Name: Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a visualizar células multiciliadas em Danio rerio usando hibridização in situ e imunofluorescência combinadas. Este método permite o marcamento simultâneo de proteínas e transcritos de RNA no rim embrionário.

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Este trabalho foi financiado em parte pela subvenção R01DK100237 para RAW e o não nacional ciência Fundação pós-graduação Research Fellowship. DGE-1313583 para A.N.M. Agradecemos também a faculdade de ciência graduação pesquisa Fellowship programa de verão para suporte para Magal Gostaríamos de agradecer o centro Zebrafish pesquisa na Universidade de Notre Dame para seus cuidados dedicado de nosso zebrafish. Também gostaríamos de agradecer o departamento de ciências biológicas, bem como os membros do nosso laboratório para todos de apoio e informações valiosas.

O seguinte protocolo usa adultos zebrafish mantido e cuidadas pelo centro para a pesquisa de Zebrafish na Universidade de Notre Dame. Todos os métodos para trabalhar com embriões e zebrafish adultos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal.
1. o embrião fixação
<ol><li>Colete embriões zebrafish usando métodos anteriormente descritos39,40. Em 24 hpf, adicionar 500 µ l de solução de mistura de protease específico (50 mg/mL) para a E3 em um embrião prato incubar à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Uma vez que os embriões começam a fugir do cório, remova todo o líquido do prato embrião.</li>
	<li>Lave os embriões 2 - 3 vezes com E3 fresco adicionando cerca de 20 mL de E3, agitando suavemente o E3 no prato, e então, decantando o líquido para um recipiente de resíduos líquido.</li>
	<li>Para abater os embriões antes de corrigir, adicione 2 mL de metanosulfonato de 0,2% para o E3.</li>
	<li>Transferi os embriões em um frasco de vidro de 5 mL usando uma pipeta Pasteur de plástico. Remova a maioria da solução tricaina/E3 usando a pipeta, depois que os embriões se instalaram no fundo do frasco.</li>
	<li>Correção 24 embriões hpf com 5 mL de paraformaldeído 4% (PFA) para 2-4 h em RT, sem agitação. Cuidado: PFA é tóxico e soluções PFA devem ser tratadas sob uma capa de química enquanto o pesquisador está vestindo um jaleco, luvas e óculos de proteção. Preparação do fixador PFA do pó granulado de PFA deve ser executada com cuidados excepcionais, como o PFA granulado tende a se dispersar através de carga estática. Nota: Os embriões podem corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C. Preparar 4% PFA por aquecimento de 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) para ferver, agitando continuamente a solução para dissolver completamente o PFA granulado. Uma vez que a solução tenha arrefecido até RT, os 4% PFA é filtro esterilizado por passagem através de um sistema descartável de 0,45 µm para filtragem do vácuo, então e aliquotadas em porções de 15 mL ou 50 mL de armazenamento-20 ° c.</li>
	<li>Remova os 4% PFA e embriões de lavar duas vezes com 1 tamponada de fosfato X salina com 0.1% Tween-20 (PBST) no RT. lavar os embriões uma vez com 5 mL de 100% de metanol (MeOH) no RT. adicionar 5 mL de fresco 100% MeOH para os embriões e incubar a-20 º C pelo menos 20 min. Nota: Os embriões podem ser armazenados em 100% MeOH a-20 ° C até que esteja pronto para a preparação do embrião.</li>
</ol>2. hibridação e preparação do embrião
<ol><li>Hidratar os embriões por lavar uma vez em 5 mL de 50% MeOH em 1 x PBST durante 5 min à reidratação RT. Continue lavando os embriões em 5 mL de 30% MeOH em 1 x PBST por 5 min em RT. lavar os embriões em 5 mL de 1 x PBST duas vezes por 5 min à RT.</li>
	<li>Permeabilize os embriões incubando-os em 5 mL de uma solução de 1:1,000 de proteinase K (pK) (10 mg/mL) em 1 x PBST por 2 min em RT Nota: Os embriões mais velhos podem ser incubados mais do que 2 min na concentração pK acima referida, no entanto, uma concentração de 5 mg/mL e incubação tempo menos de 2 min é sugerido para embriões mais jovens do que 24 hpf.</li>
