Avaliação de uma junção neuromuscular funcional por meio de estimulação óptica simultânea e gravação de vídeo

Comece com um biorreator com uma câmara muscular contendo tecido muscular incrustado em colágeno apoiado sobre os pilares da câmara.

O canal da neuroesfera contém uma neuroesfera em uma matriz de colágeno. Os neurônios motores da neuroesfera expressam canais sensíveis à luz.

Adicione um meio de diferenciação contendo fatores de crescimento neural que estimulam os neurônios a estender suas projeções.

Troque regularmente o meio para garantir a extensão contínua do neurônio em direção ao tecido muscular, formando junções neuromusculares.

Observe o biorreator sob um microscópio equipado com uma câmera e uma fonte de luz azul.

Aplique pulsos de luz azul para abrir os canais sensíveis à luz nos neurônios, permitindo que os íons do meio fluam e estimulem os neurônios a gerar sinais elétricos.

Esses sinais viajam através das projeções neuronais para as junções neuromusculares, transmitindo o sinal elétrico para o tecido muscular.

Grave um vídeo simultaneamente. Uma contração gradual da fibra muscular confirma o desenvolvimento de uma junção neuromuscular funcional.

Prepare uma mistura de 4 para 1 de 3 miligramas por mililitro de colágeno I e matriz de membrana basal solubibilizada. Em seguida, ressuspenda os mioblastos nesta mistura de colágeno recém-preparada.

Em seguida, adicione 15 microlitros desta suspensão de colágeno celular a cada câmara muscular do biorreator, certificando-se de espalhar a suspensão por ambos os pilares usando a ponta da pipeta. Deixe a mistura de gel celular polimerizar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, encha cada biorreator com 450 microlitros de meios de crescimento miotônicos.

No dia 11 da diferenciação do neurônio motor, transfira as células e o meio para um tubo de 50 mililitros e permita que as neuroesferas se depositem no fundo por 5 minutos. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 15 mililitros de meio de cultura em suspensão de neurônios motores suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro e 10 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado de células gliais.

No dia 14 dos protocolos de diferenciação, semeie os neurônios motores na plataforma. Prepare uma mistura de gel 4 para 1 de 2 miligramas por mililitro de colágeno I e matriz de membrana basal solubilizada. Use um filtro de células de 400 nanômetros para selecionar grandes neuroesferas e ressuspendê-las na mistura de gel preparada.

Com cuidado, aspire bem o meio do reservatório e da neurosfera. Em seguida, adicione 15 microlitros da mistura de gel no canal da neuroesfera. Carregue uma pipeta de 10 microlitros com 10 microlitros de gel e escolha uma neuroesfera. Deposite a neuroesfera no canal da neuroesfera, certificando-se de que ela esteja na câmara. Em seguida, levante lentamente a pipeta enquanto libera o gel restante assim que a neuroesfera for depositada.

Deixe o gel polimerizar por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 450 microlitros de NbActiv4 suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro e 10 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado de células gliais aos reservatórios.

Para imagens, use um microscópio fluorescente invertido com um software de câmera semicondutora de óxido metálico complementar científico. Defina o binning para 2 por 2, a exposição para 20 milissegundos, o obturador ativado, a taxa de leitura para 540 megahertz, a faixa dinâmica para 12 bits e ganho 1 e o modo do sensor para sobreposição. Use uma objetiva 2x no microscópio para obter imagens dos microtecidos e conecte uma câmara de células vivas ao estágio do microscópio.

Selecione a região de interesse que contém os tecidos esqueléticos inervados para minimizar o tamanho do arquivo e o tempo de processamento. Em seguida, coloque um filtro de emissão de passagem longa de 594 nanômetros entre a amostra e a objetiva de imagem para filtrar os pulsos de luz azul da câmera. Em seguida, coloque uma placa retangular de quatro poços contendo quatro biorreatores na câmara de células vivas. Em seguida, clique em Live View, centralize e foque a imagem com o ROI desejado.

Baixe o macrocódigo personalizado da pasta GitHub para controlar a posição do palco, a placa Arduino e a aquisição de vídeo. Em seguida, defina o filme de saída como day_tissuegroup_tissuename_experiment. ND2. Execute o macrocódigo com as coordenadas x e y desejadas definidas no palco e adquira um lapso de tempo rápido com 1.700 quadros a 50 quadros por segundo.

Após a imagem, substitua a mídia e devolva as amostras à incubadora. Aguarde pelo menos 24 horas entre as sessões de aquisição de imagens para evitar a fadiga dos tecidos.