Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

O objetivo geral deste método é montar embriões de peixe-zebra para imagens ao vivo, que permitem o crescimento normal da região posterior do corpo. Este método pode ser adaptado para a imagem de outras regiões do peixe-zebra em desenvolvimento. Essa técnica ajuda a responder a questões-chave na Biologia do Desenvolvimento, como como os comportamentos celulares individuais levam à morfogênese no nível de tecidos inteiros.

A principal vantagem desta técnica é que ela permite o momento livre do corpo posterior, mantendo o embrião na orientação correta. Para começar, adicione agarose de baixo ponto de fusão a uma concentração final de 1,5% ao meio E3 em um tubo de 50 mililitros e dissolva a agarose aquecendo no microondas. Deixe a solução se equilibrar a 42 a 45 graus Celsius em banho-maria ou incubadora de bancada.

Depois de puxar agulhas de vidro de acordo com o protocolo de texto. Com uma pinça, quebre a agulha logo após o ponto em que ela se flexiona para criar uma agulha limpa e afiada para orientar os embriões e remover o excesso de agarose. Elevar os embriões até o estágio apropriado em meio E3.

Em seguida, sob um microscópio de dissecação binocular, use um par de pinças afiadas para descorionar os embriões. Incubar os embriões descorionados durante pelo menos cinco minutos em solução de trabalho de tricaína. Em seguida, use uma pipeta Pasteur de vidro para transferir o embrião descorionado com E3 mínimo diretamente para o tubo de 50 mililitros de agarose a 45 graus Celsius.

Remova o embrião junto com aproximadamente um mililitro da agarose de montagem e transfira aproximadamente 100 microlitros do meio com o embrião para o centro de um micropoço de 10 milímetros no fundo de uma placa de Petri com fundo de vidro de 35 milímetros. À medida que o meio de montagem estiver endurecendo, mova o embrião para a borda do círculo de agarose, com a cauda voltada para fora. Use a agulha capilar para orientar o embrião o mais lateralmente possível para obter imagens do desenvolvimento posterior do corpo.

Em seguida, com o capilar, mantenha o embrião na orientação lateral desejada até que o gel esteja completamente firme. Assim que a gota de agarose endurecer, use uma solução de trabalho de tricaína para inundar a placa de Petri. Em seguida, sob um microscópio de dissecação com uma base de luz transmitida, ajuste a posição do espelho e o ângulo da luz incidente para que o forte contraste permita que os cortes na agarose sejam claramente vistos.

Para realizar o corte um, use a agulha capilar ou o microbisturi para cortar a agarose em um movimento de serrar para cima e para baixo, adjacente e no meio da gema, logo posterior aos campos cardíacos em formação no quinto somito anterior e completamente através da agarose até o vidro. Crítico aqui para garantir que o embrião não seja danificado ao cortar a agarose sobre o saco vitelino. Em seguida, faça o segundo e o terceiro cortes, começando contra o embrião até o vidro, tangencial aos cinco primeiros somitos, permitindo o desdobramento dorsal do corpo posterior.

Em seguida, começando na interseção dos cortes um e três, faça um corte diagonal lento em direção ao final do corte três, enquanto levanta lentamente para cima para desalojar o quadrado de agarose ao redor do corpo posterior. Com uma pinça afiada, remova os blocos desalojados de agarose do meio embrionário usando a parede da placa de Petri como suporte enquanto retira os pedaços de agarose. Antes da montagem da amostra, use 1% de agarose em E3 para revestir um prato de plástico de 100 milímetros a uma altura de cinco milímetros e deixe-o endurecer.

Em seguida, coloque uma gota de um mililitro de agarose de baixo ponto de fusão no centro do prato e deixe endurecer também. Incorpore os embriões em agarose de baixo ponto de fusão, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. No entanto, desta vez, remova o embrião do tubo de 50 mililitros de agarose com uma gota menor de solução e coloque essa pequena gota em cima da gota de um mililitro no centro do prato.

Use a agulha capilar para posicionar o embrião no centro da pequena gota e mantenha sua orientação correta até que o gel esteja firme. Por fim, use uma solução de trabalho de tricaína para inundar o prato e remover o excesso de agarose. Um exemplo de um embrião de peixe-zebra injetado com codificação de mRNA para a proteína fluorescente fotoconversível kikumeGR, depois montado no estágio de 15 somitos e submetido a imagens de lapso de tempo por 12 horas é mostrado neste vídeo animado.

O corpo posterior pode se mover livremente e exibe mudanças semelhantes na morfologia observadas em embriões que podem se desenvolver livres de seu córion em condições normais de cultura. Neste vídeo, os embriões foram injetados no estágio de 16 células com mRNA que codifica a histona 2BRFP, que rotula os núcleos, e CAAXGFP, que rotula as membranas celulares. As imagens foram tiradas em um microscópio vertical multifotônico com uma objetiva de imersão em água de 25X do estágio de 10 somitos por três horas para visualizar o comportamento das células durante a formação dos botões da cauda.

As células podem ser vistas gerando saliências ativas e movimento direcional à medida que o botão da cauda se forma normalmente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em 20 minutos se feita corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante certificar-se de que o embrião esteja em posição lateral enquanto o gel de agarose está endurecendo.

Caso contrário, a região de interesse se moverá rapidamente para fora do campo de visão durante a imagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara de como montar embriões de peixe-zebra para a imagem ao vivo do alongamento posterior do corpo.