Name: Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a ativar células T CD4 naïve in vivo usando células dendríticas derivadas de medula óssea em camundongos. Este protocolo demonstra proliferação e diferenciação Th1 para estudos de imunologia.

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Agradecemos o Dr. Simon Bartlett para edição inglesa. Este estudo foi suportado por concessões do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), o programa de Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; com o co-financiamento do Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). A CNIC é suportado pelo Ministério da economia, da indústria e competitividade (MEIC) e Fundação Pro CNIC e é um Severo Ochoa centro de excelência (SEV-2015-0505). RTF é fundada pela Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG por ISCIII, BHF pelo Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G pelo ISCIII Miguel Servet programa e imas12.

Procedimentos experimentais foram aprovados pela Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) e da Comunidad Autónoma de Madrid, em conformidade com diretrizes de espanhol e europeus. Os ratos foram criados em condições (SPF) livre de patógeno específico e foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono (CO2).
1. isolamento de células de medula óssea de rato de tíbias e fêmures
Nota: A cepa de rato C57BL/6 congenic carrega o diferencial de leucócitos marcador Ptprcum, geralmente reconhecido como CD45.1 ou Ly5.1, Considerando que estirpes de tipo selvagem C57BL portadores do alelo Ptprcb , conhecido como CD45.2 ou Ly5.2. Variantes cd45.1 e CD45.2 podem ser distinguidas por citometria de fluxo, usando anticorpos. Ratos cd45.1, CD45.2 e CD45.1/CD45.2 podem ser usados como fontes de célula ou como destinatários para transferência adotiva, permitindo o rastreamento das populações distintas de células por citometria de fluxo. Utilizar preferencialmente idade- e correspondência sexo masculinos ou femininos de ratos abaixo de 12 semanas de idade.
<ol><li>
Preparação dos fêmures e tíbias
	<ol>
<li>Eutanásia em ratos usando o protocolo aprovado pelo Comitê institucional cuidados com animais.</li>
		<li>Desinfecte os membros traseiros pulverizando a superfície animal com etanol a 70%.</li>
		<li>Uso de bisturis, pinças e tesoura esterilizada. Com um bisturi, fazer um corte na pele e remover a pele da parte distal do mouse incluindo a pele que cobre as extremidades posteriores. Tirar a pele ao redor do músculo da panturrilha inferior e retire a pele das pernas totalmente (Figura 2A, 2B).</li>
		<li>Separe o músculo quadríceps do fémur utilizando um bisturi. Desarticular a articulação do quadril sem quebrar a cabeça do fêmur. Remova os músculos da tíbia usando um bisturi (Figura 2, 2D). Separe o fêmur a tíbia sem quebrar as extremidades do osso.</li>
		<li>Manter os ossos em uma placa de Petri contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina no meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x gelada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento de célula Nota: Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas sob uma capa de cultura e com material estéril para evitar contaminação.<ol>
<li>Em uma placa de Petri estéril, cuidadosamente, corte fora as extremidades proximais e distais de cada osso com um bisturi.</li>
		<li>Lave os ossos repetidamente com um volume total de 10 mL de quente meio RPMI completo (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicilina/estreptomicina, 20 mM HEPES, 55 µM 2-Mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM e 2 mM L-glutamina). Limpe os ossos de ambas as extremidades, usando uma agulha 25g anexada a uma seringa de 1 mL.</li>
		<li>Transferi o effluate para um tubo cônico de 50 mL, equipado com um filtro de web de nylon 70 do µm. Cuidadosamente, desalojar conglomerados de detritos e célula por agitação suave e pipetagem.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de célula 250 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Ressuspender as células em 1 mL de tampão de lise de eritrócitos-sangue frio (0,15 M NH4Cl + 1mm KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH ajustado a 7.2 com 1 N HCl, 0,4 µm estéril, filtrada e armazenadas a 4 ° C). Manter-se no gelo por 5 min com agitação manual.</li>
		<li>Adicione 10 mL de tampão frio (1 x salina tamponada fosfato (PBS) + 2 mM EDTA + 2% albumina de soro bovino (BSA)) para inativar e desbotar a Lise-glóbulos vermelhos.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lavam-se células com 25 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI completo. Mix 50 µ l de suspensão de célula 1:1 com trypan azul. Determine o número de células em uma câmara de contagem ao microscópio. Calcular o número de células usando a fórmula: células/mL = [(célula não manchadas de contagem/4) x 2 x 10.000]12. Nota: Este método produz 40 x 106 a 60 x 106 óssea de células de medula por 8 não infectados ao rato de C57BL/6 12 semanas de idade.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DC diferenciação, maturação e carregamento de antígeno
<ol><li>
Célula de BM colheita
	<ol>
<li>As sementes da cultura completa em placas de superfície 6-poços ultra-low-fixação em 106 células por mL de meio, normalmente em 5 mL por bem. Os macrófagos diferenciados irão anexar para as placas de cultura. Depois de 12 h, transferi o sobrenadante, que contém principalmente monócitos, para limpar as placas 6-poço, descartando as placas 6-poços antigas com os macrófagos aderidas.</li>
