Um método simples para glucosinolatos Extracção e análise com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)

O objetivo geral deste protocolo é realizar uma análise fácil e direta de glucosinolatos em plantas e outras amostras biológicas. Este método, para extrair e analisar glucosinolatos, pode ser usado para responder a perguntas-chave em ecologia de plantas-insetos, patologia vegetal, melhoramento de plantas e ciências alimentares. A principal vantagem dessa técnica é que ela é bem validada e amplamente aplicável a uma ampla gama de amostras biológicas.

Embora este método seja usado principalmente para quantificar glucosinolatos em materiais vegetais, ele também pode ser aplicado a solos ou alimentos preparados. Este procedimento de extração pode ser realizado em quase qualquer laboratório porque você usa principalmente equipamentos de laboratório padrão. Geralmente, os indivíduos novos neste método realizarão melhor as análises e inspeções quando lerem e observarem o filme pelo menos uma vez.

Para iniciar o procedimento, misture 10 gramas de gel de dextrina reticunada G-25 com 125 mililitros de água ultrapura. Armazene a mistura em uma garrafa tampada a 4 graus Celsius. Em seguida, dissolva 10.000 unidades de arilsulfatase tipo H-1 em 30 mililitros de água ultrapura.

Adicione a isso 30 mililitros de etanol absoluto e mexa bem a mistura. Centrifugue a mistura a 2.650 vezes G por 20 minutos em temperatura ambiente. Combinar o sobrenadante com 90 mililitros de etanol absoluto num copo.

Misture e despeje em novos tubos de centrífuga. Centrifugue a mistura a 1.030 vezes G por 15 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.

Dissolva e misture os pellets em um total de 25 mililitros de água ultrapura. Vortex bem a mistura e depois transfira a mistura para tubos de 1 mililitro. Armazene as amostras de sulfatoto a 20 graus Celsius por até um ano.

Em seguida, pese cerca de 90 miligramas de sinograma e registre o peso com precisão de 1 micrograma. Em seguida, dissolva o monohidrato do sinograma em 10 mililitros de água ultrapura. Preparar a partir desta solução-mãe de sinograma cinco soluções de referência com concentrações compreendidas entre 50 e 750 micromolares.

Armazene as soluções de referência em tubos de 1,5 mililitro a 20 graus Celsius. Em seguida, para cada amostra e referência, rotule um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros em uma posição de suporte de coluna. Perfure cada tampa do tubo de microcentrífuga com uma agulha de dissecação para posterior liofilização.

Coloque os tubos rotulados em um bloco na mesma configuração e espaçamento das colunas rotuladas. Para preparar as colunas de pipeta de vidro, use uma haste de madeira ou vidro para pressionar suavemente um pedaço de lã de vidro de 1 centímetro por 1 centímetro na pipeta. Embale a lã de vidro na transição do cilindro da pipeta para a haste.

Coloque uma coluna de pipeta em cada posição rotulada no rack. Posicione o rack sobre uma bandeja de cera. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de plástico de 1 mililitro.

Agite bem o gel de dextrina preparado. Em seguida, use a ponta da pipeta alargada para carregar 0,5 mililitros de gel de dextrina preparado em cada coluna. Verifique se há vazamento de gel de dextrina nas colunas e substitua as colunas com vazamento.

Depois que todas as colunas estiverem carregadas com gel de dextrina, lave cada coluna com 1 mililitro de água ultrapura. Pese entre 50 e 100 miligramas de material vegetal finamente moído em um tubo de reação de 2 mililitros com tampa de segurança e registre o peso com precisão de 0,1 miligramas. Coloque duas esferas de metal de 3 milímetros de diâmetro em cada tubo.

Adicione a cada tubo 1 mililitro de 70% de metanol em água ultrapura e faça um vórtice breve de cada mistura. Feche os tubos com tampas de segurança adicionais e coloque-os imediatamente em um banho-maria de 90 a 92 graus Celsius. Aqueça os tubos até que a serra comece a ferver.