	<li>Remover pK solução e lave imediatamente em 5 mL de 1x PBST duas vezes em RT. fixar os embriões em 5 mL de 4% PFA em RT pelo menos 20 min. Nota: Os embriões podem corrigir em 4% PFA overnight a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o PFA e lavar duas vezes em 5 mL de 1 x PBST em RT</li>
	<li>Transferência de embriões em 5 mL de 1 x PBST para tubos de fundo plano microcentrifuga colocados em pé em um rack de microcentrifuga em RT para facilitar interações entre cada embrião e a solução de hibridação subsequentes.</li>
	<li>Lave os embriões duas vezes em 1,5 mL de solução de hibridação (Hyb +) em RT. adicionar 1,5 mL de fresco Hyb + e incubar embriões a 70 ° C em um forno de hibridização para 4-6 h.</li>
	<li>Substituir a 1,5 mL de Hyb + com um volume de solução de sonda (10 µ l do RNA sonda/500 µ l Hyb +) suficiente para cobrir completamente os embriões. Nota: Sintetiza antisentido sonda RNA usando anteriormente descritos métodos39.</li>
	<li>Cruzar a sonda durante a noite em estufa a 70 ° C hibridação com a verticalidade de tubos individuais posicionados no rack microcentrifuga, sem tremer.</li>
</ol>3. hot lavagens e bloqueio
Nota: Lava quente é executadas, colocando a solução adequada sobre os embriões e então incubar em estufa a 70 ° C. hibridação Para manter as soluções de lavagem a 70 ° C, coloque os tubos de 50 mL de cada solução no forno hibridação quando a sonda / Hyb + mistura é adicionada.
<ol><li>Retire a sonda. Lave os embriões duas vezes a 70 ° C, em 1,5 mL de 50% formamida/2x buffer de solução salina-citrato de sódio (SSC) para 20-30 min cada. Nota: A sonda pode ser armazenada Hyb + a-20 ° C e re-utilizada em uma data posterior.</li>
	<li>Lave os embriões, uma vez, a 70 ° C em 1,5 mL de 2 x SSC de 15 min. Lave os embriões duas vezes a 70 ° C, em 1,5 mL de 0,2 X SSC para 20-30 min cada. Substitua 0.2 x SSC com 1,5 mL de reagente de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C. Nota: É possível incubar bloqueio reagente em RT para 4 h em vez de durante a noite.</li>
</ol>4. anticorpo incubação e lavagens tampão de ácido maleico
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Substituir o reagente de bloqueio com 0,2 mL de anti-DIG-POD em bloqueio reagente na proporção de 1:1,000 e incubar durante 3 h sob a folha ou outra cobertura de bloqueio de luz no RT Nota: Como alternativa, o anticorpo pode incubar durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Após 3h, lave os embriões em 1,5 mL de tampão de ácido maleico, 2 - 4 vezes por 10-15 min cada em RT. Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C em 1,5 mL de tampão de fresco ácido maleico. Nota: Não é necessário incubar durante uma noite em tampão de ácido maleico, mas fazendo assim diminui a sonda fundo.</li>
</ol>5. sonda deteção e remoção de Peroxidase
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Retire o tampão de ácido maleico e substitua com 1,5 mL de 1X PBS. Lave os embriões duas vezes em 1,5 mL de 1X PBS durante 5 min cada à RT. Incubar embriões em 0,2 mL de Cy3 fluorescente coloração solução por 60 min em RT Nota: O tempo de incubação pode variar para diferentes sondas.</li>
	<li>Lave os embriões uma vez com 1,5 mL da seguinte porcentagem MeOH em 1X PBS durante 10 minutos a RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH e 100% MeOH.</li>
	<li>Incubar os embriões com 1,5 mL de 1% H2O2 em MeOH por 30 min em RT. Wash os embriões uma vez com 1,5 mL das seguintes soluções MeOH em 1X PBS durante 10 minutos a RT: 75% MeOH, 50% MeOH e 30% MeOH. Lave os embriões duas vezes por 5 min cada a RT em 1,5 mL de 1X PBS. Nota: Os embriões podem ser armazenados em PBS durante a noite a 4° C.</li>
</ol>6. imunofluorescência
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Lave os embriões em 1,5 mL de DDQ2O por 5 min em RT. Wash os embriões em 1,5 mL de acetona pre-refrigerada (mantida a-20 ° C) para 7 min em RT. lavar os embriões, uma vez em 1,5 mL de DDQ2O por 5 min em RT. Wash os embriões, uma vez em 1.5 mL de 1 x PBST com 1% DMSO (PBDT) durante 5 min à RT</li>
	<li>Incube os embriões em 1,5 mL de PBDT + 10% de soro fetal bovino (FBS) sobre um roqueiro em RT para 2h.</li>
