Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

O objetivo geral deste protocolo é quantificar a autofosforilação de histidinas quinases bacterianas purificadas. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da sinalização de dois componentes. Como o efeito de estímulos cognatos nas interações proteína-proteína na autofosforilação de histidina quinases.

As principais vantagens desta técnica são que é um método de alto rendimento que pode ser usado para detectar com precisão picomoles de fosfohistadina formados e obter parâmetros cinéticos para histidina quinases. Como bolsista de pós-doutorado, uso filtração em membranas de nitrocelulose para quantificar ligantes radioativos ligados a proteínas. Consequentemente, fazia sentido desenvolver uma técnica semelhante para quantificar a fosforilação da histidina em histidinas quinases bacterianas.

Comece este procedimento com a preparação de reagentes e materiais conforme descrito no protocolo de texto. Para configurar o aparelho de plotagem de pontos de 96 poços, corte um pedaço de membrana de nitrocelulose de oito centímetros por 12 centímetros. Posicione a nitrocelulose no aparelho de gráfico de pontos.

Certifique-se de que a membrana se encaixa de forma que o aparelho seja vedado e todos os poços estejam completamente cobertos pela membrana. Para recolher o filtrado, ligar o aparelho a um balão secundário de pistola. A partir da haste da válvula, conecte um tubo adequado para permitir que o aparelho seja usado confortavelmente sem inclinar o frasco secundário.

Em seguida, conecte o frasco secundário da pistola a uma fonte de vácuo do aspirador. Testar se o aparelho está completamente vedado aplicando um vácuo ao aparelho. Se o aparelho estiver montado corretamente, um forte vácuo estará presente em todos os poços.

Todas as conexões de tubulação podem ser envoltas em Parafilm ou Saran wrap para garantir uma vedação hermética. Antes do início, prepare todos os quatro componentes da reação como quatro soluções de estoque X, conforme descrito no protocolo de texto. Misture volumes iguais de tampão de reação, histidina quinase e água duplamente destilada.

Permita que esses componentes da reação se equilibrem à temperatura ambiente por um curto período de tempo. Para iniciar a reação, adicione um volume de solução de ATP gama-32 P e misture pipetando para cima e para baixo. Acompanhe o tempo de reação decorrido com um temporizador e permita que a reação prossiga pelo tempo desejado.

Sacie a reação. Adicionar uma alíquota da reacção ao ácido fosfórico a 325 milimolares. Coloque imediatamente as reações extintas no gelo até que todas as reações tenham sido encerradas.

Coloque o aparelho de plotagem de pontos de 96 poços pré-montado em um recipiente secundário. Este recipiente deve ser grande o suficiente para que o aparelho seja facilmente desmontado, pois o aparelho e a membrana ficarão radioativos após o uso. Aplique um vácuo ao aparelho de plotagem de pontos de 96 poços.

Quando o aparelho estiver sob vácuo, pipetar cuidadosamente a reação exveniente diretamente sobre a membrana de nitrocelulose em cada poço. Repita este processo até que todas as reações sejam carregadas na membrana. Como a capacidade de ligação da nitrocelulose é maior que a quantidade de histidina quinase manchada, pode-se supor que quase toda a quinase se liga à membrana quando carregada corretamente.

Dependendo do aparelho utilizado, tome cuidado para não perfurar a nitrocelulose. Observe que toda a reação entrou em contato com a nitrocelulose. É fácil para algumas das reações grudarem nas paredes do poço.

Lave os poços com 100 microlitros de ácido fosfórico 25 milimolar gelado. Isso permitirá que qualquer volume de reação que possa ter ficado preso no poço atinja a membrana, garantindo o carregamento completo de todas as reações. Deixe todo o volume fluir através da membrana.

Desmonte cuidadosamente o aparelho antes de desligar o aspirador. Esteja ciente de que tanto o aparelho quanto a membrana de nitrocelulose são radioativos neste momento. Não remova nenhum componente do aparelho do recipiente secundário.

Com uma pinça, transfira cuidadosamente a membrana de nitrocelulose do aparelho para um recipiente de aproximadamente 200 mililitros de ácido fosfórico gelado 25 milimolar. Coloque uma tampa neste recipiente, pois a lavagem será radioativa. Neste momento, o vácuo pode ser desligado.

Coloque o recipiente com a membrana de lavagem em um balancim. Deixe a membrana balançar suavemente por 20 minutos. Após 20 minutos, decante cuidadosamente a solução de lavagem usada em um balde grande para ser usado para armazenamento temporário de resíduos.

Adicione 200 mililitros de ácido fosfórico 25 milimolar gelado à membrana. Lave a membrana desta maneira pelo menos três vezes para remover o sinal de fundo gamma-32 P ATP da membrana. Após a terceira lavagem, testar a solução de lavagem usada para radiação com um contador Geiger.

Continue a lavar a membrana até que nenhum sinal esteja presente na solução de lavagem. Depois que a membrana estiver suficientemente lavada, deixe-a secar brevemente ao ar, o que normalmente leva cinco minutos ou menos. Após a exposição da nitrocelulose a um verde de fósforo, conforme descrito no protocolo de texto, prepare para a coloração e descoloração de Ponceau S.

Mergulhe brevemente a membrana de nitrocelulose na solução de coloração Ponceau S por um a dois minutos. Molhe toda a membrana com a mancha antes de descolorar. Em seguida, transvase o excesso de Ponceau S da membrana.

Enxágue a membrana com água bidestilada até que apenas as manchas da histidina quinase sejam manchadas. Observe que este procedimento só funcionará se todas as manchas contiverem quantidades detectáveis de proteína. Usando uma tesoura, corte cada ponto na membrana de nitrocelulose.

Não é necessário cortar perfeitamente ao longo da borda da mancha manchada. Se a membrana foi lavada o suficiente, o fundo devido ao tamanho variável dos pontos de recorte é insignificante. É importante apenas cortar todo o ponto para cada reação.

Usando uma pinça, transfira cuidadosamente cada mancha para frascos de cintilação. Nenhum coquetel de cintilação é necessário, pois o fósforo 32 é facilmente detectável pela radiação Cherenkov. Em seguida, identifique várias diluições de solução de ATP gama-32 P em quadrados de um centímetro por um centímetro de nitrocelulose.

Usando uma pinça, transfira cuidadosamente cada quadrado para frascos de cintilação sem coquetel de cintilação. Essas amostras serão usadas para gerar uma curva padrão para determinar as contagens por minuto por picomol da solução de ATP. A coloração de Ponceau da membrana de nitrocelulose é mostrada aqui.

A coloração é uniforme em todas as amostras, indicando que todas as amostras são igualmente carregadas. Os resultados da fluorografia da membrana de nitrocelulose mostram o nível relativo de fosfohistidina radiomarcada em cada ponto. A quarta e a oitava fileiras são controles negativos demonstrando que o excesso de ATP é lavado da membrana de nitrocelulose.

Os resultados representativos da quantificação da autofosforilação da histidina quinase são mostrados aqui. Esses dados são gerados a partir da contagem de cintilação de cada ponto cortado da membrana. A curva padrão de contagens por minuto por picomol de ATP mostrada aqui também é gerada a partir da contagem de cintilação e é usada para calcular os picomoles de fosfohistidina presentes em cada amostra.

Após esse procedimento, outros métodos, como a introdução de estímulos cognatos ou proteínas que supostamente modulam a atividade da quinase, podem ser adicionados ao experimento para responder a perguntas adicionais, como o efeito desses aditivos na atividade da quinase. Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso. Precauções como treinamento adequado de segurança contra radiação e uso de equipamentos de proteção individual e blindagem devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.