Protocolo para blastóides humanos modelando desenvolvimento e implantação de blastocisto

A pesquisa sobre embriões humanos é limitada por sua baixa disponibilidade e preocupações éticas, obtendo assim modelos individuais que replicam fielmente o desenvolvimento humano precoce apoiaria o progresso científico e médico. A capacidade desta técnica de prever o desenvolvimento humano depende de sua capacidade de reproduzir as sequências de determinação celular blastocisto e morfogênese efetivamente, de acordo com a sequência e ritmo de desenvolvimento, e tal modelagem garantiria a formação de células que realmente refletem o estágio blastocisto. No futuro, os blastóides humanos podem ser usados para identificar alvos terapêuticos e contribuir para a modelagem pré-clínica, por exemplo, para melhorar um meio de fertilização in vitro, ou para desenvolver contraceptivos não hormonais.

O procedimento será Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer e Giovanni Sestini. Para começar, prepare e pré-bata na mídia PXGL, mídia basal N2B27, tampão de lavagem, PBS e mídia de agregação. Exclua os MEFs da suspensão do hPSC para a formação de blastoids.

Para exclusão de MEF, prepare uma placa revestida de gelatina adicionando um mililitro de gelatina de 0,1% no poço de uma placa de seis poços. Incubar as placas a 37 graus Celsius por 30 a 90 minutos. Para colher as células, remova o meio e lave as células com um milímetro de PBS.

Adicione 500 microliter de solução de descolamento celular a cada poço de uma placa de seis poços, e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Verifique as células sob o microscópio para seguir a dissociação das colônias em células únicas. Diluir a solução de descolamento celular com um mililitro de tampão de lavagem.

Recolher as células da placa tubo suavemente de cinco a dez vezes. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Gire as células a 200 RCF por quatro minutos.

Remova o supernasciente e resuspense as células em 1,5 mililitros de meio PXGL em cada poço. Semear as células nas placas revestidas de gelatina para exclusão de MEF, e incubar as placas a 37 graus Celsius por 60 a 90 minutos. Uma vez que as células ingênuas sejam semeadas para exclusão de MEF, remova o PBS da MicroWells e equilibre os poços com 200 microliters de meio Basal N2B27 para cada chip MicroWell, e incubar por 60 minutos a 37 graus Celsius.

Colete o supernatante contendo as células ingênuas não sectadas. Transfira para um tubo de 15 mililitros e gire as células a 200 RCF por quatro minutos. Descarte a mídia e resuspenque as células em um mililitro de mídia basal N2B27.

Conte as células usando slides de contagem de células. Gire as células a 200 RCF por quatro minutos. Descarte o meio e adicione uma quantidade apropriada de mídia N2B27 contendo 10 micromolar Y27632 para obter uma densidade celular de 30.000 células por 50 microliters.

Remova o meio das matrizes MicroWell equilibradas e adicione 25 microliters de mídia N2B27 com 10 micromolar Y27632. Adicione 50 microliters de suspensão celular e incubar a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir que as células caiam no fundo do MicroWell. Em seguida, adicione 125 microliters de meio N2B27, suplementado com 10 micromolar Y27632.

Dentro de 24 horas, os agregados de hPSCs ingênuos serão observados no chip MicroWell. Inicie a formação blastoid preparando o meio PALY. Pré-aquecimento a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Remova o meio de agregação e adicione 200 microliters de meio PALY pré-rebocado aos MicroWells. Coloque a placa de cultura celular de volta em uma incubadora hipóxica a 37 graus Celsius. Repita a mudança de mídia no primeiro dia.

No segundo dia, remova o meio PALY e adicione 200 microliters de meio N2B27, suplementados com LPA e 10 micromolar Y27632. Repita a mudança de mídia no terceiro dia. A formação completa de blastoids ocorre até o quarto dia.

Prepare a suspensão celular hPSC ingênua para formação de blastoid como descrito anteriormente. Descarte o meio e adicione uma quantidade apropriada de mídia N2B27 contendo 10 micromolar Y27632 para obter a densidade celular de 70 células por 100 microliters do meio. Para agrupar células na parte inferior dos poços, centrifugar a placa a 200 RCF por dois minutos em temperatura ambiente.

