Name: A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Aprenda a criar um modelo de cocultura in vitro simples que imita o microambiente tumoral in vivo, enriquecendo populações celulares e investigando a comunicação intercelular sem técnicas estressantes de marcação fluorescente.

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Esta pesquisa foi apoiada por doações da Comissão de Pesquisa do Câncer de Nova Jersey (Bolsa de Pré-Doutorado DFHS13PPCO17), dos Institutos Nacionais de Saúde (CA049062) e da Administração Nacional de Aeronáutica e Espaço (NNX15AD62G).

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes ou conflitantes.

O protocolo aqui descrito é um método simples, adaptável no procedimento in vitro (Figura 1) que utiliza uma inserção de membrana microporosa permeável para gerar populações de células individuais altamente enriquecidas a partir de uma co-cultura de células heterotípicas. Significativamente, o modelo é apropriado para a investigação de vários modos de comunicação intercelular. Os passos críticos incluem seleccionando a inserção de tamanho de poro apropriado para o interesse experimenta...

O microambiente do tumor (TME) é um sistema altamente complexa composta de células de carcinoma que co-existem e evoluem paralelamente estroma hospedeiro. Este componente do estroma consiste tipicamente em fibroblastos, células endoteliais, miofibroblastos, vários componentes do sistema imunológico, bem como uma matriz extracelular 1. Um componente significativo, muitas vezes a maioria do presente estroma, são fibroblastos activados, frequentemente referido como fibroblastos associados ao cancro ou fibroblastos associada a carcinoma (CAF) 2,3. Ao contrário de fibroblastos normais, não activado, FAC contribuir para a iniciação do tumor, progressão, angiogénese, invasão, metástase, e recorrência 4-11 em uma grande variedade de carcinomas, incluindo os da mama, da próstata, do pulmão, pâncreas, pele, cólon, do esófago, e ovário 5,6,12-17. No entanto, a natureza exata da contribuição da FAC em todo patogênese do câncer permanece mal definida. Além disso, a evidência clínica demonstrou valor prognóstico da FAC, Correlacionando sua presença para malignidades de alto grau, falha terapêutica e pobres 10,18,19 geral prognóstico. Claramente, aumentando a nossa compreensão dos eventos que iniciam no desenvolvimento CAF, bem como as comunicações intercelulares mediadoras seu papel dentro da TME, pode fornecer excitantes novos alvos terapêuticos e estratégias avançadas que poderiam melhorar os resultados dos pacientes. Para atingir este objetivo, vários in vivo e in vitro modelos têm sido desenvolvidos. Embora as abordagens in vivo são mais um reflexo do TME dos pacientes, eles possuem limitações, incluindo a imensa complexidade e heterogeneidade, tanto dentro como entre tumores. Além disso, as amostras de tumores de seres humanos representam muitas vezes altamente desenvolvida TME e não permitir uma compreensão dos eventos iniciadores TME. estudos experimentais em animais oferecer algumas vantagens, no entanto generalização dos dados obtidos com animais para os seres humanos devem ser feitas com cautela devido a diferenças na physilogia entre os seres humanos e animais, tais como roedores (por exemplo, tiol química 20, a taxa metabólica 21, 22 da tolerância à pressão, etc). Além disso, ao contrário da população humana, que é geneticamente de natureza heterogénea, animais de laboratório são tipicamente produzidos até à homogeneidade. Além disso, é muitas vezes difícil de examinar as variações e alterações fisiológicas transientes fenótipo celular, bem como para controlar parâmetros experimentais específicos que utilizam animais, tais como roedores. Assim, in vitro 2 e 3 dimensões (2D e 3D) modelos de cultura de tecidos são frequentemente utilizados para fazer avançar a compreensão básica do desenvolvimento TME. Apesar de sua falta de um retrato fiel da complexidade dos sistemas in vivo, estes modelos oferecem vantagens que facilitam muito investigações mecanicistas. Modelos in vitro permitem uma análise mais simplificada, focado, e cost-effective da TME, em que