	<li>Remover PBDT + FBS e substituir com 1,5 mL de anticorpos primários, antiacetilado tubulina (produzido a partir do mouse) e anti-γ-tubulina (produzido a partir de coelho), diluída-se juntos em 1: 400 em PBDT + 1% FBS. Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C. Nota: Tempos de incubação podem variar dependendo do anticorpo primário. Teste de intervalos de tempo diferentes pode ser necessário para otimizar a rotulagem.</li>
</ol>7. secundário anticorpo
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Para remover o excesso anticorpo desacoplado de embriões, lavar em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl por 1 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Lave os embriões 5 vezes em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl por 30 min em uma cadeira de balanço em RT. lava os embriões em 1,5 mL de PBDT + 1% FBS por 30 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Incubar os embriões durante a noite a 4 ° C, em 200 µ l dos anticorpos secundários, Alexa 488 cabra anti-rato IgG e Alexa 647 cabra anti-IgG de coelho, diluída juntos em PBDT no 1: 500.</li>
</ol>8. DAPI coloração
Nota: Manter protegidos da luz ambiente de embriões.
<ol><li>Lave os embriões rapidamente a RT em 1,5 mL de PBDT duas vezes. Substituir PBDT com 1,5 mL de DAPI, dilui-se 1:15000 em 1 X de PBST e incubar 15 min em RT sobre um roqueiro.</li>
	<li>Lave os embriões em 1,5 mL de PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl três vezes em RT para 15-20 min cada. Armazenar os embriões em 1,5 mL de PBDT a 4 ° C até que esteja pronto para montagem e imagem.</li>
</ol>9. montagem e imagens para Pronephros de Zebrafish
<ol><li>Lateral do embrião leigos na lâmina de vidro em um pequeno volume, cerca de 10 µ l, de PBDT.</li>
	<li>Esprema o embrião atrás dos olhos com um par de pinças bem para remover a cabeça e alguns da esfera de gema.</li>
	<li>Use a pinça fina para raspar suavemente a bola gema restante do corpo do embrião. Retire a gema dissociada e líquido extra do slide com um tecido fino.</li>
	<li>Adicionar uma gota de mídia para a restante de cauda do embrião de montagem e posicione de modo que a cauda é colocada lateralmente. Coloque uma lamela em cima da cauda para achatar a amostra e, em seguida, coloque em uma caixa de slides coberto.</li>
	<li>Cílios de rim na ampliação de X 60 em um microscópio confocal, usando os seguintes canais de imagem: DAPI em azul (conjunto no 408.0 a laser nm), FITC em verde (conjunto no 488.0 a laser nm), Cy3 tingir-etiquetados em vermelho (laser conjunto no 561.0 nm) e Alexa 680 em branco (conjunto no 637.0 a laser nm).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo detalhado acima é otimizado para a rotulagem MCCs na pronephros com transcrições de odf3b e α-tubulina em 24 embriões de zebrafish hpf. Para os melhores resultados, é recomendável usar embriões recém fixos e preparados. Os embriões que foram fixados e armazenados em MeOH ou Hyb + a-20 ° C por mais de uma semana podem ser usados, mas a probabilidade de fundo indesejado coloração aumenta com o tempo que os embriões são mantidos no armazenamento.
Modificações e solução de problemas desta técnica são necessários para adaptar esse método para outros conjuntos de marcadores particulares, por exemplo, outros riboprobes antisentido e outros anticorpos. Muitos métodos para ajustar os parâmetros das etapas no processo de hibridação de toda montagem in situ têm sido documentadas anteriormente pelo nosso grupo e outros31,34,36,38, 39. Da mesma forma, cada anticorpo da proteína vai exigir um pouco de solução de problemas em termos de coloração vezes e intervalos aproximados de diluições e tempos de incubação para cada anticorpo primário são melhor estimados pela avaliação de resultados documentados28, 35. para embriões mais jovens do que 24 hpf, tratamento de pK deve ser inferior a 2 min, onde mais de 24 embriões hpf deve ser tratados com pK por mais de 2 min. Além disso, os embriões mais velhos do que 24 hpf deve ser branqueada de pigmento antes do tratamento de pK.