Transfira os tubos para um banho ultrassônico e aqueça as amostras por 15 minutos. Durante a sonicação, comece a descongelar a amostra de sulfatoto e as referências do sinograma. Após a sonicação, centrifugue as amostras a 2.700 vezes G por 10 minutos à temperatura ambiente.

Coloque os sobrenadantes e as referências de sinograma descongeladas nas colunas correspondentes, tomando cuidado para não puxar matéria vegetal para a pipeta. Adicione 1 mililitro de metanol a 70% a cada tubo. Vórtice as misturas.

E aqueça as misturas por ultrassom por 15 minutos. Centrifugue os tubos novamente nas mesmas condições de antes. Colocar os sobrenadantes nas colunas correspondentes.

Adicione duas porções de 1 mililitro de 70% de metanol a cada coluna, permitindo que as colunas sequem entre cada porção. Lave o metanol residual de cada coluna com 1 mililitro de água ultrapura. Em seguida, lave cada coluna com duas porções de 1 mililitro de tampão acetato de sódio 20 milimolares, pH 5,5.

Uma vez que as últimas porções de tampão de acetato de sódio tenham sido drenadas para o cesto de lixo, remova o cesto da bandeja de resíduos e seque os pés do cesto com lenços de papel. Posicione o rack sobre o bloco de tubos de microcentrífuga rotulados, de modo que as pontas da coluna fiquem nos tubos correspondentes. Carregue 20 microlitros de solução de sulfato em cada coluna, garantindo que a solução atinja a superfície do material da coluna.

Lave a solução de sulfatoto no material da coluna com 50 microlitros de tampão acetato de sódio. É muito importante que o sulfatoto seja lavado para dentro da coluna. A enzima deve estar na coluna para reagir aos glucosinolatos intactos ligados na coluna.

Uma vez lavada a solução de sulfatoto em cada coluna, cubra-as com papel alumínio. Deixe as colunas permanecerem durante a noite. Em seguida, aluda aos dessulfo-glucosinolatos de cada coluna com duas porções de 0,75 mililitro de água ultrapura.

Depois que as colunas secarem, remova o suporte da coluna e tampe cada tubo. Congele os tubos em nitrogênio líquido ou a 80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Liofilizar as amostras durante 12 a 24 horas.

Dissolva cada resíduo em 1 mililitro de água ultrapura. Em seguida, transfira cada amostra e referência para frascos de amostra de HPLC rotulados. Separar os extractos numa coluna CAT de fase inversa.

Use um comprimento de onda de detecção de 229 nanômetros. Uma vez separados por HPLC, os glucosinolatos podem ser identificados por comparação dos tempos de retenção e espectros UV com padrões conhecidos de glucosinolato. As concentrações de glucosinolato na amostra são calculadas a partir de uma curva de calibração do sinograma e valores da literatura para fatores de resposta.

A partir disso, as concentrações de glucosinolato na amostra original da planta podem ser determinadas. Nas condições de HPLC utilizadas, a progoitrina insalubre muito cedo e é separada da glucorafanina biologicamente benéfica. Os endo-glucosinolatos também são bem separados.

Séries liotrópicas são observadas com elos de cadeia lateral crescentes para alconol, metilfol-alconol e metil-solfinol-glicosinolato de cadeia mais longa. Glucosinolatos desconhecidos, portanto, podem ser classificados provisoriamente com base nessas séries liotrópicas em combinação com espectros UV. Com a preparação adequada, 150 a 200 amostras podem ser extraídas por uma pessoa em um dia útil.

Levará mais um dia para aludir às colunas, liofilizar as amostras e prepará-las para HPLC. Após este procedimento, outros métodos, como LCMS, podem ser aplicados para identificar dessulfo-glucosinolatos desconhecidos em seu cromatograma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair glucosinolatos de suas amostras biológicas e analisá-los via HPLC.

Não se esqueça de que trabalhar com metanol pode ser extremamente perigoso e deve ser sempre feito sob a capela