Um ensaio baseado em fluorescência usando linfócitos projetados para triagem de compostos imunomoduladores

Comece com uma placa de vários poços compatível com fluorescência contendo uma suspensão de linfócitos T derivados de camundongos transgênicos.

Esses linfócitos contêm uma proteína fluorescente verde ou de expressão de GFP, controlada pelo receptor de células T ou envolvimento do TCR com compostos imunomoduladores.

Trate cada poço com uma solução contendo compostos imunomoduladores com diferentes potenciais.

Durante a incubação, os compostos imunomoduladores interagem com os TCRs nos linfócitos T.

A interação do TCR com um composto estimulante desencadeia a ativação do do gene, elevando a expressão de GFP.

Em contraste, a interação do TCR com um composto inibitório inibe o do gene e reduz a expressão de GFP.

Em seguida, cubra as células com corante fluorescente de ácido nucleico para manchar os núcleos.

Centrifugue a placa para assentar as células para uma medição precisa da fluorescência.

Sob um microscópio de fluorescência, os linfócitos T viáveis exibem dois sinais de fluorescência correspondentes aos núcleos celulares e às proteínas fluorescentes verdes.

A fluorescência verde intensificada significa estimulação bem-sucedida dos linfócitos T, enquanto um fraco sinal de fluorescência verde intracelular confirma o efeito inibitório de compostos imunomoduladores nos linfócitos T.

Para triagem de alto rendimento de moléculas pequenas, coloque 40 microlitros de células por poço em uma placa de 384 poços e trate os poços apropriados com o medicamento ou veículo de escolha para o período de tratamento desejado na incubadora de cultura de células.

30 minutos antes da análise de GFP, corar as células com a concentração adequada de solução de Hoechst, distribuindo completamente a mancha com uma pipetagem suave. Quando todos os poços estiverem tingidos, centrifugue as placas para coletar as células no fundo dos poços e deixe as células descansarem por 15 minutos em temperatura ambiente.

Carregue a placa de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, defina o objetivo em 40X ou superior. Defina o número da câmera 4 para a lâmpada UV e, em seguida, defina o número da câmera 1 para o laser 488. Carregue a placa no sistema de peneiramento de alto conteúdo. Em seguida, configure o sistema automatizado de triagem confocal de alto conteúdo para ler de 6 a 10 campos por poço, com duas leituras sequenciais por campo a 488 nanômetros e luz UV.