Name: Um método simples para glucosinolatos Extracção e análise com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda um método simples de extração e análise de glucosinolatos em plantas usando cromatografia líquida de alta pressão. Esta técnica validada é aplicável a ecologia, patologia vegetal e ciências de alimentos.

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NMvD agradece ao Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Alemanha) por fornecer as primeiras amostras de referência quando ela começou a usar esse método há 16 anos. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, Holanda), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, Holanda) e Christian Ristok (iDiv, Leipzig) são reconhecidos por melhorar o protocolo ao longo dos anos. Mirka Macel e Martine Huberty (Universidade Tübingen, Alemanha) são reconhecidas por sua permissão para usar o cromatograma de Rorippa. Os autores agradecem o apoio do Centro Alemão de Pesquisa Integrativa em Biodiversidade (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (FZT 118).

1. Preparação de soluções necessárias para o glucosinolatos Extração <ol><li> Preparar 500 ml de metanol a 70% (MeOH) em água (ultrapura) num frasco de vidro. Para amostras de 100 e 5 padrões, 420 mL de 70% MeOH é necessário. </li><li> Preparar 20 mM de acetato de sódio (NaOAc) (pH = 5,5) pela adição de 0,82 g de NaOAc ou 1,36 g de NaOAc x 3 H2O em 500 mL de água; ajustar o pH com ácido clorídrico (HCl). Armazenar o NaOAc na geladeira. Para amostras de 100 e 5 padrões, 370 mL de NaOAc 20 mM (pH = 5,5) em água é necessária. </li><li> Para preparar o material da coluna, misturar 10 g de gel de dextrano reticulado (tipo G-25) com 125 ml de água ultrapura. Armazenar a mistura resultante no frigorífico (4 ° C). </li><li> Preparação da solução de sulfatase <ol><li> Dissolve-se 10.000 unidades de sulfatase de arilo (tipo H-1 a partir de Helix pomatia) em 30 ml de água ultrapura e adicionar 30 mL de etanol absoluto (EtOH). Misture bem a solução e transferi-lo para um CEN 250 mltubo trifuge ou vários tubos menores, dependendo da disponibilidade. </li><li> Centrifugar a mistura a 2650 xg durante 20 min à temperatura ambiente (RT). Transferir o sobrenadante (s) para uma proveta; adicionar 90 ml de EtOH e misturá-lo. Centrifugar a mistura em um ou mais tubos de centrifugação a 1030 xg durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante. Dissolve-se e combinar os microgrânulos num total de 25 ml de água ultrapura. Vortex bem, dispensar em 1 ml tubos, e armazenar em um congelador a -20 ° C; eles vão manter por pelo menos um ano. </li></ol></li><li> Preparação da solução de referência sinigrin <ol><li> Pesa-se cerca de 9 mg de mono-hidrato de sinigrin com 1? G de precisão (por exemplo, 8,769 mg). Transferi-la para um balão volumétrico de 10 ml e dissolve-se o mono-hidrato de sinigrin em 10,0 ml de água ultrapura. </li><li> Calcula-se a molaridade da solução de estoque e preparar cinco referências sinigrin entre 50-750 uM por diluição da solução-mãe. Para um exemplo detalhado, consulte<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">Suplementar S1 arquivo</a> . </li><li> Dispensar a diferentes referências sinigrin em tubos de reacção de 1,5 mL e congelá-los a 20 ° C. Incluem uma série de cinco referências sinigrin em cada lote de extracção. Sempre use os valores molarity corretos para o usado atualmente sinigrin referências ao calcular as concentrações. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do Setup Extração <ol><li> Prepara-se uma coluna de cremalheira para as colunas pipeta de Pasteur (para a preparação de colunas, ver passo 3.1). Rotular o rack ou as colunas para manter o controle dos números de amostra (ver Figura 1). </li><li> Preparar um bloco que prende o mesmo número de tubos de microcentrífuga rotulados de 2 ml (ver passo 3.3 e a Figura 1) </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Rack para extração de glucosinolatos. Vista frontal (esquerda) e vista de cima (direita) de um rack coluna self-made e bloqueio para a extração de glucosinolatos. Altura: 100 mm, a distância entre os orifícios deslocados (para segurar as colunas pipeta de Pasteur): 30 mm (eixo X) x 15 mm (eixo dos y). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 3. Preparação das Colunas e microtubos <ol><li> Prepare uma coluna por amostra e cinco colunas extras para as cinco amostras de referência sinigrin. <ol><li> Em cada pipeta de vidro, coloque um pedaço de lã de vidro cerca de 1 cm x 1 cm. Utilizar um pedaço de madeira ou de vidro para empurrar a lã de vidro para baixo para o ponto em que a pipeta se estreita. A lã de vidro deve impedir que o material da coluna de esgotar-se, mas não use demais, uma vez que irá retardar a eluição das colunas. Usar luvas de when trabalhando com a lã de vidro. </li></ol></li><li> Colocar as colunas na cremalheira coluna (ver Figura 1). Coloque o rack coluna em um (a bandeja de resíduos) bandeja de laboratório para pegar os eluentes usados ​​para as lavagens da coluna consecutivos. </li><li> Cortar os primeiros 5 mm da ponta de uma ponta de pipeta de plástico de 1 ml e pipeta 0,5 ml de material da coluna preparada (G-25 de gel em água, ver passo 1.3) em cada coluna. Agitar o frasco contendo o material da coluna bem antes de pipetar. Descartar colunas vazamento (materiais G-25 a esgotar-se através da camada de lã de vidro) e substitua por novas. <ol><li> Após pipetar o material da coluna para as colunas, adicionar 1 ml de água ultrapura para lavar para baixo o material. </li></ol></li><li> Preparar um tubo de reacção de 2 ml por amostra e cinco tubos para as cinco amostras de referência sinigrin; classificá-los. Use uma agulha de dissecação para fazer furos nas tampas para depois de liofilização e colocar os tubos preparados para o bloco de tubos no mesmo padrão exato como ocolunas (passo 2.2, ver Figura 1). </li></ol> 4. Extracção do Glucosinolatos <ol><li> Pesar liofilizado e material vegetal finamente moído (geralmente 50,0-100,0 mg de peso seco; as concentrações finais de glucosinolato no extracto deve estar na gama da curva de referência) com a aproximação de 0,1 mg em 2 ml, marcado, rodada -bottom tubos de reacção. Adicionar duas pequenas bolas de metal (3 mm de diâmetro) como retardadores de ebulição para cada tubo. NOTA: O protocolo também pode ser aplicado aos materiais frescos, congelados rapidamente, que foram triturados em azoto líquido e mantido congelado até à extracção. Aumentar a quantidade de material pesado para a extracção e a percentagem de MeOH em líquido de extracção a 85% para compensar a diluição pela água no material 19. </li><li> Pipete 1 mL de 70% de MeOH em cada tubo e agitar com vortex brevemente. Feche os tubos e selá-los com tampas de segurança antes de colocá-los tão rapidamente quanto possível em um hot water banho (90-92 ° C) por alguns minutos (~ 5 min), até o 70% MeOH apenas ferve. Cuidado: Use óculos de segurança durante esta etapa! </li><li> Colocar os tubos de ensaio num banho de ultra-sons durante 15 min. Enquanto isso, pegue a sulfatase e as cinco amostras de referência sinigrin fora do congelador para descongelar-los à temperatura ambiente. </li><li> Após a ultra-sonicação, centrifugar os tubos de amostra em 2.700 xg numa centrífuga de bancada durante 10 min à temperatura ambiente; um sedimento deve formar em cada tubo. Adicionar o sobrenadante para as colunas rotuladas e pipeta as amostras de referência de cinco em colunas separadas. <ol><li> Enquanto pipetando os sobrenadantes, manter a ponta bem acima do pellet para evitar materiais vegetais pipetagem. Note-se que quando as amostras secas são utilizadas, o volume de sobrenadante será menor do que 1,0 mL. </li></ol></li><li> Adicionar 1 mL de 70% MeOH para os peletes remanescentes nos tubos de amostra e os tubos vortex antes de os colocar num banho de ultra-sons durante 15 min. Centrifugar os tubos novamente, tal como no passo 4.4, e adicionar a supernates às respectivas colunas; devido às propriedades do material da coluna, o grupo sulfato carregados negativamente dos glucosinolatos será especificamente retidos na coluna. </li><li> Lavar as