Após a coloração com a solução de coloração fluorescente, é fundamental para remover qualquer mancha remanescente, anticorpo e peroxidases, realizando a série de lavagens de metanol e água oxigenada. As lavagens de PBS imediatamente a seguir são vitais para remover o metanol em excesso de embriões. Importante, antes de prosseguir com os anticorpos se, encontramos que a acetona e água desionizada lavagens fazem os menos propensos a aderir a um outro e/ou os tubos de centrífuga de embriões. Em nossa experiência, anticorpos para fatores de transcrição específicos e outros genes, embora eles podem trabalhar eficientemente borrões ocidentais, não funcionam bem pelo IF o zebrafish. No entanto, proteínas altamente conservadas e abundantes, como α-tubulina e β-catenina, funcionam bem no zebrafish para se16,37.
Com peixes, é possível visualizar os transcritos de RNA de genes que ainda não tem anticorpos específicos no zebrafish. Combinando peixes com se, como demonstrado pelo presente protocolo, localização co de transcritos de RNA e proteína pode ser visto na vivo (Figura 2). A natureza flexível do protocolo permite a rápida resolução de problemas para a visualização de diversas transcrições de RNA e proteínas em diversos tecidos e pontos de tempo. Quando combinado com os traços já respeitados de embriões de peixe-zebra, este protocolo de peixe + se oferece outra ferramenta para explorar a expressão dos genes e proteínas importantes para o Regulamento do caminho do desenvolvimento.

Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um organismo modelo principal para estudar a biologia do desenvolvimento. Os embriões desenvolvem-se fora da mãe e são opticamente transparentes. Além disso, ocorre a formação de órgãos vitais como o olho, rim e cérebro anterior rapidamente, com estruturas formadas por apenas 24h pós fertilização (hpf). Importante, o genoma de zebrafish é altamente conservado com mamíferos1,2,3. Além disso, o zebrafish e órgãos de mamíferos têm anatomia e fisiologia similares. O zebrafish rim embrionário, ou pronephros, demonstra o valor do sistema modelo para examinar a função dos genes durante a nephrogenesis precoce e determinação do destino das populações de células epiteliais conservada do néfron vertebrados4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. da mesma forma, o embrião de zebrafish tornou-se cada vez mais importante ao analisar a ontogenia dos MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Como seu nome sugere, MCCs são células epiteliais, caracterizadas por um conjunto de cílios motile localizado sobre a superfície apical17. No zebrafish, MCCs funcionam no fluxo de fluido em são dispersos em um "sal e pimenta" como a moda em todo o meio de cada néfron do pronephros por 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. embora eles só foram anotados em um punhado de rim humano doença casos,18,19,20,21, MCCs são predominantes em outros tecidos de mamíferos como o cérebro e traqueia22,23,24, que apresenta uma série de desafios para o projeto experimental. Estudos elegantes em vários modelos de vertebrados, incluindo o zebrafish demonstraram uma via conservada do destino do MCC, com o entalhe de sinalização via como inibidor da MCC desenvolvimento12,17,25 ,26,,27. Portanto, o zebrafish pronephros fornece um modelo facilmente acessível para estudar os mecanismos genéticos de MCC desenvolvimento na vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparência e fácil manipulação genética de embriões de zebrafish provaram para ser inestimáveis traços ao estudar as vias genéticas e moleculares que regulam o destino da célula, crescimento do tecido e o desenvolvimento do início embrião1,2 ,3. Como tais, as técnicas tradicionais Visualizar transcrições da proteína e do gene, tais como a hibridação in situ e toda montagem se, tem sido aplicado a e otimizado para o zebrafish16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando protocolos populares para peixe e se, é possível rotular e analisar MCCs na vivo16,28,37,38.

