Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre ativação de células T, proliferação e diferenciação Th1, bem como estimulação celular de antígeno apresentando imunidade adaptativa. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo de um ambiente in vivo e, ao mesmo tempo, permite a manipulação celular in vitro. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de isolamento de órgãos e ossos e transferência adotiva são difíceis de dominar apenas por meio de instruções de texto.

Para isolamento de células da medula óssea, desinfete os membros posteriores de um camundongo adulto com etanol a 70% e use uma tesoura para fazer uma incisão lateral na pele nos membros posteriores. Insira a tesoura na face medial das pernas e corte a pele com a tesoura até o início dos membros posteriores. Em seguida, use uma pinça para separar a pele das pernas.

Usando uma tesoura, separe o músculo do fêmur e da tíbia e use uma tesoura para desarticular a articulação do quadril, quebrando a cabeça do fêmur. Em seguida, separe o fêmur da tíbia sem quebrar as extremidades ósseas e coloque os ossos em uma placa de Petri de meio completo no gelo. Quando todos os ossos tiverem sido colhidos, corte cuidadosamente as extremidades proximal e distal de cada osso com um bisturi e use uma seringa de 1 mililitro equipada com uma agulha de calibre 25 para lavar os ossos repetidamente com um volume total de 10 mililitros de meio RPMI completo quente.

Quando todos os ossos tiverem sido lavados, transfira todo o conteúdo do prato para um tubo cônico de 50 mililitros equipado com um filtro de nylon de poros de 70 micrômetros e desaloje cuidadosamente quaisquer detritos e conglomerados celulares com agitação e pipetagem suaves. Colete as células da medula óssea por centrifugação. Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos de quatro graus Celsius com pipetagem e incube a mistura no gelo por cinco minutos.

No final da incubação, parar a lise com 10 mililitros de PVS e ressuspender o pellet em 25 mililitros de meio completo para uma segunda centrifugação. Em seguida, ressuspenda as células em 5 mililitros de meio completo fresco para contagem e centrifugue as células novamente. Para isolamento de células de tecido linfóide secundário, colete os linfonodos inguinais, axilares, braquiais, cervicais e mesáricos e baço de camundongos transgênicos OT-II e transfira os tecidos linfóides secundários para uma placa de Petri de plástico contendo 10 mililitros de meio RPMI completo.

Quando todos os tecidos tiverem sido colhidos, transfira os gânglios linfáticos e o baço para um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros e use um êmbolo de seringa para homogeneizar os tecidos. Lave o filtro com até 15 mililitros de meio e gire as células por centrifugação. Em seguida, isole as células T CD4-positivas por classificação magnética de contas, de acordo com protocolos padrão.

Para ativação in vivo das células T CD4-positivas OT-II virgens, rotule as células T isoladas de esferas magnéticas com corante traçador de células vitais, de acordo com protocolos padrão, e ressuspenda as células marcadas em 10 a sextas células por 100 microlitros de concentração de PBS. Em seguida, transfira adotivamente 100 microlitros de células por animal através da veia da cauda. Pré-aqueça os camundongos antes da injeção para garantir que as veias da cauda estejam dilatadas o suficiente para permitir a entrega de todo o volume celular.

Após 24 horas, administre 10 às quintas células dendríticas carregadas com peptídeos OVA amadurecidas com LPS por injeção subcutânea na almofada do pé de cada animal injetado com células T. Dois e cinco dias após o desafio adotivo, colher os linfonodos popliciais dos animais receptores para processamento de tecidos e isolamento de células T, conforme demonstrado. Para analisar a ativação das células T, core as células isoladas do segundo dia com anticorpos fluorescentes contra CD4, CD69 e CD25 para determinar a porcentagem de células T CD64-positivas e CD25-positivas dentro da população receptora CD4-positiva por citometria de fluxo.

Para avaliar a proliferação de células T, core as células isoladas do quinto dia com os anticorpos fluorescentes apropriados contra CD4 e analise o decaimento do sinal do corante marcador de células vitais na população de células T CD4-positivas do doador por citometria de fluxo. Para avaliar a diferenciação Th1, plaquear quatro vezes 10 até o quinto dia cinco células T isoladas por poço em 200 microlitros de meio completo, suplementado com ionomicina e PMA por poço, em uma placa de 96 poços. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius por seis horas, adicionando Brefeldina A a cada poço para bloquear a secreção de citocinas durante as últimas quatro horas da estimulação.

No final da incubação, centrifugar a placa e rejeitar o sobrenadante por inversão rápida. Corar as células com anticorpo anti-CD4, seguido de fixação em 100 microlitros de paraformaldeído a 2% e sacarose a 1% por 20 minutos em temperatura ambiente. Permeabilize as células com 50 microlitros de tampão de permeabilização por 30 minutos a 4 graus Celsius, seguido de uma lavagem por centrifugação com 150 microlitros de PBS por poço.

Em seguida, coloração para as citocinas intracelulares de interesse, de acordo com protocolos padrão por 30 minutos em temperatura ambiente, seguida de duas lavagens por centrifugação com 150 microlitros de PBS suplementados com 1% de saponina por poço. Em seguida, analise as células por citometria de fluxo. A análise por citometria de fluxo de células dendríticas derivadas da medula óssea GM-CSF após estimulação com LPS revela uma regulação positiva de marcadores de maturação, como MHCII, CD80 e CD86.

As células T OT-II CD4 positivas virgens tornam-se ativadas após a transferência adotiva para animais receptores por sua regulação positiva de marcadores de ativação de células T, expressão de superfície e várias rodadas de divisão celular. Após a ativação, as células T OT-II positivas para CD em proliferação demonstram um fenótipo Th1, conforme demonstrado por sua expressão intracelular de interferon gama. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em oito horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar todos os reagentes e materiais no dia anterior ao experimento. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em imunologia estudarem células dendríticas e células T em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a medula óssea dos fêmures e da tíbia de camundongos e como transferir células T e células dendríticas para animais receptores.

Não se esqueça de que trabalhar com instrumentos pontiagudos, como agulhas, bisturis ou tesouras, pode ser extremamente perigoso, portanto, precauções como usar a proteção adequada para os dedos devem sempre ser tomadas durante a execução desses procedimentos.