Name: Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda citometria de fluxo espectral para análise de suspensões celulares de órgãos sólidos. Este método gerencia autofluorescência como parâmetro independente, permitindo identificar populações raras em imunologia e biologia de células-tronco.

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Reconhecemos as contribuições técnicas e teóricas em citometria espectral K. Futamura, que também revisou criticamente o manuscrito. Nós também estamos em dívida com C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, e P. Pereira pela leitura crítica do manuscrito e para aconselhamento técnico interminável e apoio. Agradecemos também P. Pereira pelo dom dos anticorpos marcados anti Vγ7-APC e Vδ4-biotina. Nós aknowledge do Centro d&#39;Enseignements do Instituto Pasteur de boas-vindas e apoiar a logística de filmagem. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Science Foundation e Pasteur Bourse Roux (SS) Swiss National; Fundação para a Ciência e Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); e Université Paris Diderot, a Agence Nationale de la Recherche (ANR) projeto Twothyme, a ANR, e Programa REVIVE (investimento para o futuro) (AC).

<ol><li>Futamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+full-spectral+flow+cytometry+with+multiple+spectrally-adjacent+fluorescent+proteins+and+fluorochromes+and+visualization+of+in+vivo+cellular+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement.</a> Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+Cytometry+Has+Unique+Properties+Allowing+Multicolor+Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues.</a> PLoS One. 11 (8), e0159961(2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter FACS analysis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).</li>
<li>Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-gamma+allele-specific+selection+of+V+gamma+1%2FV+delta+4+cells+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium.</a> J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).</li>
<li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+trafficking%2C+and+intraepithelial+fate+of+gut-tropic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells.</a> J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).</li>
<li>Lavoinne, A., Cauliez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCardiac+troponin+I+and+T%3A+specific+biomarkers+of+cardiomyocyte%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Interne%22%5BJournal%5D)">[Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte].</a> Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).</li>
<li>Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cardiomyocyte+behavior+reveals+two+distinct+steps+in+ventricular+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation.</a> Development. 141 (3), 585-593 (2014).</li>
<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Keith, M. C., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22String+theory%22+of+c-kit%28pos%29+cardiac+cells%3A+a+new+paradigm+regarding+the+nature+of+these+cells+that+may+reconcile+apparently+discrepant+results%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">"String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results.</a> Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).</li>
<li>Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%2B+cardiac+progenitor+cells+and+heart-making%3A+a+critical+synopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis.</a> Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

FCM convencional baseia-se na detecção de fotões emitidos após a excitação de sondas fluorescentes. A emissão de fluorescência de um fluorocromo detectada num detector concebido para medir o sinal de outro fluorocromo induz sobreposição física. Este transbordamento entre os espectros de emissão precisa ser corrigido por compensações. FCM espectral e o processamento de dados pelo algoritmo de desmistura desconvolução permite a combinação de fluorocromos com picos de emissão estreitos sem comp...

