Quantificação dos Quinase bacteriana Histidina Autofosforilação utilizando um ensaio de ligação de nitrocelulose

O objetivo geral deste protocolo é quantificar a autofosforilação de quinases histidina bacterianas purificadas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da sinalização de dois componentes, como o efeito de estímulos cognatos nas interações proteína-proteína sobre a autofosforilação de quinases histidina.

As principais vantagens desta técnica são que se trata de um método de alto rendimento que pode ser usado para detectar com precisão picomoles de fosfohistidina formados e obter parâmetros cinéticos para quinases de histidina. Como pesquisador pós-doutorando, utilizo filtração em membranas de nitrocelulose para quantificar ligantes radioativos ligados a proteínas. Consequentemente, fazia sentido desenvolver uma técnica semelhante para quantificar a fosforilação de histidina em quinases de histidina bacterianas.

Inicie este procedimento com o preparo dos reagentes e materiais conforme descrito no protocolo textual. Para montar o aparelho de dot-plot de 96 poços, corte um pedaço de membrana de nitrocelulose com oito centímetros por 12 centímetros. Posicione a nitrocelulose no aparelho de dot-plot.

Certifique-se de que a membrana se ajuste de forma que o aparelho fique selado e todos os poços sejam completamente cobertos pela membrana. Para coletar o filtrado, conecte o aparelho a um frasco coletor secundário com saída lateral. A partir do tubo de válvula, conecte uma tubulação adequada para permitir o uso confortável do aparelho sem derrubar o frasco secundário.

Em seguida, conecte o frasco do braço secundário a uma fonte de vácuo aspirador. Teste se o aparato está completamente selado aplicando vácuo ao sistema. Se o aparato estiver montado corretamente, um vácuo forte estará presente em todas as cavidades.

Todas as conexões de tubos podem ser envolvidas em Parafilm ou filme plástico para garantir uma vedação hermética. Antes da iniciação, prepare os quatro componentes da reação como quatro soluções estoque X, conforme descrito no protocolo textual. Misture volumes iguais de tampão de reação, quinase de histidina e água bidestilada.

Deixe esses componentes da reação atingirem equilíbrio à temperatura ambiente por um curto período. Para iniciar a reação, adicione um volume da solução de ATP gamma-32 P e misture pipetando para cima e para baixo. Acompanhe o tempo decorrido da reação com um cronômetro e deixe a reação prosseguir pelo tempo desejado.

Interrompa a reação. Adicione uma alíquota da reação a ácido fosfórico 325 milimolar. Coloque imediatamente as reações interrompidas no gelo até que todas as reações tenham sido finalizadas.

Coloque o aparelho pré-montado de dot-plot de 96 poços em um recipiente secundário. Esse recipiente deve ser grande o suficiente para permitir a desmontagem fácil do aparelho, já que o aparelho e a membrana estarão radioativos após o uso. Aplique vácuo ao aparelho de dot-plot de 96 poços.

Uma vez que o aparelho esteja sob vácuo, pipete cuidadosamente a reação interrompida diretamente sobre a membrana de nitrocelulose em cada poço. Repita este processo até que todas as reações sejam carregadas na membrana. Como a capacidade de ligação da nitrocelulose é maior do que a quantidade de histidina quinase depositada, pode-se assumir que quase toda a quinase se liga à membrana quando carregada corretamente.

Dependendo do aparelho utilizado, tenha cuidado para não perfurar a nitrocelulose. Observe se toda a reação entrou em contato com a nitrocelulose. É comum parte da reação aderir às paredes do poço.

Lave as cavidades com 100 microlitros de ácido fosfórico 25 milimolar gelado. Isso permitirá que qualquer volume de reação que possa ter ficado retido na cavidade alcance a membrana, garantindo o carregamento completo de todas as reações. Deixe todo o volume passar através da membrana.

