A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

O objetivo geral deste modelo simples de cocultura in vitro é imitar as características de um microambiente tumoral in vivo, enriquecer populações de células individuais e investigar vários modos de comunicação intercelular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos do câncer e da radiobiologia, especificamente em relação aos fatores subjacentes à geração de fibroblastos associados ao câncer e às respostas aos agentes terapêuticos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração de populações de células individuais a partir de uma cultura de células mistas sem marcação de fluorescência indutora de estresse ou classificação de células.

Comece lavando a cultura de células de interesse duas vezes com cinco mililitros de PBS. Após a segunda lavagem, retire as células com um mililitro de tripsina-EDTA à temperatura ambiente por dois minutos em temperatura ambiente. Em seguida, extinguir a reação com nove mililitros de meio de crescimento completo, pipetando suavemente o meio sobre a superfície do frasco 10 vezes para dissociar as células.

Após a contagem, diluir as células para uma concentração de 2,5 vezes 10 elevado a quinto células por mililitro em meio fresco e transferir as células para um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Gire as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em meio de crescimento fresco suplementado com 50% de soro bovino fetal a 2,5 vezes 10 elevado à quinta célula por 70 microlitros de concentração média. Em seguida, transfira as inserções do tamanho de poro experimental apropriado de sua embalagem para poços individuais de um prato de vários poços e cubra o prato.

Em seguida, segurando o prato com as duas mãos, inverta-o suavemente até que o fundo da inserção esteja voltado para cima. Retire o fundo do prato. Usando uma pinça estéril em uma mão, segure uma inserção no lugar e use a outra mão para aspirar lentamente 70 microlitros de células em uma ponta de micropipeta.

Em seguida, distribua lentamente as células pela superfície do que agora é a parte superior da inserção. Após semear cada uma das inserções, recoloque cuidadosamente o fundo do prato e incube o prato invertido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com umidade por 30 a 45 minutos. No final da incubação, em um gabinete de segurança biológica de fluxo laminar, inverta cuidadosamente o prato de forma que o fundo das inserções fique voltado para baixo.

Em seguida, mergulhe lenta e cuidadosamente o fundo de cada inserção em dois mililitros de meio completo pré-aquecido e coloque o prato de volta na incubadora umidificada. Após 48 horas, substitua o meio no fundo de cada poço por dois mililitros de meio de crescimento fresco. Quando todo o meio estiver atualizado, semeie 2,5 vezes 10 até a quinta célula da segunda população de interesse no topo das inserções em um mililitro de meio fresco e devolva o prato à incubadora.

24, 48 e 96 horas depois, substitua o meio na parte superior de cada inserção por um mililitro de meio completo fresco. E o meio no fundo de cada poço com dois mililitros de meio completo fresco. Após 120 horas de cocultura, transfira uma inserção de cada vez para placas individuais de cultura de células de 35 milímetros contendo um mililitro de PBS.

E lave a parte inferior e superior das inserções com um mililitro de PBS. Para coletar as células cultivadas na parte inferior da inserção, coloque as inserções com o lado inferior voltado para baixo em 200 microlitros de tripsina-EDTA à temperatura ambiente. Após dois minutos em temperatura ambiente, pare a reação com 800 microlitros de meio de crescimento completo.

Em seguida, segurando o inserto em um pequeno ângulo, pipete suavemente o sobrenadante sobre a superfície das células 10 vezes, coletando as células no prato. Quando todas as inserções tiverem sido removidas, ressuspenda as células a uma concentração de duas vezes 10 elevado a quintas células por mililitro de meio de crescimento. E adicione 250 microlitros de células em lamínulas de vidro individuais estéreis.

Coloque as lamínulas na incubadora umidificada por uma hora. No final da incubação, em uma cabine de segurança biológica de fluxo laminar, adicione cuidadosamente dois mililitros de meio de crescimento completo ao prato e incube a 37 graus Celsius e 5% por cento de dióxido de carbono com umidade por 48 horas. Em seguida, lave as células três vezes com PBS.

Após a terceira lavagem, fixe as células em 4% de formaldeído em PBS por dez minutos em temperatura ambiente, seguidas de cinco lavagens com solução salina tamponada com Tris. Após a última lavagem, permeabilizar as células com 0,25% Triton X-100 suplementado com saponina 0,1 por cinco minutos em temperatura ambiente, seguido de incubação em solução bloqueadora por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, rotule as amostras com o anticorpo primário de interesse na solução de bloqueio a quatro graus Celsius durante a noite.

Na manhã seguinte, remover o anticorpo não ligado com lavagens de três minutos em solução de lavagem, seguidas de uma incubação à temperatura ambiente de uma hora no anticorpo secundário adequado em solução de bloqueio. No final da incubação, lave o anticorpo secundário não ligado como acabamos de demonstrar e monte as lamínulas em lâminas individuais com meio de montagem antidesbotamento contendo DAPI. Sele as bordas da lamínula com esmalte transparente.

Em seguida, imagine as células sob ampliação de óleo de 63x em um microscópio invertido equipado com uma fonte de luz externa para excitação de fluorescência. Este sistema permite que duas populações de células diferentes sejam cultivadas em ambos os lados das membranas porosas das inserções de cultura de células por pelo menos 120 horas, mantendo uma pureza superior a 99% nas populações de células em ambos os lados da membrana, quando inserções com poros de 0,4 ou um mícron são usadas. As inserções com poros de três mícrons, no entanto, são grandes o suficiente para permitir que as células migrem através da membrana, conforme observado neste experimento usando uma linha celular de câncer de mama humano positiva para GFP.

As inserções de poros de 0,4 mícron também limitam a formação de junções comunicantes funcionais entre as culturas de células em ambos os lados da inserção, restringindo a comunicação aos fatores secretados. Inserções com poros de um e três mícrons, no entanto, permitem o acoplamento funcional das células através das junções comunicantes, conforme indicado pela transferência do marcador fluorescente através da membrana nessas coculturas. É importante ressaltar que este sistema pode ser usado para gerar efetivamente fibroblastos associados ao câncer a partir de fibroblastos diplóides humanos normais após sua cocultura com células de câncer de mama, como evidenciado pela expressão reduzida de caveolina-1 nos fibroblastos cocultivados com as células de câncer de mama humano.

Ao tentar este procedimento, é importante selecionar inserções com um tamanho de poro adequado para a questão que está sendo explorada. E ver a primeira população de células na parte inferior da inserção em meio que facilita sua fixação. Após este procedimento, outros métodos como immunoblotting, imunofluorescência in-situ ou a maioria dos outros ensaios baseados em células podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre alterações na expressão de proteínas, alterações na invasão e migração ou diferenças nas respostas a agentes terapêuticos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do câncer e da biologia da radiação explorarem os fatores que contribuem para o desenvolvimento, a evolução do microambiente tumoral e, em nosso caso, para a disseminação dos efeitos nocivos da radiação ionizante das células-alvo com radiação para as células espectadoras nas proximidades. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar uma cocultura de células mistas, manter a cocultura e colher populações de células enriquecidas de alta pureza da cocultura para análise posterior. Não se esqueça de que trabalhar com cepas de células humanas ou linhagens celulares pode ser perigoso e que o equipamento de proteção individual adequado deve ser usado e os regulamentos de biossegurança adequados devem ser cumpridos durante a execução deste procedimento.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.