		<li>Para promover a diferenciação celular, cultura das células não-aderentes em 5 x 105 células por mL em tipicamente 5 mL por alvéolo de meio RPMI completo contendo 20 ng/mL obtidos comercialmente recombinante murino GM-CSF em 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO2) e Observe-se diariamente.</li>
		<li>Cada 3 dias, spin para baixo de células suspensas e coletar as células aderentes com 5 mM de EDTA em PBS e spin para baixo. Combinar e ressuspender em 5 x 105 células/mL de meio fresco contendo 20 ng/mL rm-GM-CSF.</li>
		<li>No dia 8, coletar células aderentes e destacadas como acima e ressuspender em 5 x 105 células/mL em média com 20 ng/mL GM-CSF e 20 lipopolissacarídeo ng/mL (LPS) para 24 h em uma cultura de tecidos não-tratados Petri estéril, para induzir a alta MHC-II , Expressão de CD80 e CD86.</li>
		<li>Diferenciação de seleção DC por citometria de fluxo, conforme indicado no passo 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diferenciação de citometria de fluxo e análise de maturação.
	<ol>
<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C. Repita duas vezes.</li>
		<li>Receptores Fc bloco incubando o centrifugado ressuspensão em rato Fc receptor bloqueador (purificada anti anticorpo de2b CD16/CD32 IgG de rato) por 15 min a 4 ° C, de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Para cada teste, resuspenda 250.000 células em 300 µ l de tampão de citometria de fluxo (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) a 4 ° C.</li>
		<li>Transferi 30 µ l de solução de célula por alvéolo para uma 96--placa.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e adicionar 30 µ l de contendo anticorpos buffer para cada bem seguindo as indicações do fabricante. Incubar as células com anticorpos por 20 min a 4 ° C. Nota: Normalmente utilizados marcadores para DCs, monócitos e macrófagos são CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 e CD86 (Figura 3).</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e Resuspenda em 200 µ l por alvéolo do buffer de citometria de fluxo frio contendo um marcador para excluir células mortas (por exemplo, o iodeto de propidium, ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou um corante reativo-amina ) no concentração recomendada13 do fabricante.</li>
		<li>Monitorar a diferenciação celular, transferindo as amostras para tubos de citometria de fluxo e realizar a análise de citometria de fluxo excluindo células mortas nos dias 0, 3, 6 e 9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Carregamento de antígeno de DC.
	<ol>
<li>No dia 8, Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspender as bolinhas no meio de 200 µ l (RPMI + 10% FBS sem antibióticos). Repita duas vezes.</li>
		<li>Incubar as DCs com 10 µ g/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) por 1 x 107 DCs em 1 mL de meio (RMPI + 1% FBS) em um tubo de plástico pelo menos 30 min a 37 ° C. Use o DCs OVAp não-carregado como uma condição de controle negativo.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e Resuspenda as pelotas em 200 µ l RPMI o meio completo. Repita duas vezes.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspender as bolinhas no meio de 200 µ l (RPMI + 10% FBS) 2 x 106 células/ml.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolamento de células T Naïve CD4 OTII ratos
Nota: Este método produz aproximadamente 100 x 106 spleenocytes por 8 não infectados ao rato de C57BL/6 12 semanas de idade. Machos e fêmeas podem ser usadas. Células T CD4 podem ser isoladas de baço ou gânglios linfáticos; Células T CD4 representam cerca de 25% e 50% das células nesses órgãos, respectivamente. Execute as seguintes etapas em condições estéreis.
<ol><li>Isolar o inguinais, axilares, braquiais, cervicais e mesentéricos linfonodos e baço de ratos transgénicos OTII (Figura 4) e transferi-los para uma placa de Petri contendo 10 mL de meio RPMI completo de plástico.</li>
	<li>Lave o filtro de célula com 2 mL de meio RPMI completo e retire o tubo de 50 mL. Transferência de linfonodos e baço de um coador de célula de 70 µm colocados em um tubo de 50 mL. Homogeneizar usando um êmbolo da seringa (Figura 5) e adicionar médio de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 250 x g por 5 min a 4 ° C e resuspenda o pellet em 15 mL de meio RPMI completo. Repita duas vezes.</li>
	<li>Para suspensão de células de baço, resuspenda o pellet de células e lisar os glóbulos vermelhos, como indicado no passo 1.2.5.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 250 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Lavam-se células com 25 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min à RT</li>
	<li>Ressuspender as células em 5 mL de meio. Mix 50 µ l de suspensão de célula 1:1 com Trypan azul. Determine o número de células utilizando uma câmara de contagem ao microscópio. Calcular o número de células usando a fórmula: células/mL = [(célula não manchadas de contagem/4) x 2 x 10.000]12.</li>
	<li>Repita a etapa 2.2.2.</li>
	<li>Seguindo as instruções do fabricante, Incube as celulas com diluições de 1:800 de anticorpos biotinilado CD8α IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 e DX5 para 30 min no gelo para mais tarde uma seleção negativa de linfócitos T CD4.</li>