Desmonte cuidadosamente o aparelho antes de desligar o vácuo. Esteja ciente de que, neste momento, tanto o aparelho quanto a membrana de nitrocelulose são radioativos. Não remova nenhum componente do aparelho do recipiente secundário.

Com pinças, transfira cuidadosamente a membrana de nitrocelulose do aparelho para um recipiente contendo aproximadamente 200 mililitros de ácido fosfórico gelado a 25 milimolares. Tampe este recipiente, pois a lavagem será radioativa. Neste momento, a vácuo pode ser desligado.

Coloque o recipiente com a membrana de lavagem sobre um agitador. Deixe a membrana agitar suavemente por 20 minutos. Após 20 minutos, descarte cuidadosamente a solução de lavagem usada em um balde grande para armazenamento temporário de resíduos.

Adicione 200 mililitros de ácido fosfórico 25 milimolar gelado à membrana. Lave a membrana desta forma pelo menos três vezes para remover o sinal de fundo de ATP gamma-32 P da membrana. Após a terceira lavagem, teste a solução usada quanto à radiação com um contador Geiger.

Continue lavando a membrana até que não haja sinal presente na solução de lavagem. Depois que a membrana for lavada suficientemente, deixe-a secar ao ar brevemente, o que geralmente leva cinco minutos ou menos. Após a exposição do nitrato de celulose ao verde de fósforo, conforme descrito no protocolo textual, prepare-se para a coloração com Ponceau S e descoloração.

Mergulhe brevemente a membrana de nitrocelulose na solução de corante Ponceau S por um a dois minutos. Umedeça toda a membrana com o corante antes da descoloração. Em seguida, descarte o excesso de Ponceau S da membrana.

Lave a membrana com água destilada duplamente até que apenas as manchas da quinase de histidina estejam coradas. Observe que este procedimento funcionará apenas se todas as manchas contiverem quantidades detectáveis de proteína. Usando tesoura, recorte cada mancha na membrana de nitrocelulose.

Não é necessário cortar perfeitamente ao longo da borda da mancha corada. Se a membrana foi lavada adequadamente, o fundo decorrente de tamanhos variados das manchas recortadas é desprezível. O importante é apenas recortar toda a mancha correspondente a cada reação.

Usando pinças, transfira cuidadosamente cada ponto para frascos de cintilação. Não é necessário nenhum coquetel de cintilação, pois o fósforo 32 é facilmente detectável pela radiação Cherenkov. Em seguida, aplique várias diluições da solução de ATP marcado com gama-32 P em quadrados de um centímetro por um centímetro de nitrocelulose.

Usando pinças, transfira cuidadosamente cada quadrado para frascos de cintilação sem o coquetel de cintilação. Essas amostras serão usadas para gerar uma curva padrão para determinar as contagens por minuto por picomol do solução de ATP. Aqui é mostrada a coloração com Ponceau da membrana de nitrocelulose.

A coloração é uniforme em todas as amostras, indicando que todas as amostras foram carregadas igualmente. Os resultados da fluorografia da membrana de nitrocelulose mostram o nível relativo de fosfohistidina radiomarcada em cada ponto. A quarta e a oitava fileira são controles negativos, demonstrando que o excesso de ATP foi removido da membrana de nitrocelulose.

Resultados representativos da quantificação da autofosforilação de quinase de histidina são mostrados aqui. Esses dados são gerados a partir da contagem de cintilação de cada ponto recortado da membrana. A curva padrão de contagens por minuto por picomol de ATP mostrada aqui também é gerada a partir da contagem de cintilação e é usada para calcular os picomoles de fosfohistidina presentes em cada amostra.

Após este procedimento, outros métodos, como a introdução de estímulos cognatos ou proteínas que se hipotetiza modular a atividade de quinases, podem ser acrescentados ao experimento para responder perguntas adicionais, como o efeito desses aditivos sobre a atividade de quinases. Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso. Precauções, como treinamento adequado em segurança radiológica e o uso de equipamentos de proteção individual e blindagem, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.