<table><tbody><tr><td>solução de mistura de protease não específica</td><td>Roche</td><td>11459643001, pronase de Streptomyces griseus</td><td>Diluir em E3 <forte>sem</forte> azul de metileno para fazer solução estoque de 50mg/mL; armazenar a -20&deg; Solução C</td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>Diluir 50X E3 (250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 em água destilada) em água destilada; adicionar 1 x 10-5 M azul de metileno (sigma M9140) para inibir a contaminação</td></tr><tr><td>tricaína (etil 3-aminobenzoato metanossulfonato)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>Para fazer uma solução estoque a 0,2%, dissolva 1 g de pó de tricaína em 10 mL de Tris, pH 9,5 e água destilada até 500 mL</td></tr><tr><td>placas de embriões</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>frascos de vidro de 5 mL Pipetas</td> de Pasteur <td>de plástico</td> descartável <td>Wheaton</td> 225012 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído (PFA) a 4% Serviços de</td><td>microscopia eletrônica</td><td>19210</td><td>Dissolva 4% de PFA em 1X PBS e leve para ferver sob uma coifa. Esfrie e alíquota e armazene a -20 graus C. Não congele novamente depois de descongelado para uso.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Dilua em água destilada para fazer um estoque 1X</td></tr><tr><td>Tween-20 estoque</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Faça um estoque Tween-20 de 0,1% diluindo em água destilada.</td></tr><tr><td>1X solução salina tamponada com fosfato com 0,1% Tween 20 (PBST)</td> <td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0,1% Tween-20 em 1X</td></tr><tr><td>PBS metanol (MeOH)</td> <td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>Dissolva em água destilada para fazer um estoque de 10 mg / mL; alíquota e armazene a -20 graus; C</td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de fundo plano</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>armazenar a -20&deg; Solução de</td></tr><tr><td>hibridização C (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50% formamida, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/mL de RNA de torula de levedura, 50 &mu; g/&mu; L heparina; loja a -20&deg; C</td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X solução tampão de citrato de sódio-sódio (SSC)</td> A <td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>diluir em água destilada para fazer 2X e 0,2X estoques</td></tr><tr><td>bloqueando a solução reagente</td><td>. A Roche</td><td>11096176001</td><td>diluir em tampão de ácido maleico para fazer uma solução estoque a 10%; armazenar a 4&deg; C</td></tr><tr><td>solução tampão de ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375 e S7653</td><td>150mM ácido maleico, 100mM NaCl (pH 7.5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigenina-POD, fragmentos de Fab</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>armazenar a 4&deg; Solução</td></tr><tr><td>de coloração fluorescente C Cy3</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 sistema</td><td>de armazenamento em 4&deg; C; prepare a solução de coloração fresca fazendo uma diluição de 1:50 do reagente TSA (dissolvido em 60 uL de DMSO) no tampão do kit</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>armazene a 4&deg; </td></tr><tr><td>Água destilada de grau molecular C (ddH2O)</td> <td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>acetona</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>armazena uma alíquota a -20&deg; C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>alíquota e armazenar a -20&deg; C</td></tr><tr><td>monoclonal anti-acetilada tubulina clone 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>alíquota e armazenar a -20&deg; C</td></tr><tr><td>anti-&gama;-tubulina anitbody produzido em alíquota</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td> de coelho <td>e armazenar a -20&deg; C</td></tr><tr><td>odf3b clone de cDNA MGC:63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGEM:6792478</td><td>armazenar estoque de glicerol bacteriano a -80&deg; C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa farinha 647 cabra anti-coelho IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>loja em 4&deg; C; proteger da luz</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 cabra anti-rato IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>loja em 4&deg; C; proteger da luz</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>alíquota e armazenar a -20&deg; </td></tr><tr><td>Corrediça de vidro</td> C <td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>lamínula de vidro</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>pinça fina</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pinça Padrão #55</td></tr><tr><td>mídia de montagem</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, loja Aqua-Poly/Mount</td><td>em 4&deg; C</td></tr><tr><td>e software</td><td></td><td></td> associado <td>Usamos um microscópio confocal Nikon C2plus com elementos NIS-software</td></tr><tr><td>AR rocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de células multiciliated no zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente in situ da hibridação e imunofluorescência

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Nos últimos anos, o embrião de zebrafish tem emergido como um modelo popular para estudar a biologia do desenvolvimento, devido a características como ex utero desenvolvimento do embrião e transparência óptica. Em particular, o embrião de zebrafish tornou-se um organismo importante estudar organogênese de vertebrados nos rins, bem como desenvolvimento de célula multiciliated (MCC). Para visualizar as MCCs no rim embrionário zebrafish, temos desenvolvido um protocolo combinado de hibridação toda montagem fluorescente em situ (FISH) e montar toda a imunofluorescência (IF) que permite a geração de imagens de alta resolução. Este manuscrito descreve nossa técnica para localização de transcritos de RNA e proteína co como uma ferramenta para entender melhor o Regulamento dos programas de desenvolvimento através da expressão de vários fatores de linhagem.

