Manipulação funcional do gene materno produtos Usando In Vitro Maturação do oócito em Zebrafish

O objetivo geral deste protocolo é realizar a maturação in vitro de oócitos de peixe-zebra e, se desejado, manipular funcionalmente os produtos gênicos maternos, antes da fertilização. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, relativas à importância da contribuição materna para o embrião. A principal vantagem desta técnica é o cultivo de ovócitos in vitro, seguido de fertilização e produção de embriões viáveis.

E, se desejado, permite a manipulação funcional de produtos genéticos maternos que atuam no embrião inicial imediatamente após a fertilização. Para começar, oito a 10 dias antes da manipulação da cultura in vitro, use uma rede de pesca para transferir vários conjuntos de um único peixe macho e uma única fêmea da cepa desejada para um tanque de acasalamento. Deixe-os no tanque de acoplamento durante a noite.

Depois de permitir que os peixes acasalem na tarde seguinte, use uma rede de pesca para separar as fêmeas que produzem ovos durante o acasalamento e coloque-as em um tanque separado. Alimente essas fêmeas duas vezes ao dia com uma mistura de alimentos contendo aproximadamente uma quantidade igual de artêmia e flocos de comida de peixe. Em condições estéreis, adicione 20 mililitros do meio L-15 de Leibovitz com l-glutamina, PH 7.0, a um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, use 10 hidróxido de sódio normal para trazê-lo para PH 9.0. Adicione 9 mililitros do L-15 Medium a dois tubos cônicos separados de 50 mililitros. Em seguida, rotule um tubo DHP e o outro DHP.

No tubo DHP, adicione 10 microlitros de DHP, 490 microlitros de DH2O e 500 microlitros de 10% BSA. No tubo DHP, adicione 100 microlitros de 10 miligramas por mililitro de gentamicina, 400 microlitros de DH2O e 500 microlitros de 10% BSA. Para realizar a dissecção dos ovócitos, comece preparando uma solução estoque de tricaína a 0,2% em DH2O, tamponada a PH 7,0 com um molar tris PH 9,0.

Mantenha esta solução a 4 graus Celsius. De zero a quatro horas antes do final do ciclo de luz diário na instalação, em um béquer de 250 mililitros, adicione 20 mililitros de solução de estoque de tricaína a 0,2%, PH 7,0, a 80 mililitros de água de peixe e misture. É fundamental iniciar o procedimento dentro de quatro horas após o final do ciclo de luz do dia ao qual os peixes estão acostumados.

Caso contrário, os oócitos não amadurecerão adequadamente. Usando uma colher, colete o peixe eutanasiado da solução de tricaína e lave-o brevemente em água de peixe. Em seguida, coloque o peixe em uma toalha de papel para absorver o excesso de água.

Use uma lâmina de barbear limpa para decapitar o peixe sacrificado no nível da barbatana peitoral. Em seguida, com uma tesoura de dissecação, faça uma incisão longitudinal no lado ventral do peixe, estendendo-se da extremidade anterior até a região anal. Coloque o peixe em uma placa de Petri sob um microscópio de dissecação com luz incidente.

Em seguida, usando uma pinça de dissecação, isole as porções do ovário e transfira o tecido para uma placa de cultura de 35 por 10 milímetros, contendo quatro mililitros de L-15 Meidum de Leibovitz, DHP. Agora, com uma pinça de dissecação, dissocie suavemente os oócitos da massa folicular. Classifique os quatro oócitos do estágio inicial, que estão em tamanho quase máximo e caracterizados por um citoplasma opaco escuro e uma vesícula germinativa prontamente aparente, ou GV, localizada assimetricamente dentro do oócito.

Descarte os oócitos nos estágios iniciais e os óvulos translúcidos maduros no estágio 5. Use uma pipeta de pastagem de vidro para transferir os oócitos do estágio inicial quatro para uma segunda placa de cultura plástica de 35 por 10 milímetros, contendo quatro mililitros do meio L-15 de Leibovitz, mais DHP. Transfira quantidades mínimas de meio DHP negativo para o prato, contendo a solução mais DHP.