Incubar a placa a 37 graus Celsius sob condições de cultura hipóxica. Dentro de 24 horas, serão observados agregados de hPSCs ingênuos nos poços. Adicione 100 microliters de recém-preparados e pré-armados duas vezes médio PALY aos poços.

Coloque a placa de cultura celular de volta em uma incubadora hipóxica a 37 graus Celsius. Após 24 horas, descarte metade da mídia e substitua-a por 100 microliters de meio PALY pré-armado. Repita o passo até o quarto dia.

Prepare a suspensão ingênua da célula HPSC para a formação da troposfera, conforme descrito anteriormente. Uma vez que os agregados de HPSC ingênuos tenham se formado após 24 horas, troque o meio de agregação com PALY sem LIF, complementado com três micromolar SC144 para formar troforoses representando o trophectoderme precoce. Para formar troforos que representem trophectoderme maduro, tromule o meio de agregação com PALY, complementado com dois micromolar XMUMP1.

Atualize o meio diariamente. A formação completa da troforosa ocorre até o quarto dia. Para avaliar os estados celulares, compare os dados transcriptômicos de blastoid e troforferas com os controles apropriados, incluindo células-tronco trofoblastos humanos semelhantes à implantação pós-implantação.

Os hPSCs ingênuos cultivados em PXGL foram agregados e cavitados estruturas que surgiram entre 48 a 72 horas após a indução de PALY, e atingiram um diâmetro de 150 a 250 micrômetros em 96 horas. Com base nos parâmetros morfométricos e na presença das três linhagens, a eficiência de indução atingiu 70 a 80% A troforos foi formada em 50 a 60% de eficiência dentro de 96 horas de indução. A formação blastoid foi bem sucedida em placas de 96 poços de fixação ultra baixas disponíveis comercialmente em condições de indução otimizadas.

A tecnologia de sequenciamento de RNA de células únicas foi usada para caracterizar ainda mais o estado das células blastóides. As células exibem perfis de agrupamento notavelmente reprodutivelmente distintos, independentemente dos parâmetros utilizados para realizar o agrupamento e visualização de dados, o que permitiu distinguir as três linhagens blastocistos com confiança. Entre 24 e 60 horas, as células-tronco pluripotentes PXGL formam análogos do epiblasto e do trophectoderme.

Então, entre 60 e 96 horas, são formados análogos do tropofectoderme polar e do endoderme primitivo. Esta é a sequência de especificações dentro do blastocisto, assim os blastóides recapitulam a sequência de desenvolvimento da especificação de linhagem. A fusão de conjuntos de dados blastoids com o conjunto de dados de referência de células isoladas de embriões em diferentes estágios de desenvolvimento mostrou que 97% das células de blastoids agrupadas com as células blastocistos, mas não com células de embriões pós-implantação.

Análises independentes confirmaram que, com o tempo, as células-tronco formaram células que se coincidiram transcriticamente com as células dos embriões humanos entre o quinto e o 7,5º dia. Este é, de fato, o estágio de desenvolvimento durante o qual o blastocisto humano se forma. Eles também confirmaram que mais de 95% das células dentro de blastoids têm um transcriptome que corresponde às três linhagens celulares de blastocistos, enquanto 3% das células estavam fora do alvo, e combinadas com estágios pós implantação.

Note-se que nossas culturas 2D iniciais também compreendem cerca de 5% das células-alvo desem contato. O estágio de desenvolvimento equivalente também pode ser visualizado olhando para os padrões de expressão de marcadores específicos, como CDX2 para o trophectoderme blastocyst, e PRMD14 para o epiblasto blastocyst. A qualidade da cultura inicial do PXGL é absolutamente crucial, e o número de células dentro do agregado inicial também é crítico, e pode ser controlado usando MicroWells.

O tamanho total do agregado celular após 24 horas deve ser de cerca de 50 a 70 micrômetros. A formação eficiente de blastóides completos em fase está abrindo caminho para o estudo dos processos de implantação e desenvolvimento pós-implantação do embrião humano.