colunas com os extratos em três etapas sequenciais. <ol><li> Pipeta 2 x 1 mL de 70% de MeOH em cada coluna. Aguarde até que a coluna para secar antes de adicionar os próximos 1 mL; este vai remover mais compostos a partir dos extractos apoiares (por exemplo, clorofila). </li><li> Lave o MeOH por adição de 1 ml de água ultrapura para cada coluna. </li><li> Pipeta de 2 x 1 mL de 20 mM NaOAc tampão para cada coluna para criar as condições ideais para a reação sulfatase. </li></ol></li><li> Leve o rack com as colunas para fora da bandeja de resíduos e secar os pés do rack com um lenço de papel. Coloque o rack sobre o bloco com frascos e tubos rotulados. Certifique-se de que cada ponta coluna é na correspondente, marcado, tubo de 2 mL (ver Figura 1). </li><li> Adicionar 20 ul de soluti sulfataseem que as colunas. Certifique-se de que a sulfatase atinge a superfície do material da coluna. Pipeta de 50 mL de NaOAc tampão em cada coluna para jogar na sulfatase. Cubra as colunas com folha de alumínio e deixe descansar durante a noite. NOTA: Devido às actividades da sulfatase, o grupo sulfato vai ser removido, libertando os desulfoglucosinolates a partir da coluna de modo que eles podem eluir com água. Para uma descrição detalhada, consulte Crocoll et al. 19. </li><li> No dia seguinte, as eluir desulfoglucosinolates pipetando 2 x 0,75 ml de água ultrapura para cada coluna. Quando todas as colunas secaram, levante o rack de coluna e removê-lo a partir dos tubos de reacção. <ol><li> Tampe os tubos (certifique-se de que existem furos nas tampas) e congelá-los em nitrogênio líquido ou em -80 ° C congelador por 30 min. Liofilizar as amostras durante 12-24 horas (dependendo do número de amostras e a capacidade do liofilizador) para remover toda a água. </li></ol></li> &lt;li&gt; Após liofilização, re-dissolve-se o resíduo num volume exacto (normalmente 1,0 mL) de água ultrapura. Transferir as amostras e as cinco referências sinigrin para frascos de HPLC rotulados. Manter as amostras no frigorífico (4 ° C) durante até duas semanas ou de um congelador (-20 ° C) durante até um ano antes de analisar os com HPLC. </li><li> Deixe o vidro secar colunas sob o capô durante a noite e descartá-los quando seca. Recuperar as bolas de metal dos tubos de amostra utilizados no passo 4,5 para reutilização e colocar os tubos no escaninho da eliminação de resíduos. </li></ol> 5. As medições de HPLC de amostras extraídas <ol><li> Separa-se os glucosinolatos em um de fase inversa C 18 coluna (4,6 x 150 mm, 3 um, 300 A) com um gradiente de acetonitrilo-água (ver Tabela 1) e um fluxo de 0,75 mL / min e uma temperatura de coluna de 40 ° C . Realizar a detecção e quantificação a 229 nm. </li><li> Meça as referências sinigrin na mesma coluna, mas com um gradiente adaptadaMétodo para reduzir a utilização de solventes (ver Quadro 2). Começar com cinco injectando as referências sinigrin, começando com o de referência com a concentração mais baixa. Em seguida, injectar as amostras, incluindo uma injecção de metanol (em branco) depois de cada amostra X para limpar a coluna e para evitar o arrastamento de picos. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo [min] </td><td> Fluxo [mL / min] </td><td> % Uma água </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 0,750 </td><td> 65 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Temperatura da coluna 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabela 1: gradiente de acetonitrilo-água para a separação de glucosinolatos e analysis em HPLC de fase inversa. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo [min] </td><td> Fluxo [mL / min] </td><td> % Uma água </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0,750 </td><td> 89,3 </td><td> 10,7 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 0,750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Temperatura da coluna 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabela 2: encurtado gradiente de acetonitrilo-água para a quantificação dos cinco referências sinigrin utilizados para a quantificação de glucosinolatos. 