Se injetar mRNA, imediatamente antes da injeção, use água de osmose reversa de grau de RNA e cloreto de potássio 0,2 molar para diluir o MRNA em uma solução final de cloreto de potássio 0,1 molar. Se injetar morfolinos, ou MOs, imediatamente antes da injeção, dilua os MOs até a concentração desejada usando água de osmose reversa de grau de RNA e cloreto de potássio 0,2 molar, para atingir uma concentração final de cloreto de potássio 0,1 molar. Em seguida, para realizar a injeção, segure manualmente os oócitos com uma pinça fina e, usando uma agulha feita com uma pipeta capilar de vidro puxado, injete aproximadamente um nanolitro em oócitos do estágio quatro do tipo selvagem.

Continue incubando os oócitos imaturos e injetados em meio DHP a 26,5 graus Celsius. Verificação aproximadamente a cada 30 minutos para garantir que os oócitos permaneçam intactos e estejam passando por maturação adequada, tornando-se progressivamente translúcidos. Use uma pipeta de pastagem para remover quaisquer oócitos de lisagem.

E descarte-os em um copo de lixo de laboratório, para manter a qualidade do meio. Com aproximadamente metade do volume do meio DHP fresco, troque o meio de cultura para manter uma solução límpida, dependendo da quantidade de lise do oócito. Quando a maioria dos oócitos se tornar translúcida e tiver um GV que não é mais aparente, use uma pinça extrafina para fazer uma ruptura na membrana folicular, em uma região com maior espaço entre o oócito e a membrana.

Retire uma parte da membrana e, enquanto segura a parte descascada, role o oócito para fora da membrana. Outra etapa crítica é a remoção da membrana folicular. Se esta camada não for totalmente removida, a fertilização e a expansão do córion serão impedidas.

Transfira os oócitos desfoliculados em um volume mínimo de meio, para uma placa de Petri com algumas gotas de meio DHP de cultura e prossiga para a fertilização. Perto do final da etapa de maturação do oócito, e antes da desfoliculação, prepare uma solução de esperma usando testículos de cinco homens em 500 microlitros de solução de Hank. Adicionar 10 a 50 microlitros de solução espermática aos ovócitos desfoliculados em meio de cultura DHP.

Em seguida, aguarde 10 segundos. Usando uma pipeta, adicione algumas gotas de meio E3 aos oócitos. Aguarde um minuto e use o meio E3 para inundar a placa.

Depois de permitir que os embriões fertilizados se desenvolvam, use um microscópio de dissecação com óptica de luz transmitida para observar a progressão através dos estágios de clivagem para garantir uma fertilização bem-sucedida, conforme descrito anteriormente para fertilização e estadiamento. Como visto pela expressão de GFP, os oócitos da cultura in vitro são capazes de produzir proteínas a partir de mRNA exógeno durante o desenvolvimento do oócito em menos de duas horas. No entanto, apenas oócitos que iniciam condições de cultura no estágio quatro da oogênese podem se desenvolver em oócitos maduros no estágio cinco.

Neste experimento, o mRNA da aurora B do tipo selvagem injetado resgata os efeitos fenotípicos de uma mutação em seu gene correspondente, a ilha celular. Os embriões de um grupo de controle também podem se desenvolver para mostrar o fenótipo mutante correspondente. A injeção de um morfolino bloqueador de tradução pode fenocopiar com sucesso o fenótipo mutante conhecido, como mostrado pela injeção de lrmp-MO em oócitos, que imita o fenótipo mutante do ciclo fútil da mutação correspondente.

A codificação de mRNA também pode ser injetada em oócitos selvagens ou mutantes para visualizar os produtos correspondentes dentro do embrião inicial. Por exemplo, como visto aqui, a proteína Sass6-mCherry localiza-se em focos marcados pelo marcador do centrossomo Gamma tubulina. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente 5 a 6 horas, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não apressar o procedimento e permitir a maturação adequada dos oócitos antes da desfoliculação e fertilização. Após este procedimento, outros métodos, como a fixação de embriões, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Como o resgate de seu gene de interesse ou a localização de RNA ou proteína.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da gênese embrionária inicial explorarem a contribuição de produtos genéticos maternos no peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manipular funcionalmente os produtos genéticos maternos por meio da maturação in vitro de oócitos de peixe-zebra.