estatisticamente significativa os dados podem ser gerados emcélulas livres de variações sistêmicas que surgem em animais. Existem diversas variedades de sistemas in vitro. Os dois modelos in vitro TME mais vulgarmente utilizados consistem em monocamada mista ou culturas de células esferóides. Ambos os métodos de cultura são vantajosos para estudos básicos de interacções intercelulares (por exemplo, células normais com as células tumorais) e para a análise de várias alterações de fenótipo celular específico TME (por exemplo, aparecimento de fibroblastos associados ao cancro a partir de fibroblastos normais). Além disso, os esferóides são capazes de criar uma estrutura de tecido semelhante a mais reflexiva da TME, e pode ser representativa da heterogeneidade do tumor 23. No entanto esferóides muitas vezes produzem muito diferentes gradientes de tensão de oxigênio através de camadas, que podem complicar conclusões experimentais 24. Infelizmente, ambos os modelos são extremamente limitados na sua capacidade de isolar populações de células puras para posterior caracterização e estudo seguinte co-cultura. Para isso seria necessário pelo menos um tipo de célula a ser fluorescente-etiquetados ou rotulados com uma máquina de identificação e, em seguida, submeter o co-cultura mista à extensa processamento e separação de células para separar as populações de células. Enquanto um classificador de células é capaz de isolar uma população de células em vez puro, deve-se estar ciente do estresse celular e contaminação microbiana riscos potenciais 25. Para facilitar a compreensão da comunicação intercelular, grandes esforços têm sido dedicados para o desenvolvimento e optimização de sistemas in vitro que imitam de perto o ambiente in vivo, permitindo ao mesmo tempo uma abordagem simplificada. Uma dessas ferramentas é a inserção microporosa permeável, um substrato de membrana que foi desenvolvido pela primeira vez em 1953 26 e posteriormente adaptado para diversas aplicações e estudos (por exemplo, polaridade celular 27, endocitose 28, o transporte da droga 29, modelagem de tecido 30, FERTilization 31, efeito espectador 32,33, etc). Este sistema permite o crescimento de células in vivo com anatómica -like e diferenciação funcional, bem como a expressão de muitos marcadores in vivo 34,35 que não são observados quando cultivadas em utensílios de plástico impermeável. Além disso, a membrana porosa extremamente fina (10 um de espessura) permite a rápida difusão de moléculas e tempos de equilíbrio, o qual simula o ambiente in vivo e permite funcionamento celular independente em ambos os domínios celulares basolaterais e apicais. Uma vantagem adicional da utilidade da pastilha como um sistema TME é a sua separação física das duas populações de células cultivadas heterotípicas em ambos os lados da membrana nas mesmas condições ambientais, mantendo ao mesmo tempo vários modos de comunicação intercelular através dos poros da membrana. Embora fisicamente separadas, as duas populações de células metabolicamente são acoplados através de elementos e segregadas, como odescrito aqui, também através de canais GAP-juncional. Além disso, mantendo as inserções em in vivo tensão parcial de oxigénio (pO 2), o modelo reduz as complicações de gradientes de oxigénio e químicos observados em outros sistemas. Pelo contrário, ela aumenta a compreensão dos mecanismos naturais que controlam o TME. Notavelmente, as duas populações de células pode ser facilmente isolado com elevado grau de pureza, sem a marcação fluorescente e / ou separação de células após períodos prolongados de co-cultura. Aqui, descrevemos um protocolo TME in vitro que consiste de células de carcinoma da mama humano e fibroblastos humanos cultivados, respectivamente, em ambos os lados de uma inserção da membrana microporosa permeável, mas ainda em comunicação bidireccional contínua através dos poros da membrana. Mostra-se que, utilizando membranas com diferentes tamanhos de poros, a contribuição de um tipo específico de comunicação intercelular (por exemplo, factores segregados contra as junções de hiato) para o desenvolvimentodo TME pode ser investigada.

