Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

O objetivo geral deste protocolo é rotular e visualizar células multiciliadas do peixe-zebra in situ. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como quais fatores regulam os sulfatos multiciliados no rim embrionário do peixe-zebra? A principal vantagem dessa técnica é que os transcritos de proteína e RNA podem ser marcados simultaneamente, o que é útil na ausência de anticorpos específicos para o peixe-zebra.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando fomos rotular células multiciliadas no pronefro enquanto analisávamos a presença de cílios após fazer alterações no embrião. Comece fixando os embriões de peixe-zebra 24 horas após a fertilização em cinco mililitros de paraformaldeído a 4% por duas a quatro horas em temperatura ambiente sem agitação. Em seguida, lave os embriões duas vezes em PBS com 0,1% Tween 20 ou PBST seguido de uma lavagem com cinco mililitros de metanol 100%.

Em seguida, incube os embriões em cinco mililitros de etanol fresco a 100% por pelo menos 20 minutos a menos 20 graus Celsius. Para preparar os embriões para a hibridização, reidratar os neonatos em cinco mililitros de 50% de metanol e PBST por cinco minutos, seguidos de cinco minutos em cinco mililitros de 30% de metanol e PBST. Lave os embriões duas vezes por cinco minutos cada em cinco mililitros de PBST e incube os embriões em cinco mililitros de uma solução de proteinase K e PBST de um para 1.000 por dois minutos imediatamente seguidos por mais duas lavagens em cinco mililitros de PBST.

Fixe os embriões em cinco mililitros de paraformaldeído a 4% por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente, seguido de duas lavagens em cinco mililitros de PBST 20. Para facilitar as interações entre os embriões e a solução de hibridização, transfira os embriões para cinco mililitros de PBST em tubos de microcentrífuga de fundo plano vertical em um rack de microcentrífuga e lave os embriões duas vezes por cinco minutos cada em 1,5 mililitros de solução de hibridização. Após a segunda lavagem, incube os embriões em 1,5 mililitros de solução de hibridização fresca a 70 graus Celsius em um forno de hibridização por quatro a seis horas.

Em seguida, substitua a solução de hibridização por 10 microlitros de sonda de RNA de interesse e 500 microlitros de solução de hibridização para uma hibridização de sonda noturna a 70 graus Celsius. Na manhã seguinte, lave os embriões duas vezes em 1,5 mililitros de 50% de formamida e tampão de citrato de sódio 2X ou SSC por 20 a 30 minutos por lavagem a 70 graus Celsius. Em seguida, lave os embriões uma vez em 1,5 mililitro de SSC 2X sozinho a 70 graus Celsius por 15 minutos, seguido de duas lavagens em 1,5 mililitros de SSC 0,2X a 70 graus Celsius por 20 a 30 minutos por lavagem.

Após a segunda lavagem, substitua o SSC 0,2X por 1,5 mililitros de reagente bloqueador para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua o reagente bloqueador por 0,2 mililitros de antidigoxina na peroxidase de rábano e reagente bloqueador na proporção de um para 1.000 para uma incubação de três horas em temperatura ambiente protegida da luz. Em seguida, lave os embriões duas a quatro vezes em 1,5 mililitros de tampão de ácido málico por 10 a 15 minutos por lavagem, seguido de uma incubação noturna a quatro graus Celsius em 1,5 mililitros de tampão de ácido málico fresco.

Na manhã seguinte, substitua o tampão de ácido málico por 1,5 mililitros de PBS e lave os embriões duas vezes em 1,5 mililitros de PBS por cinco minutos por lavagem. Incubar os embriões em 0,2 mililitros de solução fluorescente Si3 por 60 minutos, seguido por quatro lavagens consecutivas de 10 minutos em 1,5 mililitros de concentrações ascendentes de metanol. Após a última incubação, incubar os embriões em temperatura ambiente em 1,5 mililitros de peróxido de hidrogênio a 1% e metanol por 30 minutos.

Em seguida, lave os embriões por 10 minutos por lavagem em 1,5 mililitros de soluções descendentes de metanol, seguidas de duas lavagens de cinco minutos em 1,5 mililitros de PBS. Em seguida, lave os embriões em 1,5 mililitros de água bidestilada por cinco minutos, seguido de uma lavagem de sete minutos em 1,5 mililitros de acetona a menos 20 graus Celsius. Lave os embriões em mais 1,5 mililitros de água bidestilada por cinco minutos, seguido de uma lavagem de cinco minutos em 1,5 mililitros de PBST com 1% de DMSO ou PBDT.

Incubar os embriões em temperatura ambiente em 1,5 mililitros de PBDT com 10% de FBS em uma espreguiçadeira por duas horas. Em seguida, substitua o PBDT e o FBS por 1,5 mililitros dos anticorpos primários para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave os embriões em 1,5 mililitros de PBDT, FBS e cloreto de sódio 0,1 molar por um minuto com balanço, seguido de cinco lavagens de balanço de 30 minutos em 1,5 mililitros de PBDT, FBS e cloreto de sódio.

Após a última lavagem, lave os embriões uma vez em 1,5 mililitros de PBDT e FBS apenas por 30 minutos com balanço seguido de uma incubação noturna em 200 microlitros dos anticorpos secundários apropriados a quatro graus Celsius protegidos da luz. Na manhã seguinte, lave rapidamente os embriões duas vezes em 1,5 mililitros de PBDT, seguido de uma incubação de 15 minutos em 1,5 mililitros de DAPI em uma balancim. Em seguida, lave os embriões três vezes em 1,5 mililitros de PBDT com FBS e cloreto de sódio por 15 a 20 minutos por lavagem e armazene os embriões em 1,5 mililitros de PBDT a quatro graus Celsius protegidos da luz ambiente.

Para obter imagens dos rins do peixe-zebra, coloque os embriões lateralmente em lâminas de vidro em aproximadamente 10 microlitros de PBDT. Usando uma pinça fina e um microscópio de dissecação, aperte o primeiro embrião atrás dos olhos para remover a cabeça e um pouco da bola vitelosa. Em seguida, raspe suavemente a gema restante do corpo do embrião.

Ao remover a bola vitelosa, tome cuidado para não tocar na extensão do saco vitelino, pois o tecido de interesse se rasga facilmente e está localizado diretamente acima da extensão. Use um lenço fino para remover a gema dissociada e o líquido extra da lâmina. Em seguida, adicione uma gota de meio de montagem à cauda restante e posicione a cauda lateralmente.

Achate a cauda com uma lamínula e coloque a lâmina em uma caixa de corrediça coberta. Em seguida, use a objetiva 60X em um microscópio confocal para obter imagens dos cílios do rim nos canais fluorescentes apropriados. Nas seguintes imagens representativas de um embrião de peixe-zebra corado como acabamos de demonstrar, as células multiciliadas podem ser identificadas com base na visualização da ribossonda antisense usada para reconhecer a expressão do transcrito ODF3B, a tubulina do gameta marcada com corpos basais e os cílios marcados com tubulina alfa acetilada.

De fato, nesta ampliação do pronefro embrionário, uma célula multiciliada com transcritos ODF3B, vários corpos basais e cílios podem ser observados. A célula monociliada adjacente pode ser distinguida por seu único corpo basal e fenótipo único de cílio. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar embriões recém-fixados e manter as amostras protegidas da luz ambiente após a adição do primeiro anticorpo.