Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

O objetivo geral deste protocolo é rotular e visualizar in situ as células multiciliadas do peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia do desenvolvimento, como quais fatores regulam os multicílios nos rins embrionários do peixe-zebra? A principal vantagem desta técnica é que tanto proteínas quanto transcritos de RNA podem ser rotulados simultaneamente, o que é útil na ausência de anticorpos específicos para o peixe-zebra.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao tentar marcar células multiciliadas no pronefro ao analisar a presença de cílios após introduzir alterações no embrião. Comece fixando os embriões de peixe-zebra 24 horas após a fertilização em cinco mililitros de paraformaldeído 4% por duas a quatro horas à temperatura ambiente, sem agitação. Em seguida, lave os embriões duas vezes em PBS com Tween 20 0,1% ou PBST, seguido de uma lavagem com cinco mililitros de metanol 100%.

Em seguida, incubar os embriões em cinco mililitros de etanol fresco a 100% por pelo menos 20 minutos a menos 20 graus Celsius. Para preparar os embriões para hibridização, reidrate os neonatos em cinco mililitros de metanol a 50% e PBST por cinco minutos, seguidos por cinco minutos em cinco mililitros de metanol a 30% e PBST. Lavar os embriões duas vezes por cinco minutos cada em cinco mililitros de PBST e incubar os embriões em cinco mililitros de uma solução de proteinase K e PBST na proporção de um para 1.000 por dois minutos, imediatamente seguido por mais duas lavagens em cinco mililitros de PBST.

Fixe os embriões em cinco mililitros de paraformaldeído 4% por pelo menos 20 minutos à temperatura ambiente, seguido por duas lavagens em cinco mililitros de PBST 20. Para facilitar as interações entre os embriões e a solução de hibridização, transfira os embriões para cinco mililitros de PBST em tubos microcêntrifugos verticais com fundo plano colocados em um suporte para microcêntrifuga e lave os embriões duas vezes por cinco minutos cada em 1,5 mililitro de solução de hibridização. Após a segunda lavagem, incube os embriões em 1,5 mililitro de solução de hibridização fresca a 70 graus Celsius em uma estufa de hibridização por quatro a seis horas.

Em seguida, substitua a solução de hibridização por 10 microlitros da sonda de RNA de interesse e 500 microlitros de solução de hibridização para uma hibridização noturna a 70 graus Celsius. Na manhã seguinte, lave os embriões duas vezes em 1,5 mililitro de formamida 50% e tampão 2X de citrato de sódio e cloreto de sódio (SSC) por 20 a 30 minutos por lavagem a 70 graus Celsius. Em seguida, lave os embriões uma vez em 1,5 mililitro de 2X SSC sozinho a 70 graus Celsius por 15 minutos, seguido por duas lavagens em 1,5 mililitros de 0,2X SSC a 70 graus Celsius por 20 a 30 minutos por lavagem.

Após a segunda lavagem, substitua o SSC 0,2X por 1,5 mililitros de reagente bloqueador para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua o reagente bloqueador por 0,2 mililitros de anti-digoxina em peroxidase de rábano-picante e reagente bloqueador na proporção de um para 1.000, para uma incubação de três horas à temperatura ambiente, protegida da luz. Em seguida, lave os embriões de duas a quatro vezes em 1,5 mililitros de tampão de ácido málico, durante 10 a 15 minutos por lavagem, seguido de uma incubação noturna a quatro graus Celsius em 1,5 mililitros de tampão de ácido málico fresco.

Na manhã seguinte, substitua o tampão de ácido málico por 1,5 mililitro de PBS e lave os embriões duas vezes em 1,5 mililitro de PBS, durante cinco minutos por lavagem. Incube os embriões em 0,2 mililitro de solução fluorescente Si3 em repouso por 60 minutos, seguido por quatro lavagens consecutivas de 10 minutos em 1,5 mililitro de concentrações crescentes de metanol. Após a última incubação, incube os embriões à temperatura ambiente em 1,5 mililitro de peróxido de hidrogênio a 1% em metanol por 30 minutos.

Em seguida, lave os embriões por 10 minutos em cada lavagem com soluções descendentes de metanol em 1,5 mililitros, seguido por duas lavagens de cinco minutos em 1,5 mililitros de PBS. A seguir, lave os embriões em 1,5 mililitros de água bidestilada por cinco minutos, seguido por uma lavagem de sete minutos em 1,5 mililitros de acetona a menos 20 graus Celsius. Lave os embriões em outros 1,5 mililitros de água bidestilada por cinco minutos, seguido por uma lavagem de cinco minutos em 1,5 mililitros de PBST com 1% de DMSO ou PBDT.

Incube os embriões à temperatura ambiente em 1,5 mililitros de PBDT com 10% de FBS em um agitador durante duas horas. Em seguida, substitua o PBDT e o FBS por 1,5 mililitros dos anticorpos primários para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave os embriões em 1,5 mililitros de PBDT, FBS e cloreto de sódio 0,1 molar por um minuto com agitação, seguido por cinco lavagens de 30 minutos com agitação em 1,5 mililitros de PBDT, FBS e cloreto de sódio.

Após a última lavagem, lave os embriões uma vez com 1,5 mililitros de PBDT e soro bovino fetal apenas por 30 minutos com agitação, seguido por uma incubação noturna em 200 microlitros dos anticorpos secundários apropriados a quatro graus Celsius, protegidos da luz. Na manhã seguinte, lave rapidamente os embriões duas vezes com 1,5 mililitros de PBDT, seguido por uma incubação de 15 minutos em 1,5 mililitros de DAPI em agitador. Em seguida, lave os embriões três vezes com 1,5 mililitros de PBDT contendo soro bovino fetal e cloreto de sódio, por 15 a 20 minutos por lavagem, e armazene os embriões em 1,5 mililitros de PBDT a quatro graus Celsius, protegidos da luz ambiente.

Para imaginar os rins de peixe-zebra, posicione os embriões em posição lateral sobre lâminas de vidro em aproximadamente 10 microlitros de PBDT. Usando um par de pinças finas e um microscópio estereoscópico, comprima levemente o primeiro embrião atrás dos olhos para remover a cabeça e parte da bola de vitelo. Em seguida, remova cuidadosamente o restante da bola de vitelo do corpo do embrião.

Ao remover a bola de gema, tenha cuidado para não tocar na extensão do saco vitelino, pois o tecido de interesse rasga facilmente e está localizado diretamente acima da extensão. Use um tecido fino para remover a gema dissociada e o líquido excedente da lâmina. Em seguida, adicione uma gota de meio de montagem à cauda remanescente e posicione a cauda lateralmente.

Achate o rabo com uma lamínula e coloque a lâmina em uma caixa de lâminas tampada. Em seguida, utilize a objetiva de 60X em um microscópio confocal para obter imagens dos cílios do rim nos canais fluorescentes apropriados. Nas imagens representativas a seguir de um embrião de peixe-zebra corado conforme demonstrado, células multiciliadas podem ser identificadas com base na visualização da sonda ribonucleotídica antissenso utilizada para reconhecer a expressão do transcripto ODF3B, nos corpúsculos basais marcados com tubulina gamética e nos cílios marcados com alfa-tubulina acetilada.

De fato, com esta ampliação do pronefros embrionário, pode-se observar uma célula multiciliada com transcritos de ODF3B, múltiplos corpos basais e cílios. A célula monociliada adjacente pode ser distinguida pelo seu fenótipo de único corpo basal e único cílio. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar embriões recém-fixados e manter os espécimes protegidos da luz ambiente após a adição do primeiro anticorpo.