<table><tbody><tr><td>Para cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AG01522 (i.e., AG1522) fibroblasto diplóide humano</td><td>Coriell</td><td>107661</td><td>Passagem 8-13</td></tr><tr><td>MDA-MB-231-luc-D3H1 linha celular de adenocarcinoma de mama</td><td>PerkinElmer</td><td>119261</td><td>Linha parental: linha celular de adenocarcinoma de mama ATCC (#HTB-26)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231/GFP</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-201</td><td></td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo da águia (MEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS), Suplemento Qualificado</td><td>Sigma</td><td>F6178-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Glutagro (200 mM L-alanil-L-glutamina)</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina Estreptomicina, 100x</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Inserção Transwell (ou seja, inserção de membrana microporosa permeável) (0,4 &mu; m pore)</td><td>Inserção Transwell</td><td>Costar 3450</td><td></td></tr><tr><td>(i.e., inserção de membrana microporosa permeável) (1 &mu; m pore)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657610</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Insert (i.e., inserto de membrana microporosa permeável) (3 &mu; m pore)</td><td>Costar</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 6 poços</td><td>Greiner Bio-One Cellstar</td><td>657160-01</td><td></td></tr><tr><td>frasco de cultura de células de 75 cm2</td><td>CellStar</td><td>658 170</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS), 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>sem cálcio e magnésio</td></tr><tr><td>0,25% (vol/vol) Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubo de Centrífuga</td><td>CellTreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Placa de Cultura de Células</td><td>Greiner bio-one</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Para Microscopia Imunofluorescente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Caveolina 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>In situ Imunofluorescência - 1:5.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>In situ Imunofluorescência - 1:2.000</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino - Fração V</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td>Imunoglobulina e protease livre</td></tr><tr><td>16% (wt/vol) Solução de Formaldeído</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Diluir a 4% com 1x PBS</td></tr><tr><td>Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1)</td><td>Fisher</td><td>12548B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold antifade reagente com DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36938</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Para análise de citometria de fluxo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calceína,</td><td>sondas moleculares</td> AM <td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>solução salina balanceada de Hanks (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Para análise de Western Blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-caveolina 1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610406</td><td>Western Blot - 1:1.000</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose (0,2 &mu; m)</td> <td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Western Lightning Plus-ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>BioRad DC Protein Assay</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>BioRad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio monohidratado (DOC)</td> <td>Sigma</td><td>D5670</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP40)</td> <td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acrilamida/bis a 30%, 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td></td></tr></tbody></table>

a mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e investigando intercelular comunicação

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Compreender as interações heterotípicos precoces entre células cancerosas e torno estroma não-cancerosas é importante para elucidar os acontecimentos que levaram à activação do estroma e estabelecimento do microambiente do tumor (TME). Vários in vitro e em modelos in vivo de o TME foram desenvolvidos; No entanto, em geral, estes modelos não prontamente permitir o isolamento de populações de células individuais, sob condições não perturbando, para um estudo mais aprofundado. Para contornar esta dificuldade, temos utilizado um modelo TME in vitro utilizando um substrato de crescimento de células que consiste de uma inserção da membrana microporosa permeável que permite a geração simples de populações de células altamente enriquecido crescido intimamente, mas separadamente, em cada lado da membrana da pastilha para co prolongado vezes -Cultura. Através da utilização deste modelo, são capazes de gerar fibroblastos associados ao câncer grandemente enriquecido (CAF) populações de fibroblastos humanos diplóides normais seguinteco-cultura (120 h) com células de carcinoma da mama humano altamente metastáticas, sem o uso de marcação fluorescente e / ou separação de células. Além disso, através da modulação do tamanho de poro da pastilha, que podem controlar o modo de comunicação intercelular (por exemplo, comunicação GAP-junção, factores segregados) entre as duas populações de células heterotípicas, que permite a investigação dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do TME, incluindo o papel da permeabilidade gap-junction. Este modelo serve como uma ferramenta valiosa para melhorar a nossa compreensão dos eventos iniciais que conduzem à iniciação do cancro de estroma, o começo da evolução da TME, e o efeito modulador do estroma das respostas de células de cancro a agentes terapêuticos.

Aqui nós adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável ao desenvolvimento de um sistema de co-cultura de células heterotípica in vitro que simula o microambiente do tumor in vivo (Figura 1). Este sistema permite a duas diferentes populações de células a serem cultivadas em ambos os lados da membrana porosa da inserção por longos períodos de tempo (até 120 horas, em nosso uso). É importante salientar o sistema é capaz de manter a pureza das po...