	<li>Seguindo as instruções do fabricante e com base no número de células e a capacidade dos grânulos, calcular a quantidade necessária de microbeads magnéticos streptavidin-revestido e isolar as células T CD4, usando um separador magnético da célula e o adequado colunas de separação.</li>
	<li>Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI completo e mantê-los no gelo durante a contagem de células vivas como descrito na etapa 3.7.</li>
	<li>Extrair a 2 x 105 células e verificar a pureza das células coletadas usando anti-CD4 e CD8 CD3, B220 anticorpos fluorescentes em um citômetro de fluxo usando diluições de anticorpo fabricante-recomendando.</li>
	<li>Para manchar as pilhas de T de CD4/OTII isolado ingênuo, resuspenda 106 células no buffer de 500 µ l (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA). Preparar 500 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) contendo duas vezes a concentração final de fabricante-recomendado de corante marcador de célula vital. Misture as duas soluções adicionando lentamente a solução de rastreamento de celular para a suspensão de eritrócitos. Incube as celulas por 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Lavar as células com 5 mL de meio RPMI completo e centrifugar 250 x g por 5 min a 4 ° C. Repita duas vezes. Ressuspender as células em 1 mL de meio RPMI completo a 1 x 107células/mL.</li>
</ol>4. in Vivo a ativação, proliferação e ensaio de diferenciação de células Th1
Nota: O célula vital traçador corante carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster (CFSE) e outros succinimidil éster-baseado corantes, que são excitados e emitem fluorescência em diferentes comprimentos de onda, são amplamente utilizados para avaliar a proliferação de linfócitos pelo fluxo citometria devido a sua intensidade de fluorescência de alta, longa vida, baixa variabilidade e baixa toxicidade14.
<ol><li>Enviaram transferi por via intravenosa (i.v.) 1 x 106 célula viva vital traçador ingênuo manchadas de tinta CD4/OTII as células T em 100 µ l de PBS por rato. Rotulado de células T podem ser transferidas enviaram pela veia da cauda ou injeção retro-orbital15; em ambos os casos, as células vão em casa para órgãos linfoides (figura 6A).</li>
	<li>Desafie os ratos destinatários um dia mais tarde enviaram Transferindo 100.000 LPS envelhecido carregado OVAp DCs por via subcutânea (s.i.) dos footpads (Figura 6B).</li>
	<li>Colheita de linfonodos poplíteos de ratos destinatários e processá-los até a obtenção de suspensões de célula única, seguindo as mesmas etapas, conforme descritas em 3.1 e 3.2. Fazer isso no pós-imunização de dia 2 para medir a ativação de células T CD4/OTII e no dia 5 para medir a proliferação e diferenciação de células Th1.</li>
	<li>Para analisar a ativação de células T no dia 2, mancha células com anticorpos fluorescentes contra CD4, CD25 e CD69 (opcionalmente, CD45.1 e CD45.2) e determinar a porcentagem de C69+CD25+ T células na população CD4. Análise por citometria de fluxo (Figura 7).</li>
	<li>Para verificar a proliferação de células T no dia 5, mancha de células usando anticorpos fluorescentes apropriados contra CD4 e, opcionalmente, CD45.1 e CD45.2. Analise a decadência do sinal vital célula traçador corante na população CD4 por citometria de fluxo (Figura 8). Vários parâmetros podem ser determinados nestes estudos, tais como o número de divisões celulares sofrido pelas células marcadas com o corante marcador de célula vital, a percentagem de células divisórias em cada pico de fluorescência e a percentagem de células divisórias na célula total população.</li>
	<li>Para determinar a diferenciação de células Th1 no dia 5, 400.000 células de placa por alvéolo de uma placa de 96 poços em 200 µ l de meio RPMI completo contendo 1 ionomycin µM e 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 acetato (PMA) para 6 h a 37 ° C na incubadora. Para a última 4 h, adicione 3 – 10 µ g/mL brefeldin A para bloquear a secreção de citocinas ao meio.</li>
	<li>Centrifugar as placas durante 5 min à 250 x g a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante por inversão rápida da placa de 96 poços.</li>
	<li>Repita a etapa 2.2.2.</li>
	<li>Manche as membranas celulares incubando por 15 min a 4 ° C em 30 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) que contém os anticorpos para CD4 e, opcionalmente, CD45.1 e CD45.2 em diluições recomendadas fabricante. Lavar as células adicionando 150 µ l de tampão (1X PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) e centrifugar as placas durante 5 min à 250 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Corrigir as células adicionando-se 100 µ l de paraformaldehyde/1% 2% sacarose por 20 min no centrifugador do RT. as placas por 5 min a 1.000 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Permeabilize as células pela adição de 50 µ l de tampão de permeabilização intracelular (1X PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponina) e incube por 30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Adicione 150 µ l de PBS e centrifugar por 5 min a 1.000 x g em RT. descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Mancha de citocinas intracelulares adicionando 30 µ l de conjugado anti anticorpo relato fluoróforo no buffer (PBS + 0,1% saponina) e incube por 30 min em RT</li>
	<li>Lave as células adicionando 150 µ l de tampão (PBS + 0,1% saponina). Centrifugar as placas durante 5 min à 1.000 x g em RT e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes.</li>
	<li>Analise as populações de células por citometria de fluxo (Figura 8).</li>
</ol>

