensão para um tubo de cinco mililitros pré-preenchido com 200 microlitros de um por cento de FCS em HBSS livre de cálcio e magnésio. Finalmente, adicione 400 microlitros de um por cento de FCS em HBSS livre de cátions de cálcio e magnésio, contendo 0,5 microgramas por mililitro de iodeto de propídio e filtre a suspensão celular através de uma malha de 70 micro nylon. Para visualizar as células, carregue a amostra corada em uma citometria de fluxo e clique em visualizar, depois registre até duas vezes dez elevado ao sexto evento na amostra clicando em adquirir.

Na guia de análise, abra a janela da paleta de cores e registre todos os parâmetros estudados adicionando o fluorocromo junto com seu marcador correspondente. Certifique-se de incluir parâmetros de autofluorescência e viabilidade. Na janela de controle, dentro da lista de tubos, analise a primeira amostra corada única contendo grânulos de compensação.

Em seguida, na planilha, clique na ferramenta de design de polígonos e coloque a população de contas no gráfico FSC SSC. Clique duas vezes no portão para criar um gráfico filho das contas fechadas. E então gate contas positivas e negativas separadamente.

Verificar a população filha selecionada por meio de sucessivos bloqueios e eliminação de outliers em cada fração positiva e negativa. Em seguida, carregue as portas negativas e positivas na janela de desmistura. Em seguida, selecione a amostra de célula não corada na lista de tubos e projete portas separadas para células autofluorescentes e não autofluorescentes.

Uma vez que as portas negativas e positivas são definidas para todos os parâmetros, incluindo autofluorescência e viabilidade, clique em calcular. Em seguida, aplique a desmistura nas amostras analisadas. Para analisar os dados, coloque as células em um gráfico de SSC versus FSC e exclua as células mortas coradas com iodeto de propídio.

Finalmente, determine os portões para todas as populações de interesse. Aqui são apresentados os resultados das análises de citometria de fluxo e citometria espectral das células isoladas do coração fetal e coradas com anticorpos anti-TER119, anti-CD45 e anti-Sca-1. Um subconjunto de células de autofluorescência foi detectado por dois citômetros convencionais, enquanto na citometria espectral essas células não foram definidas como autofluorescentes e foram incluídas na população CD45 TER119 negativa.

As células identificadas por citometria de fluxo convencional como autofluorescentes, mas não células CD31 positivas, foram então analisadas quanto à expressão dos transcritos específicos dos cardiomiócitos. Altos níveis de troponina cardíaca e miócitos atriais como transcritos de trem foram encontrados na população de células autofluorescentes, confirmando que um grande subconjunto de miócitos cardiovasculares é perdido na citometria de fluxo convencional. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente oito horas, se for pré-executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todas as etapas devem ser realizadas no gelo e em tempo hábil para garantir que as células permaneçam viáveis. Após esses procedimentos, proteínas intracelulares e análises de marcadores de superfície adicionais podem ser pré-formadas para responder a perguntas sobre vias moleculares específicas. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia e biologia do desenvolvimento ou células-tronco explorarem e isolarem populações raras de diferentes órgãos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e corar células de tecidos celulares e como analisar a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo espectral que supera as limitações resultantes da autofluorescência celular. Não se esqueça de que trabalhar com iodeto de propídio pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de EPI devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.