Zebrafish do selvagem-tipo embriões foram fixados em 24 hpf e imediatamente preparado como descrito acima. Figura 1 mostra um fluxo de trabalho experimental juntamente com fases ilustrados selecionados. O fluxo de trabalho descrito nas etapas 1-8 engloba os processos de aquisição de amostra, fixação e manipulação do tecido fixo para rotular transcrições endógenas com antisentido riboprobes seguido por imunofluorescência para rótulo somáticas de interesse. Etapa 9 do fluxo de trabalho refere-se a montagem imagem e técnicas desenvolvidas especificamente para otimizar a visualização do tronco embrionárias zebrafish. Nos desenhos que acompanham a etapa 9, ilustraremos o método de manipulação para posicionamento do tecido em uma lâmina de vidro. Nesta etapa, a bola de cabeça e gema de embrião são removidos, deixando a cauda deve ser posicionado lateralmente entre uma lâmina de vidro e lamela. Remoção de gema bola de cabeça é sugerida para a melhor imagem da população residente de MCC no pronephros, como a bola de gema autofluorescente e obstruir o processo de montagem.
Obtidos usando um microscópio confocal de imagens representativas são fornecidas na Figura 2, que mostra o mesmo embrião do selvagem-tipo ampliação de 60 X e um zoom digital com a mesma ampliação. Os painéis superiores fornecem imagens de cada canal individual, enquanto os parte inferior dois painéis são a composto sobreposição destes dados de imagem. Caixa branca (na imagem da coluna da esquerda) descreve a área que é o foco do zoom digital (a imagem da coluna da direita). Destaque no painel final do zoom digital, núcleos foram rotulados em DAPI e MCCs foram detectados com base em um riboprobe antisentido projetado para reconhecer odf3b, onde os anticorpos de γ-tubulina denotam os corpos basais e α-tubulina denota os cílios. O zoom digital da sobreposição composto, o círculo amarelo tracejado indica o perímetro de uma MCC, que foi identificada devido a posse de transcrições de odf3b , vários corpos basais e cílios. Célula adjacente mono-ciliadas, marcada com um círculo pontilhado amarelo, foi identificada baseia o fenótipo de possuir um único corpo basal e um único cílio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figura 1: esquemático do fluxograma experimental. Este fluxograma mostra um fluxo de trabalho experimental, acompanhados de ilustrações de estágios críticos em que o floco de neve indica incubação fria, as três linhas curvas representam o calor e o relógio representa tempos de incubação longa. O fluxo de trabalho pode ser executado em um mínimo de 6 dias (número de dias no canto superior direito de cada fase do processo), embora algumas etapas podem ser executadas durante períodos de tempo mais longos, como observado no protocolo. Uma descrição detalhada do processo de montagem é retirada, demonstrando a cauda do embrião montado final entre a lâmina de vidro e lamela. Uma preta caixa tracejada descreve a área que é fotografada na ampliação de X 60. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figura 2: representante resultados para poder visualizar MCCs de pronephros o zebrafish. Projeções de imagem máxima de um embrião de zebrafish do selvagem-tipo 24 hpf em 60 X de ampliação, bem como sobre a ampliação de 60 X do embrião mesmo confocal, um zoom digital. As caixas brancas indicam a área voltada para o zoom. Manchas individuais de DAPI (núcleos), odf3b (MCC), γ-tubulina (corpos basais) e α-tubulina (cílios) são etiquetadas e então fundiram-se os painéis de fundo dois. O zoom digital, nós fornecemos aproximações dos locais de célula como segue: um MCC é descrito pelo tracejado círculo amarelo, e o círculo pontilhado amarelo descreve uma célula mono-ciliadas. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

