Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

O objetivo geral dessa técnica de citometria espectral é distinguir diferentes fluorocromos utilizando seus espectros completos de emissão. Além disso, este protocolo permite a implementação da autofluorescência como um parâmetro independente, possibilitando uma análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de imunologia e desenvolvimento da biologia de células-tronco, como, por exemplo, como identificar populações celulares raras.

A principal vantagem desta técnica é sua capacidade única de analisar simultaneamente um grande número de parâmetros e de gerenciar a autofluorescência de tecidos sólidos. Embora este método seja usado para o preparo de uma suspensão de células únicas derivadas do intestino e do coração, ele também pode ser aplicado a outros órgãos, como pulmão, músculo esquelético, fígado, gordura e rim. Para começar, isole e lave o intestino delgado de um camundongo adulto.

Em seguida, coloque o tecido sobre uma toalha de papel e, com tesoura afiada, remova cuidadosamente as placas de Peyer. Abra o intestino cortando-o longitudinalmente e divida-o em pedaços de um centímetro. Em seguida, transfira o tecido para um béquer contendo 30 mililitros de HBSS suplementado com dez por cento de FCS e incube a 37 graus Celsius com agitação constante durante 30 minutos.

Após a conclusão da incubação, transfira a suspensão celular para um tubo plástico de 15 mililitros e vortexe vigorosamente por cinco minutos. Em seguida, incube a suspensão em gelo por dez minutos para permitir que fragmentos grandes, não dissociados, sedimentem. Posteriormente, transfira o sobrenadante para um novo tubo e centrifugue as células a 120 vezes G por sete minutos.

Uma vez pelotizadas, suspendemos as células em dez mililitros de FCS a um por cento em HBSS e as contamos utilizando uma câmara de Neubauer. Antes da coloração celular, transfira um vezes dez à sexta potência de células intestinais para um tubo de cinco mililitros para preparar um controle negativo. Para preparar uma amostra, adicione um vezes dez à sexta potência de células intestinais, seguido de dois mililitros de HBSS com um por cento de FCS, a um novo tubo de cinco mililitros e centrifugue a suspensão a 120 ×g, a quatro graus Celsius, por cinco minutos.

Após descartar o sobrenatante, suspendemos as células em 50 microlitros da solução de anticorpos. Envolva o tubo com papel alumínio e incube as células a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a conclusão da incubação, adicione dois mililitros de FCS a um por cento em HBSS à amostra e centrifugue-a a 120 vezes G, a quatro graus Celsius, por cinco minutos.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 microlitros de solução de iodeto de propídio a 0,5 microgramas por mililitro. Após decapitar um embrião de camundongo, mergulhe seu corpo em uma placa de Petri, forrada com uma toalha de papel pré-umedecida e contendo 50 mililitros de HBSS com 1% de FCS. Sob um estereomicroscópio, faça uma incisão no lado direito do tórax do embrião e abra cuidadosamente a cavidade torácica, evitando danificar o coração.

Segure os grandes vasos e retire o coração conectado aos pulmões e ao timo. Transfira os órgãos para uma placa de Petri de 35 mililitros contendo dois mililitros de FCS a um por cento em HBSS. Em seguida, isole o coração dos órgãos circundantes e do tecido conjuntivo.

Após lavar o coração, mergulhe-o em um mililitro de solução enzimática pré-aquecida e, utilizando pinça fina e bisturi, pique o órgão em pedaços de um milímetro cúbico sob um estereomicroscópio. Adicione mais um mililitro de solução enzimática pré-aquecida e transfira o tecido fragmentado para um tubo de cinco mililitros com tampa. Incube a amostra em posição horizontal a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Após a conclusão da incubação, homogeneíze o tecido por pipetagem repetitiva da suspensão com uma pipeta P1000. Em seguida, deixe as amostras, posicionadas verticalmente, em repouso até que os fragmentos de tecido não digerido sedimentem. Transfira o sobrenadante para um tubo de 50 mililitros.

Adicione dois mililitros de FCS a dez por cento em HBSS e mantenha as células isoladas em gelo. Em seguida, adicione dois mililitros da solução enzimática pré-aquecida ao tubo de cinco mililitros contendo o sedimento do tecido não digerido e continue a digestão do tecido conforme mostrado anteriormente até que nenhum tecido remanescente seja observado. Centrifugue a suspensão celular obtida a 120 vezes G durante dez minutos.

