Montagem em ágar: um método básico de montagem de embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo

- Comece adicionando agarose de ponto de fusão médio a baixo E3 e aquecendo até que a agarose se dissolva completamente. Resfrie a agarose a 37 graus Celsius e adicione a solução de tricaína. Em seguida, anestesiar os embriões adicionando tricaína a uma placa de Petri contendo embriões em meio E3. Gire a placa de Petri para coletar os embriões no meio.

Usando uma pipeta de transferência, retire um embrião com uma quantidade mínima de meio. Segure a pipeta na posição vertical e faça o embrião saltar para posicioná-lo na ponta da pipeta. Agora coloque o embrião na solução de agarose sem adicionar nenhum excesso de meio, o que diluiria a agarose e evitaria a gelificação. Misture suavemente o embrião dentro da agarose e transfira a solução para o poço de uma placa de imagem usando a pipeta.

Coloque a placa sob um microscópio e use uma ponta de pipeta para posicionar o embrião na orientação desejada. Assim que a agarose solidificar, despeje o meio E3 contendo tricaína em cima dele para manter o ágar hidratado e obter uma imagem do embrião. Em um protocolo de exemplo, montaremos embriões de peixe-zebra parabióticos para imagem e análise.

Para adquirir imagens dos embriões fundidos, prepare agarose de baixo ponto de fusão a 0,8%. Enquanto ainda estiver quente, alíquota de um mililitro da agarose em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro colocados em um bloco de aquecimento de 37 graus Celsius. Anestesiar os embriões parabióticos adicionando 1 mililitro de 4 miligramas por mililitro pH 7,0 tricaína aos 25 mililitros de meio E3 contendo os embriões. Gire suavemente o prato para que os embriões se acumulem no meio.

Em seguida, usando uma pipeta de transferência de plástico de ponta larga, retire os embriões com o mínimo de líquido possível. Em seguida, vire a pipeta na vertical e salte suavemente os embriões para que eles se acomodem no fundo da pipeta. Em seguida, transferir os embriões para uma alíquota de 1 mililitro de agarose de baixo ponto de fusão, tocando levemente a ponta da pipeta na superfície da agarose. Descarte o excesso de líquido da pipeta e use-a para misturar suavemente os embriões na agarose.

Em seguida, com a pipeta, transfira a agarose e os embriões para o poço de uma placa de seis poços com fundo de vidro. Sob um microscópio estéreo, use uma ponta de carregamento de gel fixada na extremidade de uma agulha de provocação para posicionar os embriões próximos à lamínula e na orientação desejada para a imagem. Depois que a agarose endurecer e o meio com tricaína for adicionado aos poços, use um microscópio confocal de varredura a laser de epifluorescência de campo amplo invertido ou um microscópio confocal de disco giratório para adquirir imagens.

Para um campo de visão de embrião inteiro, use um subjetivo 4x. Use uma objetiva de 20x para obter imagens de um tecido específico. Processe as imagens de acordo com o protocolo de texto.