O objetivo geral deste protocolo é rotular e visualizar in situ as células multiciliadas do peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia do desenvolvimento, como quais fatores regulam os multicílios nos rins embrionários do peixe-zebra? A principal vantagem desta técnica é que tanto proteínas quanto transcritos de RNA podem ser rotulados simultaneamente, o que é útil na ausência de anticorpos específicos para o peixe-zebra.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao tentar marcar células multiciliadas no pronefro ao analisar a presença de cílios após introduzir alterações no embrião. Comece fixando os embriões de peixe-zebra 24 horas após a fertilização em cinco mililitros de paraformaldeído 4% por duas a quatro horas à temperatura ambiente, sem agitação. Em seguida, lave os embriões duas vezes em PBS com Tween 20 0,1% ou PBST, seguido de uma lavagem com cinco mililitros de metanol 100%.Em seguida, incubar os embriões em cinco mililitros de etanol fresco a 100% por pelo menos 20 minutos a menos 20 graus Celsius. Para preparar os embriões para hibridização, reidrate os neonatos em cinco mililitros de metanol a 50% e PBST por cinco minutos, seguidos por cinco minutos em cinco mililitros de metanol a 30% e PBST. Lavar os embriões duas vezes por cinco minutos cada em cinco mililitros de PBST e incubar os embriões em cinco mililitros de uma solução de proteinase K e PBST na proporção de um para 1.000 por dois minutos, imediatamente seguido por mais duas lavagens em cinco mililitros de PBST.Fixe os embriões em cinco mililitros de paraformaldeído 4% por pelo menos 20 minutos à temperatura ambiente, seguido por duas lavagens em cinco mililitros de PBST 20. Para facilitar as interações entre os embriões e a solução de hibridização, transfira os embriões para cinco mililitros de PBST em tubos microcêntrifugos verticais com fundo plano colocados em um suporte para microcêntrifuga e lave os embriões duas vezes por cinco minutos cada em 1,5 mililitro de solução de hibridização. Após a segunda lavagem, incube os embriões em 1,5 mililitro de solução de hibridização fresca a 70 graus Celsius em uma estufa de hibridização por quatro a seis horas.Em seguida, substitua a solução de hibridização por 10 microlitros da sonda de RNA de interesse e 500 microlitros de solução de hibridização para uma hibridização noturna a 70 graus Celsius. Na manhã seguinte, lave os embriões duas vezes em 1,5 mililitro de formamida 50% e tampão 2X de citrato de sódio e cloreto de sódio (SSC) por 20 a 30 minutos por lavagem a 70 graus Celsius. Em seguida, lave os embriões uma vez em 1,5 mililitro de 2X SSC sozinho a 70 graus Celsius por 15 minutos, seguido por duas lavagens em 1,5 mililitros de 0,2X SSC a 70 graus Celsius por 20 a 30 minutos por lavagem.Após a segunda lavagem, substitua o SSC 0,2X por 1,5 mililitros de reagente bloqueador para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua o reagente bloqueador por 0,2 mililitros de anti-digoxina em peroxidase de rábano-picante e reagente bloqueador na proporção de um para 1.000, para uma incubação de três horas à temperatura ambiente, protegida da luz. Em seguida, lave os embriões de duas a quatro vezes em 1,5 mililitros de tampão de ácido málico, durante 10 a 15 minutos por lavagem, seguido de uma incubação noturna a quatro graus Celsius em 1,5 mililitros de tampão de ácido málico fresco.Na manhã seguinte, substitua o tampão de ácido málico por 1,5 mililitro de PBS e lave os embriões duas vezes em 1,5 mililitro de PBS, durante cinco minutos por lavagem. Incube os embriões em 0,2 mililitro de solução fluorescente Si3 em repouso por 60 minutos, seguido por quatro lavagens consecutivas de 10 minutos em 1,5 mililitro de concentrações crescentes de metanol. Após a última incubação, incube os embriões à temperatura ambiente em 1,5 mililitro de peróxido de hidrogênio a 1% em metanol por 30 minutos.Em seguida, lave os embriões por 10 minutos em cada lavagem com soluções descendentes de metanol em 1,5 mililitros, seguido por duas lavagens de cinco minutos em 1,5 mililitros de PBS. A seguir, lave os embriões em 1,5 mililitros de água bidestilada por cinco minutos, seguido por uma lavagem de sete minutos em 1,5 mililitros de acetona a menos 20 graus Celsius. Lave os embriões em outros 1,5 mililitros de água bidestilada