Em seguida, despreze o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de FCS a um por cento em HBSS, livre de cátions cálcio e magnésio. Para corar as células cardíacas, transfira 200 microlitros da suspensão celular para poços de uma placa de 96 poços com fundo redondo. Centrifugue a placa a 480 vezes G durante um minuto e despreze o sobrenadante.

Em seguida, re-suspenda as células cardíacas em 100 microlitros da solução de anticorpo. Envolva a placa com papel alumínio e incube-a a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a conclusão da incubação, lave as células cardíacas com 200 microlitros de FCS a um por cento em HBSS sem cálcio e magnésio, e centrifugue a suspensão a 480 ×g por um minuto.

Em seguida, ressuspenda as células em 200 microlitros de FCS a um por cento em HBSS livre de íons cálcio e magnésio e transfira a suspensão para um tubo de cinco mililitros previamente preenchido com 200 microlitros de FCS a um por cento em HBSS sem cálcio e magnésio. Por fim, adicione 400 microlitros de FCS a um por cento em HBSS livre de cátions cálcio e magnésio, contendo 0,5 microgramas por mililitro de iodeto de propídio e filtre a suspensão celular através de uma malha de náilon de 70 micro. Para visualizar as células, carregue a amostra corada em um citômetro de fluxo e clique em visualização, depois registre até duas vezes dez à sexta potência eventos na amostra ao clicar em adquirir.

No separador de análise, abra a janela de paleta de cores e registre todos os parâmetros estudados adicionando o fluorocromo juntamente com o marcador correspondente. Certifique-se de incluir os parâmetros de autofluorescência e viabilidade. Na janela de controle, dentro da lista de tubos, analise a primeira amostra simplesmente corada contendo microesferas de compensação.

Em seguida, na planilha, clique na ferramenta de desenho de polígono e delimite a população de microesferas no gráfico FSC SSC. Dê um duplo clique na região delimitada para criar um gráfico derivado das microesferas selecionadas. E então delimite as microesferas positivas e negativas separadamente.

Verifique a população filha selecionada por meio de graduação sucessiva e eliminação de valores aberrantes em cada fração positiva e negativa. Em seguida, faça o upload das portas negativas e positivas na janela de separação. Depois, selecione a amostra de células não coradas na lista de tubos e crie portas separadas para células autofluorescentes e não autofluorescentes.

Uma vez definidos os limites negativos e positivos para todos os parâmetros, incluindo autofluorescência e viabilidade, clique em calcular. Em seguida, aplique a separação de misturas nas amostras analisadas. Para analisar os dados, delimite as células em um gráfico de SSC versus FSC e exclua as células mortas coradas com iodeto de propídio.

Por fim, determine as portas para todas as populações de interesse. Apresentam-se aqui os resultados das análises de citometria de fluxo e citometria espectral das células isoladas do coração fetal e marcadas com os anticorpos anti-TER119, anti-CD45 e anti-Sca-1. Um subconjunto de células autofluorescentes foi detectado por dois citômetros convencionais, enquanto na citometria espectral essas células não foram definidas como autofluorescentes e foram incluídas na população negativa para CD45 e TER119.

As células identificadas por citometria de fluxo convencional como autofluorescentes, mas não positivas para CD31, foram então analisadas quanto à expressão de transcritos específicos de cardiomiócitos. Foram encontrados altos níveis de troponina cardíaca e transcritos semelhantes aos de miócitos atriais na população de células autofluorescentes, confirmando que um grande subconjunto de cardiomiócitos é perdido na citometria de fluxo convencional. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente oito horas, se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que todas as etapas devem ser realizadas em gelo e de maneira rápida para garantir que as células permaneçam viáveis. Após este procedimento, proteínas intracelulares e análises de marcadores superficiais adicionais podem ser realizadas com o objetivo de responder perguntas sobre vias moleculares específicas. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de imunologia e biologia do desenvolvimento ou de células-tronco explorarem e isolarem populações raras de diferentes órgãos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e corar células de tecidos celulares e como analisar a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo espectral, que supera as limitações decorrentes da autofluorescência celular. Não se esqueça de que o trabalho com iodeto de propídio pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de EPI, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.