A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

O objetivo geral deste ensaio de linfócitos baseado em florescência é identificar novos imunomoduladores de moléculas pequenas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre o mecanismo de ativação e inibição de linfócitos. A principal vantagem desta função fenotípica e do ensaio, é que ela pode ser adaptada para a descoberta de medicamentos.

Demonstrando o procedimento estará Ahmed Fouda, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Sob um capuz de trabalho estéril, desinfete o pelo de uma fêmea de seis a oito semanas de idade com etanol a 70% e coloque o animal do lado direito. Em seguida, faça uma incisão na pele e nos músculos do quadrante abdominal superior esquerdo e localize e remova o baço, colocando o tecido em meio esplenócito no gelo.

Quando todos os baços tiverem sido coletados, transfira os tecidos para uma placa de cultura de células quadrada de 10 centímetros contendo cinco mililitros de meio de esplenócitos pré-aquecido e use um êmbolo de seringa estéril para esmagar os tecidos até que a solução esteja turva. Após extensa maceração em meio de esplenócitos, filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 70 mícrons em um tubo de 50 mililitros para remover quaisquer detritos e centrifugue a suspensão de célula única resultante. Ressuspenda o pellet em dois a três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos, encharcando a reação com cinco mililitros de RPMI, ou outro tampão adequado, após 20 a 30 segundos.

Em seguida, colete as células com outra centrifugação e ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio esplenócito para contagem de células. Para isolar as células T, centrifugue as células novamente e ressuspenda o pellet em meio RPMI livre de soro em uma concentração de uma vez 10 a sete células por mililitro. Transferir as células para um tubo de poliestireno de cinco mililitros e retirar uma alíquota de 100 microlitros de esplenócitos para ser utilizada posteriormente para a avaliação da pureza.

Em seguida, adicione 50 microlitros por mililitro de soro de rato normal às células, seguido pela adição de 50 microlitros por mililitro de coquetel de anticorpos de isolamento de células T com mistura suave. Após 10 minutos, incubar as células com esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina durante dois minutos e meio. Em seguida, adicione meio livre de soro às células para um volume final de dois mililitros e meio e coloque o tubo em um ímã de isolamento celular por três minutos.

No final da incubação, segurando o tubo no ímã, despeje o sobrenadante em um novo tubo de poliestireno de uma só vez. As células T podem então ser contadas. Semeie células T em uma placa de fundo redondo de 96 poços a uma concentração de 2,5 vezes 10 até a quinta células por poço contendo 200 microlitros de meio de esplenócitos frescos por poço.

Adicione grânulos magnéticos recombinantes de interleucina 7 e CD3 / CD28 aos poços apropriados e coloque a placa em uma incubadora de cultura de células. 12 horas depois, triture suavemente a suspensão celular em cada poço para quebrar quaisquer agregados de células de esferas. Em seguida, transfira as suspensões celulares de cada poço para tubos individuais de poliestireno de cinco mililitros.

Quando todas as células tiverem sido coletadas, coloque cada tubo de células no ímã de separação por cinco minutos de cada vez e transvase os sobrenadantes quando o tubo ainda estiver dentro do ímã, em novos tubos de poliestireno no final de cada incubação. Em seguida, colete as células por centrifugação e ressuspenda os pellets em meio fresco de esplenócitos em concentrações de duas vezes 10 elevado ao sexto células por mililitro. Para triagem de alto rendimento de moléculas pequenas, coloque 40 microlitros de células por poço em uma placa de 384 poços e trate os poços apropriados com o medicamento ou veículo de escolha para o período de tratamento desejado na incubadora de cultura de células.

30 minutos antes da análise de GFP, corar as células com a concentração adequada de solução de Hoechst, distribuindo completamente a mancha com uma pipetagem suave. Quando todos os poços estiverem tingidos, centrifugue as placas para coletar as células no fundo dos poços e deixe as células descansarem por 15 minutos em temperatura ambiente. Carregue a placa de acordo com as instruções do fabricante.

Em seguida, defina o objetivo em 40X ou superior. Defina o número da câmera quatro para a lâmpada UV e, em seguida, defina o número da câmera um para o laser 488. Carregue a placa no sistema de peneiramento de alto teor.

Em seguida, configure o sistema automatizado de triagem confocal de alto conteúdo para ler de seis a 10 campos por poço com duas leituras sequenciais por campo, a 488 nanômetros e luz UV. As células T CD3 positivas representam aproximadamente 30% de um determinado baço de camundongo, demonstrando uma expressão basal de GFP de 10%. Após a estimulação do grânulo do receptor de células T CD3 / CD28, observa-se um aumento de cinco a seis vezes na porcentagem de expressão de GFP.

Da mesma forma, as células B CD19 positivas representam 50 a 55% do total de esplenócitos com a expressão basal de GFP semelhante à das células T não ativadas. Curiosamente, a estimulação do receptor de células B usando IgG anti-camundongo, IgM e CD40L recombinante desencadeia apenas um aumento trivial na expressão de GFP. Após o isolamento do grânulo magnético, como acabamos de demonstrar, as células T CD3 positivas isoladas ainda exibem uma expressão de GFP basal de 10%.

A estimulação do grânulo CD3 / CD28, no entanto, induz uma regulação positiva significativa da resposta da GFP. Da mesma forma, após o isolamento do grânulo magnético das células B, as células B ativadas purificadas exibem uma expressão mais alta de GFP em comparação com as células B ativadas nos esplenócitos. Neste experimento representativo, a triagem primária de alto rendimento de 4398 compostos revelou vários ativadores e inibidores da ativação de células T.

Mas a expressão GFP observada das células T estimuladas, 20 vezes maior do que a medida para as células T não estimuladas. Permitindo a geração de uma janela de zona de ação onde os compostos inibidores de GFP podem ser facilmente detectados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em 36 a 48 horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de contar as células após cada etapa. Seguindo este procedimento, outros métodos como ELISA ou western blotting podem ser realizados para responder a quaisquer outras perguntas adicionais. Esta técnica abrirá caminho para a imunomodulação da descoberta de medicamentos em roedores.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e ativar células T ou B derivadas das placas de camundongo Nurr77 GFP.