6. glucosinolatos identificação e quantificação <ol><li> Identificação <ol><li> Comparar os tempos de espectros de UV e de retenção dos picos nas amostras com sucesso comercialmentecapazes, referências glucosinolatos puros. Veja a Figura 2 para exemplos de espectros de UV das várias classes de glucosinolatos. </li><li> Identificar glucosinolatos desconhecidos com padrões de referência ou em LC-MS 18, 19, se possível. </li><li> Identificar glucosinolatos desconhecidos com ressonância magnética nuclear (RMN), se possível. </li><li> Comparar os tempos de espectros de UV e de retenção dos picos com aqueles na Figura 2 e Tabela referências 3, bancos de dados, ou da literatura. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> Figura 2. Os espectros de UV das classes mais comuns de glucosinolato. UV espectro de absorção (200-350 nm) de seis desulfoglucosinolates (GSL), com base em soluções feitas de compostos de referência disponíveis comercialmente extraídos, conforme descrito aqui, representando as classes estruturais mais comuns. O nome comum, snome tructural (entre parênteses), e classe estrutural são dadas. (A) sinigrin (2-propenil GSL), alcenilo; (B) glucoerucin (4-metiltiobutilo GSL), thioalkenyl; (C) glucorafanina (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinilo; (D) glucobrassicina (indol-3-ilmetil GSL), indole; (E) gluconasturtiin (2-feniletil GSL), aromático; (F) sinalbin (4-hidroxibenzil GSL), aromático. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="2"><li> quantificação <ol><li> Integrar a área sob os picos dos cinco referências sinigrin e as amostras. </li><li> Calcular uma curva de calibração das cinco referências sinigrin medidos com base na área integrada. Use a equação da linha de regressão (ver Equação 1) para calcular o valor interpolado de glucosinolatos (ver Equação 2).</li><li> Para calcular a concentração dos diferentes glucosinolatos, multiplicar o valor interpolado (x) pelo factor de resposta (M) para a detecção a 229 nm a partir de CE (1990) 16, de Buchner (1987) 15, ou Brown et ai. (1993) 17; os factores de resposta de consenso da desulphoglucosinolates mais vulgarmente detectados são dadas na Tabela 3. NOTA: Os factores de resposta pode variar entre sistemas de esta pode ser a razão que existem diferentes valores dados por diferentes referências (ver Referências 15-17). No entanto, os valores são na sua maioria muito estreita e em uma escala semelhante com classes estruturais. Seguindo a convenção, definir o factor de resposta de glucosinolatos não identificados como 1, embora para glucosinolatos de indolo desconhecidos com um espectro de UV semelhante ao do glucobrassicina e outros glucosinolatos de indolo (Figura 2), que seria aconselhável a utilização de 0,25, como um factor de resposta para se obteruma estimativa realista da concentração (Tabela 3). </li><li> Para calcular o montante final da glucosinolatos (x t) na amostra, tomar o fator de diluição (D) e da massa de amostra (w) utilizados para a análise em conta (ver Equação 3). <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> (1) <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> (2) <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> (3) Y = área do pico m = declive da curva de regressão de referência de 5 pontos c = a intercepção da linha de regressão com o eixo y X = quantidade de glucosinolatos no extrato x T = concentração de glucosinolatos na amostra planta D = factor de diluição H = factor de resposta para a detecção a 229 nm a partir de Buchner (1987) ou Brown et ai. (1993) w = massa de amostra utilizada para a extração </li></ol></li></ol>