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<li>Warth, S. C., Heissmeyer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+transduction+of+naive+CD4+T+cells+to+study+Treg+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Este protocolo permite a caracterização da capacidade de DCs BM-derivado de modular a ativação, proliferação e diferenciação das células T CD4 de ingênuo. Além disso, ele pode também ser usado para avaliar a suscetibilidade de células T CD4 a modulação por DCs BM-derivado. Com este protocolo, mudanças nestes eventos podem ser medidos em vivo.
Dependendo da hipótese sob investigação, várias combinações de células T e DCs podem ser usadas. Por exemplo, um pode analisar as consequências ...

Células T CD4 e apresentadoras de antígenos (APCs) de células como DCs são necessários mediadores da imunidade a patógenos microbianos1,2. Nos órgãos linfoides secundários, as células T CD4 são ativadas mediante reconhecimento de antígenos específicos apresentados por APCs3,4,5. Células CD4 T ativadas proliferaram e diferenciarem em células de Th effector específicos distintos que são necessárias para o desenvolvimento de uma correta resposta imune adaptativa6,7. Controle desses processos é fundamental para produzir uma defesa adequada adaptável que mata o patógeno sem produzir dano de tecido prejudicial8. Células th são definidas de acordo com a expressão ou a produção de moléculas de superfície, fatores de transcrição e citocinas efetoras e executam funções essenciais e precisas em resposta a agentes patogénicos1. Células do subconjunto de células Th1 expressam o fator de transcrição T-aposta e a citocinas interferon γ (relato) e participarem na defesa do hospedeiro contra patógenos intracelulares1. Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 é um meio útil de avaliar a T células dramatização em uma resposta imune.
Este protocolo permite que vivo em análise da capacidade de in vitro -gerado DCs BM-derivado de modular o ativação, proliferação e diferenciação de Th1 de células T CD4 de ingênuo. O protocolo também serve para avaliar a capacidade das células T CD4 de ingênuo para ser ativado, induzidas a proliferar e Th1 diferenciadas (Figura 1). Este protocolo versátil contorna a incapacidade especificamente manipular ou selecione população celular estudados em puramente na vivo protocolos. Os efeitos de diversas moléculas e tratamentos em controladores de domínio podem ser estudados usando BM de camundongos geneticamente modificados5 ou tratar ou manipular geneticamente isolados de células BM9. Da mesma forma, respostas de células T podem ser exploradas através da obtenção de células T para transferência adotiva de diferentes fontes ou após várias manipulações3,8,10.
As principais vantagens do presente protocolo são dupla. Ativação de célula t, proliferação e diferenciação de células Th1 são analisados com uma abordagem de citometria de fluxo; e isto é combinado com estudos em vivo , evitando, assim, alterações que podem ocorrer em vitro , incluindo tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos11.
O uso de corantes vitais é uma técnica amplamente utilizada para controlar a proliferação celular, evitando o uso da radioactividade. A medida da proliferação com estes reagentes baseia-se na diluição do corante após a divisão celular. Além disso, esses corantes podem ser detectados em vários comprimentos de onda e são facilmente analisadas por citometria de fluxo em combinação com vários anticorpos fluorescentes ou marcadores. Destacamos a utilidade do presente protocolo, mostrando como a ativação de célula T, proliferação e diferenciação de células Th1 podem ser analisados por citometria de fluxo.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20.824.365</td><td>5 L</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>Ferramentas de Ciências Finas (FST)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr>Ferramentas de Ciências Finas para<td>Bisturi</td><td>(FST)</td><td>10020-00</td><td>Caixa de 100 lâminas</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>SIGMA</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>GIBCO</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri estéreis</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>agulha de calibre 25</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>Novico</td><td>N15663</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro de nylon BD</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise do sangue vermelho</td><td>SIGMA</td><td>R7757</td><td>100 Ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>ED2SS-250</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>SIGMA</td><td>302643-25G</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)</td><td>Cambrex</td><td>BE17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Merck</td><td>8-05740-0250</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>LONZA</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>LONZA</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos murinos recombinantes (GM-CSF)</td><td>Prepotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>lipopolissacarídeo (LPS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L2018</td><td></td></tr> placa <tr><td>de 96 poços</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>v450 anticorpo CD11b anti-camundongo</td><td>BD Biosciences</td><td>560455</td><td></td></tr><tr><td>PE anticorpo CD64 anti-camundongo</td><td>BioLegend</td><td>139303</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-camundongo