A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

O objetivo geral deste ensaio de linfócitos baseado em fluorescência é identificar novos imunomoduladores de pequenas moléculas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da imunologia sobre o mecanismo de ativação e inibição de linfócitos. A principal vantagem desse ensaio e função fenotípica é que ele pode ser adaptado para a descoberta de fármacos.

Demonstrará o procedimento Ahmed Fouda, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Em uma cabine de segurança biológica, desinfete a pelagem de um camundongo fêmea Nurr77 GFP com idade entre seis e oito semanas usando etanol 70%, e posicione o animal sobre o seu lado direito. Em seguida, faça uma incisão na pele e nos músculos do quadrante abdominal superior esquerdo, localize e remova o baço, colocando o tecido em meio para esplenócitos sobre gelo.

Após coletar todos os baços, transfira os tecidos para uma placa de cultura celular de 10 centímetros quadrados contendo cinco mililitros de meio para esplenócitos pré-aquecido e use o êmbolo de uma seringa estéril para macerar os tecidos até que a solução fique turva. Após maceração extensiva no meio para esplenócitos, filtre a suspensão celular através de um filtro celular de 70 mícrons para um tubo de 50 mililitros para remover qualquer debris e centrifugue a suspensão resultante de células isoladas. Resuspenda o pellet em dois a três mililitros de tampão de lise de hemácias, interrompendo a reação com cinco mililitros de RPMI ou outro tampão adequado, após 20 a 30 segundos.

Em seguida, colete as células com outra centrifugação e reconstitua o pellet em dois mililitros de meio para esplenócitos para contagem celular. Para isolar os linfócitos T, centrifugue as células novamente e reconstitua o pellet em meio RPMI sem soro, na concentração de um vezes 10 elevado a sete células por mililitro. Transfira as células para um tubo de poliestireno de cinco mililitros e reserve uma alíquota de 100 microlitros de esplenócitos para ser usada posteriormente na avaliação de pureza.

Em seguida, adicione 50 microlitros por mililitro de soro de rato normal às células, seguido pela adição de 50 microlitros por mililitro do coquetel de anticorpos para isolamento de linfócitos T com mistura suave. Após 10 minutos, incube as células com microesferas magnéticas conjugadas com estreptavidina por dois minutos e meio. Então, adicione meio sem soro às células para um volume final de dois mililitros e meio, e coloque o tubo em um ímã para isolamento celular por três minutos.

No final da incubação, mantenha o tubo no ímã e despeje o sobrenadante em um novo tubo de poliestireno em um único movimento. Em seguida, as células T podem ser contadas. Semee as células T em uma placa de 96 poços com fundo redondo a uma concentração de 2,5 vezes 10 à quinta células por poço, contendo 200 microlitros de meio fresco para esplenócitos por poço.

Adicione interleucina 7 recombinante e microesferas magnéticas CD3/CD28 aos poços apropriados e coloque a placa em um incubador de cultura celular. Doze horas depois, pipete suavemente a suspensão celular em cada poço para dissociar quaisquer agregados de células com microesferas. Em seguida, transfira as suspensões celulares de cada poço para tubos individuais de poliestireno de cinco mililitros.

Quando todas as células tiverem sido coletadas, coloque cada tubo de células no ímã de separação por cinco minutos de cada vez e decante os sobrenatantes enquanto o tubo ainda estiver dentro do ímã, transferindo-os para novos tubos de poliestireno ao final de cada incubação. Em seguida, colete as células por centrifugação e re-suspenda os pellets em meio fresco para esplenócitos na concentração de duas vezes 10 à sexta células por mililitro. Para triagem de alta produtividade com moléculas de pequeno porte, plaque 40 microlitros de células por poço em uma placa de 384 poços e trate os poços apropriados com a droga ou veículo de escolha pelo período de tratamento desejado no incubador de cultivo celular.

Trinta minutos antes da análise de GFP, marque as células com a concentração apropriada de solução de Hoechst, distribuindo completamente o corante com pipetagem suave. Quando todas as placas tiverem sido coradas, centrifugue as placas para recolher as células no fundo dos poços e deixe as células repousarem por 15 minutos à temperatura ambiente. Carregue a placa de acordo com as instruções do fabricante.

Em seguida, configure a objetiva em 40X ou superior. Configure a câmera número quatro para a lâmpada UV e, depois, configure a câmera número um para o laser 488. Carregue a placa no sistema de triagem de alto conteúdo.

Em seguida, configure o sistema automatizado de triagem de alto conteúdo com microscopia confocal para ler de seis a dez campos por poço, com duas leituras sequenciais por campo, a 488 nanômetros e luz ultravioleta. As células T positivas para CD3 representam aproximadamente 30% de um baço de camundongo, demonstrando uma expressão basal de GFP de 10%. Após a estimulação com microesferas que ativam o receptor de células T CD3/CD28, observa-se um aumento de cinco a seis vezes na porcentagem de expressão de GFP.

Da mesma forma, as células B positivas para CD19 representam de 50 a 55% dos esplenócitos totais, com expressão basal de GFP semelhante à das células T não ativadas. Curiosamente, a estimulação do receptor de células B usando anti-IgG, IgM de camundongo e CD40L recombinante induz apenas um aumento insignificante na expressão de GFP. Após o isolamento com microesferas magnéticas conforme demonstrado anteriormente, as células T positivas para CD3 isoladas ainda exibem uma expressão basal de GFP de 10%.

No entanto, a estimulação com microesferas CD3/CD28 induz uma significativa superexpressão da resposta GFP. De forma semelhante, após o isolamento magnético de células B, as células B ativadas purificadas exibem uma expressão mais elevada de GFP em comparação com células B ativadas em esplenócitos. Neste experimento representativo, a triagem primária em alto rendimento de 4398 compostos revelou diversos ativadores e inibidores da ativação de células T.

Mas a expressão de GFP observada nas células T estimuladas foi 20 vezes maior do que a medida nas células T não estimuladas, permitindo a geração de uma janela de zona de ação na qual os compostos inibidores de GFP poderiam ser facilmente detectados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 36 a 48 horas, se realizada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de contar as células após cada etapa. Após este procedimento, outros métodos como ELISA ou western blotting podem ser realizados para responder quaisquer outras questões adicionais. Esta técnica abrirá caminho para a descoberta de fármacos com imunomodulação em roedores.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e ativar células T ou B derivadas das placas de camundongos Nurr77 GFP.