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

O objetivo geral deste modelo simples de cocultura in vitro é imitar as características de um microambiente tumoral in vivo, enriquecer populações celulares individuais e investigar diversos modos de comunicação intercelular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de oncologia e radiobiologia, especificamente no que diz respeito aos fatores subjacentes à geração de fibroblastos associados ao câncer e às respostas a agentes terapêuticos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a obtenção de populações celulares individuais a partir de uma cultura celular mista, sem a necessidade de marcadores fluorescentes ou separação celular que induzam estresse.Inicie lavando a cultura celular de interesse duas vezes com cinco mililitros de PBS. Após a segunda lavagem, desprenda as células com um mililitro de tripsina-EDTA à temperatura ambiente por dois minutos. Em seguida, interrompa a reação com nove mililitros de meio de crescimento completo, pipetando suavemente o meio sobre a superfície do frasco 10 vezes para dissociar as células.Após a contagem, dilua as células até uma concentração de 2,5 vezes 10 à quinta células por mililitro em meio fresco e

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Xenoenxertos derivados de pacientes de glioblastoma multiforme podem ser miniaturizados em microtumores vivos usando o sistema de cultura de biogel humano 3D. Este ensaio tumoral 3D semelhante ao in vivo é adequado para testes de resposta a medicamentos e perfis moleculares, incluindo análise cinômica.

Geração de Microtumors Usando 3D Biogel Humano Sistema de Cultura e células de glioblastoma derivado do paciente para Kinomic Profiling e Testes resposta à droga

As células cancerígenas são incorporadas em um gel de colágeno e, em seguida, ensanduichadas em um gel de fibrina acelular para gerar um sistema de cultura 3D no qual a invasividade e a formação de tumores satélites podem ser monitoradas.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

Parácrina e justácrina interacções celulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Aqui, um método de cultura proximal é usado para estudar a sinalização parácrina onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas, evitando o contato direto do celular.

Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

O objetivo do método apresentado aqui é mostrar como Microarrays microambiente (MEMA) pode ser fabricado e usado para interrogar o impacto de milhares de microambientes combinatórios simples sobre o fenótipo de células cultivadas.

Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

Descrevemos uma abordagem para detectar e capturar subpopulações celulares invasivas em tempo real. O projeto experimental utiliza a Análise Celular em Tempo Real monitorando mudanças na impedância elétrica das células. Podem ser capturados câncer invasivo, células endoteliais ou estromais em tecidos complexos, e o impacto das co-culturas pode ser avaliado.

Detecção e Captura em Tempo Real de Subpopulações celulares invasoras de co-culturas

Aqui, detalhamos um protocolo simples, rápido e confiável assistido por citometria de fluxo multiparamétrico e tumor em um chip para monitorar e caracterizar as etapas que constituem o ciclo de imunidade ao câncer. De fato, uma compreensão completa das interações entre câncer e células imunológicas fornece insights críticos para superar os tumores e orientar o atendimento clínico.

Sistemas de co-cultura in vitro para reproduzir o ciclo de imunidade ao câncer

Aqui, apresentamos protocolos que detalham instruções para a implementação de culturas de células 3D usando matrizes de colágeno e colágeno-agarose em um sistema microfisiológico. Esses protocolos suportam a co-cultura de esferoides de túbulo proximal renal e carcinoma de células renais, simulando condições in vivo e permitindo a investigação avançada das interações das células cancerígenas renais.

Co-cultura microfluídica de epitélio renal saudável e tumoral para modelar a progressão do câncer renal

Há uma necessidade crítica de modelos 3D de câncer que capturem crosstalk heterocelular para estudar a metástase do câncer. Nosso estudo apresenta a geração de estroma-epitelial heteromulticelular em um ambiente scaffold e scaffold-free que pode ser usado para estudar a invasão e as distribuições espaciais celulares.

Células estromais heteromulticelulares em culturas 3D sem andaimes de células epiteliais cancerígenas para impulsionar a invasão

Aprenda a criar um modelo de cocultura in vitro simples que imita o microambiente tumoral in vivo, enriquecendo populações celulares e investigando a comunicação intercelular sem técnicas estressantes de marcação fluorescente.

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