Nas últimas décadas, a citometria de fluxo (FCM) tornou-se um método analítico amplamente disponível, essencial para estudos de fenótipos celulares. Houve um aumento substancial nos corantes fluorescentes disponíveis, particularmente fluorocromos excitados pelo laser violeta (405 nm) ( por exemplo, Brilliant Violet e novos corantes Q-dot). No entanto, o crescimento de corantes fluorescentes disponíveis aumenta o risco de sobreposição de emissões e requer matrizes de compensação de mão-de-obra intensiva. A FCM tornou-se amplamente utilizada para analisar suspensões de células de tecido sólido, mas a presença de células auto-fluorescentes limita a discriminação de populações especificamente marcadas. Os princípios básicos da FCM espectral são relatados em detalhe em Futamura et al. 1 , 2 . Resumidamente, o FCM espectral utilizado aqui (ver tabela de materiais) está equipado com lasers 405, 488 e 638 nm. O FCM espectral captura todas as emissões de fluorescence como espectros em um de 32 canais matriz PMT linear (PMT 32CH) para 500 nm a 800 nm e 2 PMT independentes para 420 nm a 440 nm e 450 nm a 469 nm, respectivamente, que substituem os filtros passa-banda convencionais. Os 488 e os pontos de laser 405/638 nm são espacialmente separadas, enquanto que os pontos de laser 405 nm e 638 nm são co-linear. Para cada partícula individual, as medidas espectrais FCM até 66 canais de dados de fluorescência são excitadas pela 405 nm e 488 nm lasers. Quando as células são excitados pelo laser de 638 nm, a FCM espectral mede 58 canais de dados de fluorescência por uma máscara é inserida para impedir que o laser de 638 nm a partir de brilho no PMT. Espectral FCM analisa os dados de espectro completo adquiridos com um algoritmo baseado no método dos mínimos quadrados ponderada (WLSM), que permite a separação de sobreposição de espectros de fluorescência. Os espectros derivada a partir de amostras individuais coradas e não coradas são reconhecidos como os espectros de referência de base. multi-amostras manchadas são matematicamente montado umnd não misturados, e o espectro de uma amostra com marcadores fluorescentes mistos é decomposto em um conjunto de seus espectros de constituinte. A desmistura, em tecnologia espectral 3, 4, substitui a compensação que remove o sinal de todos os detectores, excepto a uma medição de uma dada corante. Neste estudo, foram combinados e testados 19 fluorocromos em uma única, a análise de 21 parâmetro que caracteriza os principais subconjuntos hematopoiéticas encontrados no baço de ratinho. Além disso, demonstramos que a citometria espectral pode gerenciar sinal de auto-fluorescente, melhorando, assim, a caracterização de linfócitos intra-epiteliais do intestino e do coração embrionário. Na verdade, nestes tecidos, gerenciamento auto-fluorescência permitiu a atribuição de fluorescência específica para as células que seriam excluídos da análise no FCM convencional.

<table><tbody><tr><td>Camundongos</td><td>Janvier Labs</td><td>CD45.2</td><td>Fonte de células</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Esterilização</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+)</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>14040-174</td><td>Coleta de embriões</td></tr> Solução <tr><td>salina balanceada de Hanks (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>Soluções de dissociação, digestão e coloração</td></tr> Solução <tr><td>salina balanceada de Hanks (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14175095</td><td>Soluções de dissociação, digestão e coloração</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>Soluções de dissociação, digestão e coloração</td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td>Solução enzimática</td></tr><tr><td>90 x 15 mm, placas de Petri para cultura de tecidos plásticos.</td><td>TPP</td><td>T93100</td><td>Coleção de embriões e corações</td></tr><tr><td>35 x 15 mm, cultura de tecidos plásticos Placas de Petri.</td><td>TPP</td><td>T9340</td><td>Coleção Corações</td></tr><tr><td>Tesoura de íris fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14090-09</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Pinça bruta (pinça de padrão estreito, curvada 12 cm)</td><td>Ferramentas</td> de Ciência Fina <td>11003-12</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>Pinça fina (pinça Dumont no. 7)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11272-30 Ferramentas de</td><td>dissecação</td></tr><tr><td>Bisturi;</td><td>VWR</td><td>21909-668</td><td>Ferramentas de dissecação</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Microscópio de dissecação</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Amostragem; Ocular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Fonte de lâmpada fria</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Sampling; Tubos FACS adaptados a duas fibras de pescoço de ganso</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>60819-310</td><td>Células de digestão</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços (fundo redondo)</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td>Células de coloração</td></tr><tr><td>Tecido de nylon de malha esterilizado peças de 50/50 mm.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>SEFAR NITEX</td><td>Filtração celular</td></tr><tr><td>UltrasComp eBeads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos marcados com fluorescência</td><td>Biolegend</td><td>Número de catálogo, consulte a tabela abaixo</td><td>Células de coloração</td></tr></tbody></table>

análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

A citometria de fluxo foi usada para os últimos 40 anos, para definir e analisar o fenótipo da linfóide e outras células hematopoiéticas. Inicialmente restrita à análise de alguns fluorocromos, atualmente, existem dezenas de diferentes corantes fluorescentes, e até 14-18 corantes diferentes podem ser combinados em um momento. No entanto, várias limitações ainda prejudicar as capacidades analíticas. Devido à multiplicidade de sondas fluorescentes, análise de dados tornou-se cada vez mais complexa devido à necessidade de grandes, matrizes de compensação multi-paramétricos. Além disso, modelos de murganhos mutantes transportando proteínas fluorescentes para detectar e oligo tipos de células específicas em diferentes tecidos tornaram-se disponíveis, por isso, é necessária a análise (por citometria de fluxo) de suspensões celulares de auto-fluorescentes obtidas a partir de órgãos sólidos. Espectrais citometria de fluxo, que distingue as formas de espectros de emissão ao longo de uma ampla gama de comprimentos de onda contínuos, resolve alguns destes problemas. Os dados são analisados ​​wom um algoritmo que substitui matrizes de compensação e trata auto-fluorescência como um parâmetro independente. Assim, citometria de fluxo espectral deve ser capaz de discriminar fluorocromos com picos de emissão semelhantes e pode fornecer uma análise multi-paramétrico, sem exigências de compensação. Este protocolo descreve o fluxo de citometria espectral análise, permitindo um 21 parâmetro (19 sondas fluorescentes) caracterização e a gestão de um sinal auto-fluorescente, proporcionar alta resolução na detecção população menor. Os resultados aqui apresentados mostram que o fluxo de citometria espectral apresenta vantagens na análise de populações de células a partir de tecidos difíceis de caracterizar em citometria de fluxo convencional, tal como o coração e o intestino. Espectrais citometria de fluxo, assim, demonstra a capacidade de análise multi-paramétrico de gestão de alto desempenho citometria de fluxo convencional, sem a exigência de compensação e permite auto-fluorescência.

21 parâmetros painel FCM espectral para analisar esplenócitos A Figura 1 mostra os resultados obtidos com o painel 19-fluorescente-anticorpo aplicado a células esplénicas compreendendo anticorpos que reconhecem diferentes subconjuntos de T, B, NK, dendríticas e células mielóides, enquanto CD45 etiquetas todas as células nucleadas hematopoiéticas. O painel também inclui um corante de viabilidade (PI), assim como o...

Este artigo descreve espectral citometria, uma nova abordagem em citometria de fluxo que usa as formas de espectros de emissão de distinguir fluorocromos. Um algoritmo substitui compensações e pode tratar auto-fluorescência como um parâmetro independente. Esta nova abordagem permite a análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

O objetivo geral dessa técnica de citometria espectral é distinguir diferentes fluorocromos utilizando seus espectros completos de emissão. Além disso, este protocolo permite a implementação da autofluorescência como um parâmetro independente, possibilitando uma análise adequada de células isoladas de órgãos sólidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de imunologia e desenvolvimento da biologia de células-tronco, como, por exemplo, como identificar populações celulares raras.A principal vantagem desta técnica é sua capacidade única de analisar simultaneamente um grande número de parâmetros e de gerenciar a autofluorescência de tecidos sólidos. Embora este método seja usado para o preparo de uma suspensão de células únicas derivadas do intestino e do coração, ele também pode ser aplicado a outros órgãos, como pulmão, músculo esquelético, fígado, gordura e rim. Para começar, isole e lave o intestino delgado de um camundongo adulto.Em seguida, coloque o tecido sobre uma toalha de papel e, com tesoura afiada, remova cuidadosamente as placas de Peyer. Abra o intestino cortando-o longitudinalmente e divida-o em pedaços de um centímetro. Em seguida, trans

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Biologia

A identificação de células de tumor cerebral de iniciação (BTICs), as células raras dentro de uma heterogeneidade de tumores que possuem propriedades de células-tronco, fornece novas pistas sobre patogénese humana de tumor cerebral. Temos refinado condições específicas de cultura para enriquecer para BTICs, e usam rotineiramente citometria de fluxo para enriquecer ainda mais essas populações. A auto-renovação e ensaios de análise por transcrição única célula de RT-PCR pode ser realizada...

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Um protocolo de novo para a preparação de suspensões de células mecânica testiculares roedor a partir de material, evitando enzimas e detergentes, é descrito. O método é muito simples, rápida, reprodutível e processa boas suspensões de células de qualidade, os quais são adequados para a separação do fluxo e extracção de RNA.

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