CD115</td><td>BioLegend</td><td>135505</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse Anticorpo CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-camundongo MHCII</td><td>BioLegend</td><td>125507</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorpo CD86 anti-camundongo</td><td>BioLegend</td><td>105011</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorpo CD80 de camundongo</td><td>BioLegend</td><td>Tubos de</td> citometria de fluxo 104713 <td></td></tr><tr><td></td><td>Zelian</td><td>300800-1</td><td>PS 12X75 5mL</td></tr><tr><td>OTII Peptídeo</td> <td>de ovoalbuminaInvivoGen</td><td>323-339</td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo biotinilado CD8&alfa; anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo biotinilado anticorpo IgM biotinilado</td><td></td><td>BioLegend 406503</td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo biotinilado anticorpo B220</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0452-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo biotinilado CD19 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0193-U500</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-camundongo biotinilado MHCII (I-Ab)</td><td>BioLegend</td><td>115302</td><td></td></tr><tr><td>anti-camundongo biotinilado anti-camundongo</td><td></td><td></td><td></td>biotinilado anti-camundongo</tr><tr><td></td><td></td><td>103003</td><td></td></tr><tr><td></td><td>117303</td><td></td><td>anti-camundongo anti-camundongo biotinilado anti-camundongo</td></tr><tr><td> Anticorpo CD25</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo DX5 biotinilado de camundongo</td><td>BioLegend</td><td>108903</td><td></td></tr><tr><td>microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Separador de células magnéticas</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>QuadroMACS Separador</td></tr><tr><td>Colunas de separação</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>PE anticorpo CD4 anti-rato</td><td>BioLegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorpo CD3 anti-rato</td><td>BioLegend</td><td>100235</td><td></td></tr><tr><td>FITC anticorpo CD8 anti-rato</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Cell Violet Tracer</td><td>Thermofisher</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>APC anticorpo CD25 anti-rato</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 anticorpo CD69 anti-rato</td><td>BioLegend</td><td>104518</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCY5.5 anti-rato CD45.1 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>65-0453</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-rato CD45.1 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0453</td><td></td></tr><tr><td>PECY7 anti-rato CD45.1 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>60-0453</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-rato CD45.2 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0454</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12 Miristato 13 (PMA)</td> <td>SIGMA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td> <td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Millipore</td><td>8-18715-02100</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de permeabilização intracelular</td><td>eBioscience</td><td>00-8333</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IFNg anti-camundongo APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-7311-U100</td><td></td></tr><tr><td>Bloco FC (anti-camundongo CD16 / CD32)</td> <td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-U100</td><td></td></tr><tr><td>B6. Camundongos SJL CD45.1</td><td>O Laboratório Jackson</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade; Analisador de Células</td><td>BD Biosciences</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>Solução DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>62248</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de rato in vivo para ativação de células t naïve cd4 medida, proliferação e diferenciação de células th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantificação da ativação de células T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de T helper 1 (Th1) células é uma maneira útil para avaliar o papel desempenhado pelas células T em uma resposta imune. Este protocolo descreve a diferenciação em vitro dos progenitores da medula óssea (BM) para obter granulócitos macrófagos colônia-estimulando factor (GM-CSF) derivado-células dendríticas (DCs). O protocolo descreve também a transferência adotiva de peptídeos ovalbumina (OVAp)-carregado DCs GM-CSF-derivados e as células T CD4 do ingênuo de ratos transgénicos OTII a fim de analisar na vivo ativação, proliferação e diferenciação de células Th1 do transferidas as células T CD4. Este protocolo contorna a limitação de puramente na vivo métodos impostas pela incapacidade de manipular ou selecione população celular estudado especificamente. Além disso, este protocolo permite que estudos em um ambiente em vivo , evitando assim alterações funcionais fatores que podem ocorrer em vitro e inclusive a influência dos tipos de células e outros fatores encontrados somente em órgãos intactos. O protocolo é uma ferramenta útil para gerar mudanças em DCs e T células que modificar adaptáveis respostas imunes, potencialmente, fornecendo resultados importantes para compreender a origem ou o desenvolvimento de inúmeras doenças associadas imunes.