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<li>Gols, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1439179106000892">Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions.</a> Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As maiores vantagens deste método estabelecido e amplamente utilizado é que ela é robusta, bastante simples e relativamente de baixo custo por amostra. A maior parte do equipamento necessário para a extracção e análise devem estar disponíveis em um padrão de laboratório ou podem ser auto-construído, com a excepção de o HPLC-PDA. Outra vantagem é que desulfoglucosinolates dissolvidos em água são quimicamente muito estável quando mantido frio e em (HPLC) frascos hermeticamente fechados, de modo que os extractos poderia ser facilmente enviado para análise por HPLC em outro lugar. Em contraste com plataformas LC-MS, que exigem formação e vasta experiência prática para a gestão do software e análise de dados especializados, HPLC-UV / PDAs pode ser facilmente executado depois de um curto período de treinamento. Isto não só reduz os custos do processo, mas também torna este método mais acessível para uma ampla gama de cientistas, incluindo estudantes. Geralmente, quando os procedimentos descritos acima são seguidos carefully, alguns problemas devem ocorrer. Em geral, os picos de glucosinolato são muito bem separados no cromatograma. Se este não for o caso, o programa de gradiente pode ser adaptado por diminuir a taxa de aumento de acetonitrilo no eluente. Em alternativa, a construção de uma nova pré-coluna (200-500 injeções) ou coluna (1.500 -2.000 injeções) podem resolver o problema. Ocasionalmente, cromatogramas de amostras únicas em um lote pode mostrar muito pequeno ou nenhum pico. Isto é geralmente devido a erros de pipetagem ao adicionar o sulfatases (por exemplo, uma coluna foi ignorado ou a sulfatase não foi devidamente lavado para dentro da coluna). Alternativamente, a concentração de glucosinolatos nos materiais experimentais pode ter sido menor do que o esperado e muito pouco material foi utilizado para a extracção. Se este for o caso, o volume de injecção pode ser aumentada para 100? L, ou uma alíquota exacta (por exemplo, 800 ul) de o extracto pode ser concentrado. Esta última poderia ser conseguida por congelamento-secoing o extracto, dissolução do resíduo num volume mais pequeno (por exemplo, 100 mL) de água, e reinjecção usando a mesma curva de referência. Nos cálculos para a concentração original do extrato, os números devem ser multiplicados pelo factor de diluição. Se isto não resolve o problema, os materiais devem ser extraídas novamente utilizando mais material de partida. Se este é mais do que 100 mg, o volume dos solventes de extracção e o tamanho dos tubos deve ser ajustado proporcionalmente para manter a eficiência da extracção. Uma vantagem adicional é que este método tem sido bem validada. Isso é porque ele tem sido descrito como um método padrão para a quantificação dos glucosinolatos em colza, para os quais os procedimentos e precisão foram confirmadas em vários laboratórios 16. Além disso, o fundo genético, a biossíntese, e as funções biológicas de glucosinolatos estão sujeitos a esforços intensos de investigação, no model espécies de plantas de Arabidopsis thaliana, entre outros 4, 6, 12. Por isso, muitos factores de resposta para a quantificação exacta de desulfoglucosinolates em relação ao sinigrin são bem definidas e divulgadas publicamente 15,17. Apesar de protocolos baseados no LS-MS são mais de alto rendimento, mais sensível, e são capazes de (tentativamente) identificar glucosinolatos para os quais não há padrões estão disponíveis 18, 19, 20, a falta de factores de resposta universais para LC-MS limita o quantificação exacta das concentrações de glucosinolatos 18. Além disso, estes métodos geralmente não inclui um passo de liofilização, e a quantidade de água no material de planta fresco é desaparecidos nos cálculos, tornando difícil a quantificação exacta. Por último, porque o nosso método de extração envolve uma base colunapurificação e o passo de concentração, que também pode ser aplicado a amostras &quot;sujas&quot; com baixas concentrações de glucosinolatos, tais como solos 21. Em comparação com os métodos baseados em LC-MS, que normalmente extrair recém materiais congelados, utilizam placas de 96 poços, durante a extracção, e não incluem um passo de sulfatase 18, 19, o nosso método é relativamente moroso e de trabalho intenso. Com as prateleiras de coluna descritas neste documento, uma única pessoa