por cinco minutos, seguido por uma lavagem de cinco minutos em 1,5 mililitros de PBST com 1% de DMSO ou PBDT.Incube os embriões à temperatura ambiente em 1,5 mililitros de PBDT com 10% de FBS em um agitador durante duas horas. Em seguida, substitua o PBDT e o FBS por 1,5 mililitros dos anticorpos primários para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave os embriões em 1,5 mililitros de PBDT, FBS e cloreto de sódio 0,1 molar por um minuto com agitação, seguido por cinco lavagens de 30 minutos com agitação em 1,5 mililitros de PBDT, FBS e cloreto de sódio.Após a última lavagem, lave os embriões uma vez com 1,5 mililitros de PBDT e soro bovino fetal apenas por 30 minutos com agitação, seguido por uma incubação noturna em 200 microlitros dos anticorpos secundários apropriados a quatro graus Celsius, protegidos da luz. Na manhã seguinte, lave rapidamente os embriões duas vezes com 1,5 mililitros de PBDT, seguido por uma incubação de 15 minutos em 1,5 mililitros de DAPI em agitador. Em seguida, lave os embriões três vezes com 1,5 mililitros de PBDT contendo soro bovino fetal e cloreto de sódio, por 15 a 20 minutos por lavagem, e armazene os embriões em 1,5 mililitros de PBDT a quatro graus Celsius, protegidos da luz ambiente.Para imaginar os rins de peixe-zebra, posicione os embriões em posição lateral sobre lâminas de vidro em aproximadamente 10 microlitros de PBDT. Usando um par de pinças finas e um microscópio estereoscópico, comprima levemente o primeiro embrião atrás dos olhos para remover a cabeça e parte da bola de vitelo. Em seguida, remova cuidadosamente o restante da bola de vitelo do corpo do embrião.Ao remover a bola de gema, tenha cuidado para não tocar na extensão do saco vitelino, pois o tecido de interesse rasga facilmente e está localizado diretamente acima da extensão. Use um tecido fino para remover a gema dissociada e o líquido excedente da lâmina. Em seguida, adicione uma gota de meio de montagem à cauda remanescente e posicione a cauda lateralmente.Achate o rabo com uma lamínula e coloque a lâmina em uma caixa de lâminas tampada. Em seguida, utilize a objetiva de 60X em um microscópio confocal para obter imagens dos cílios do rim nos canais fluorescentes apropriados. Nas imagens representativas a seguir de um embrião de peixe-zebra corado conforme demonstrado, células multiciliadas podem ser identificadas com base na visualização da sonda ribonucleotídica antissenso utilizada para reconhecer a expressão do transcripto ODF3B, nos corpúsculos basais marcados com tubulina gamética e nos cílios marcados com alfa-tubulina acetilada.De fato, com esta ampliação do pronefros embrionário, pode-se observar uma célula multiciliada com transcritos de ODF3B, múltiplos corpos basais e cílios. A célula monociliada adjacente pode ser distinguida pelo seu fenótipo de único corpo basal e único cílio. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar embriões recém-fixados e manter os espécimes protegidos da luz ambiente após a adição do primeiro anticorpo.

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Técnicas são descritas a imunocoloração fosfo-epitopos em embriões de peixe-zebra inteiros e em seguida, realizar duas cores localização confocal fluorescente em estruturas celulares tão pequenos quanto cílios. As técnicas de fixação e de imagem pode definir a localização e cinética da aparência ou a activação de proteínas específicas.

Imunocoloração fosfo-epitopos em ciliadas Órgãos da Whole Mount embriões Zebrafish

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de proteínas mediadas por anticorpos fluorescentes em preparações inteiras de embriões e larvas de zebrafish.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

Aprenda a visualizar células multiciliadas em Danio rerio usando hibridização in situ e imunofluorescência combinadas. Este método permite o marcamento simultâneo de proteínas e transcritos de RNA no rim embrionário.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

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