A Figura 1 ilustra as etapas descritas neste protocolo. A Figura 2 ilustra o isolamento e a cultura de células de rato BM. A adição de GM-CSF e LPS para essas culturas permite a geração em vitro e maturação de DCs. a Figura 3 ilustra a análise de citometria de fluxo da diferenciação e maturação de obtidos DCs DCs. OVAp-carregado derivado de GM-CSF BM e célula vital isolado rastreamento manch...

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre ativação de células T, proliferação e diferenciação Th1, bem como estimulação celular de antígeno apresentando imunidade adaptativa. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo de um ambiente in vivo e, ao mesmo tempo, permite a manipulação celular in vitro. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de isolamento de órgãos e ossos e transferência adotiva são difíceis de dominar apenas por meio de instruções de texto.Para isolamento de células da medula óssea, desinfete os membros posteriores de um camundongo adulto com etanol a 70% e use uma tesoura para fazer uma incisão lateral na pele nos membros posteriores. Insira a tesoura na face medial das pernas e corte a pele com a tesoura até o início dos membros posteriores. Em seguida, use uma pinça para separar a pele das pernas.Usando uma tesoura, separe o músculo do fêmur e da tíbia e use uma tesoura para desarticular a articulação do quadril, quebrando a cabeça do fêmur. Em seguida, separe o fêmur da tíbia sem quebrar as extremidades ósseas e coloque os ossos em uma placa de Petri de meio completo no gelo. Quando t

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

O transplante de medula óssea murina é uma técnica amplamente utilizada para estudar os mecanismos imunológicos que regem enxerto-versus-hospedeiro da doença em seres humanos. A capacidade de monitorar padrões de tráfico de células...

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Este vídeo descreve um protocolo para a geração de células dendríticas - células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T - da medula óssea de um camundongo adulto.

Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação.  A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Este protocolo descreve a diferenciação de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas in vitro. Especificamente, quando combinado com uma abordagem baseada em citometria de fluxo multiparâmetro, 90% de pureza de células Th17 patogênicas podem ser obtidas de células T CD4 + virgens usando este método de diferenciação.

Diferenciação in vitro de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos

Aprenda a ativar células T CD4 naïve in vivo usando células dendríticas derivadas de medula óssea em camundongos. Este protocolo demonstra proliferação e diferenciação Th1 para estudos de imunologia.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea (Vídeo) | JoVE Journal

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

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