Quantificação rápida de blastogénese induzida por Mitogénio em linfócitos T para identificar drogas imunomoduladoras

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a potência de drogas imunomoduladoras usando um contador de células automatizado, medindo a blastogênese de linfócitos T ou a transformação de blastos. Este ensaio fornece um método rápido para quantificar a ativação de linfócitos T usando um contador de células automatizado equipado para medir os diâmetros das células. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a medição rápida, simples e direta de células únicas, ao contrário dos ensaios comuns de proliferação de linfócitos T.

O tratamento de linfócitos com drogas imunomoduladoras aumentará ou diminuirá a taxa e a extensão da blastogênese celular. Usando o ensaio de contador de células, a extensão dessa blastogênese pode ser medida em aproximadamente quatro minutos por amostra. Dentro de dez minutos após o sacrifício, borrife o abdômen do camundongo com 70% de etanol e use uma tesoura para fazer uma incisão no pelo e na pele do lado esquerdo do animal.

Mantenha a pele separada e para trás para revelar o peritônio. Em seguida, aplique uma clorexidina a quatro por cento no local da incisão. Usando um segundo conjunto de tesouras e pinças, faça um corte de dois a três centímetros ao longo do abdômen central para abrir o peritônio.

Em seguida, remova as ligações viscerais e o excesso de gordura ao redor do baço e transfira o tecido para um recipiente de DPBS. Em seguida, adicione dez mililitros de meio RPMI 1640 completo a uma placa de cultura de dez centímetros e esmague os baços entre duas lâminas de vidro fosco esterilizadas. Filtre a pasta de tecido através de um filtro de células de náilon estéril de 40 mícrons em uma nova placa de cultura de dez centímetros para remover os tecidos conjuntivos e detritos e transfira a suspensão de célula única para um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação.

Ressuspenda o pellet em 20 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Após dez minutos à temperatura ambiente com balanço suave, recolher as células com outra centrifugação e ressuspender o pellet em dez mililitros de meio fresco. Em seguida, centrifugue as células novamente para ressuspensão em dois mililitros de meio completo de 37 graus Celsius.

Para purificar as células T, primeiro lave uma a duas colunas de lã de náilon por baço duas vezes com cinco mililitros de RPMI completo e coloque as colunas em uma incubadora de cultura de células de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e cinco por cento por cento por uma hora. No final da incubação, carregar dois mililitros da suspensão isolada de esplenócitos no topo de cada coluna e deixar as células passarem pela coluna até que o líquido atinja o topo da lã. Em seguida, adicione dois mililitros de meio fresco a 37 graus Celsius no topo das colunas e deixe o meio passar pela lã de náilon até que o líquido no topo da coluna atinja o topo da lã.

Agora cubra a lã com três mililitros de meio completo de 37 graus Celsius e retorne a coluna à incubadora de cultura de células para todas as células B, fibroblastos e células acessórias para aderir às fibras de lã. Após uma hora, em um novo tubo cônico de 50 mililitros, lave a coluna duas vezes com cinco mililitros de meio completo fresco para eluir as células T não aderentes. Em seguida, colete as células por centrifugação.

Depois de lavar as células T uma vez com dez mililitros de meio completo, ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio completo fresco. Em seguida, conte as células e dilua a suspensão para uma concentração de 0,5 vezes dez elevado a seis células por mililitro em meio fresco completo para semear em uma placa de cultura de células de seis ou 24 poços, conforme experimentalmente apropriado. Dentro de 24 horas após seu isolamento, ativar as células T isoladas da coluna de lã de náilon com o estímulo apropriado e a droga experimental de interesse.

Após 12 a 72 horas, use uma pipeta de um mililitro para misturar suavemente as células tratadas ativadas para remover quaisquer aglomerados. Para medir os diâmetros das células pelo contador de células automatizado, transfira um mililitro das células tratadas de cada poço para copos de amostra individuais e coloque os copos de amostra no carrossel de amostras do contador de células automatizado. Insira o ID da amostra e as informações do tipo de célula para registrar as amostras e começar a executá-las.

Depois de misturar o azul de tripano com a suspensão celular, as células são passadas por um campo de imagem até que cerca de 100 imagens celulares sejam coletadas de cada amostra. O software desenha um círculo ao redor de cada célula manchada e não corada com azul de tripano detectada para determinar o diâmetro da célula. Quando todas as células tiverem sido medidas, os dados serão exportados para uma planilha que mostra os resultados como as contagens totais e viáveis de células para cada diâmetro medido.

Os dados podem então ser apresentados como histogramas. Após dois dias de estimulação com PMA e ionomicina, observa-se uma mudança significativa na mediana da distribuição de frequência para diâmetros celulares maiores com o número de células T com diâmetros menores reduzido de acordo. Em uma concentração fixa de ionomicina de 250 nanomolares, o efeito do PMA não é significativamente alterado pela elevação da concentração do estímulo de ativação de dois para 250 nanogramas por mililitro.

Também não há uma diferença apreciável na proliferação de células T observada. Os medicamentos inibidores da calcineurina suprimem parcialmente a blastogênese e a proliferação das células T. O tratamento com células T com compostos imunossupressores que têm como alvo o fator nuclear calcineurina das células T ativadas inibe a resposta blastogênica em quase 72%.

A rapamicina e o FTY720 exibem efeitos moderados, mas estatisticamente significativos, na blastogênese. Enquanto o TRAM34 aparentemente não afeta a proliferação de células T murinas, mesmo em concentrações de 700 nanomolares. Quando a rapamicina e a ciclosporina A são usadas juntas, a blastogênese é completamente inibida.

Resultados semelhantes são observados com células T murinas ativadas com esferas magnéticas conjugadas anti-CD3 e anti-CD28. Este ensaio pode ser usado para quantificar com sucesso os efeitos de vários medicamentos imunomoduladores, fornecendo uma melhor avaliação da potência do medicamento em comparação com os ensaios de proliferação típicos, que também incluem contribuições de células apoptóticas e necróticas. Com este método, até 15 amostras podem ser medidas dentro e fora, permitindo a quantificação simultânea e subsequente das taxas de blastogênese e proliferação.

Ocasionalmente, bolhas de ar podem entrar na célula de fluxo, tornando a medição inutilizável, portanto, todas as imagens devem ser examinadas quanto a bolhas de ar antes que os dados de cada teste sejam aceitos para análise. Uma limitação desse procedimento é que, se houver muitos detritos na amostra, a medição pode tratar os detritos como células viáveis. Com modificações adequadas, este ensaio tem o potencial de ser adaptado para estudar a mudança de tamanho celular em neutrófilos e hepatócitos.