pode extrair cerca de 100-150 amostras em um dia. Eluição (dia seguinte), congelar secagem (overnight), e re-dissolução pode ocorrer nos dois dias seguintes. Com um injector automático HPLC, uma corrida e equilíbrio de tempo de 40-45 minutos por injeção, e sem imprevistos, levaria 3-4 dias para obter os dados para este conjunto de amostras. Quando o software de HPLC permite a quantificação automático com base na curva sinigrin, uma verificação manual dos cromatogramas e PEatribuições ak para 100 amostras só pode tomar outro 1 ou 2 h antes de os dados podem ser usados ​​para análises estatísticas. Apesar da crescente disponibilidade de padrões de glucosinolatos, apenas uma pequena fração dos mais de 130 candidatos atualmente pode ser comercialmente comprado. No entanto, com algumas referências para cada uma das classes biossintéticas; acesso a bases de dados de literatura que especifiquem os compostos anteriormente encontrados nas espécies de plantas (por exemplo, Fahey et al 22.); conhecimento básico dos princípios cromatograf icos, tais como a lógica de série eluotropic (por exemplo, para um número crescente de Cs na cadeia lateral nos compostos alifáticos, as Figuras 3 e 4); e a validação de amostras simples de LC-MS 19 ou glucosinolatos isolados no RMN 23, pode-se facilmente ultrapassar esta limitação. A maioria dos protocolos de glucosinolatos analisa usar curvas de referência internos(Isto é, uma certa concentração para a extracção de sinigrin ou sinalbin para a extracção por solvente 16, 17, 19). Principalmente, as curvas de referência internos são mais apropriadas para corrigir erros de processamento de amostras individuais e, assim, teoricamente, produzir uma maior precisão. Apesar desta vantagem, é preferível utilizar uma curva de referência externo de cinco pontos, como frequentemente analisar diferentes espécies selvagens, alguns dos quais contêm níveis elevados de sinigrin (por exemplo, Brassica nigra 24) ou sinalbin (por exemplo, Sinapis alba 25), o duas referências glucosinolatos para o qual factores de resposta estão disponíveis. Além disso, a adição de padrões internos a cada amostra, aumenta o custo das análises, como padrões de referência de alto grau de glucosinolatos são geralmente muito caros. Em conclusão, apesar das etapas demoradas, este protocoloproporciona um método simples e acessíveis para extrair glucosinolatos e quantificar em amostras de plantas. No entanto, é importante considerar que os níveis de glucosinolato em si são apenas uma indicação do potencial de actividade biológica, visto que a necessidade de reagir com mirosinase, e a variação nos produtos de reacção pode surgir a partir de uma única glucosinolatos 11. Os ensaios de validação devem ser realizados para confirmar a relevância biológica.

Estima-se que as plantas produzem mais de 200.000 diferentes tipos de compostos químicos 1. Apenas uma minoria destes composto parece desempenhar um papel no metabolismo primário das plantas, o qual alimenta o crescimento e reprodução; a maioria são os chamados metabólitos secundários. Apesar do seu nome, metabólitos secundários são frequentemente críticos para a sobrevivência e reprodução das plantas, uma vez que servem para atrair polinizadores ou para defender a planta contra patógenos e herbívoros 1. Glucosinolatos são uma classe muito diversificado de metabólitos secundários que têm sido estudados há mais de 150 anos 2. Até à data, mais de 130 glucosinolatos estruturalmente diferentes foram identificados 3. Em termos gerais, os glucosinolatos pode ser subdividida em classes diferentes com base no aminoácido a partir do qual eles são sintetizados. glucosinolatos de indolo, por exemplo, são sintetizados a partir do aminoácidotriptofano, fenilalanina Considerando que proporciona o esqueleto de base para a síntese de 4 glucosinolatos aromáticos. Nas classes, há um elevado grau de diversidade estrutural, que é provocada por etapas sequenciais de alongamento da cadeia em vias biossintéticas, tais como na classe de glucosinolatos alifáticos, ou por modificações da cadeia lateral (por exemplo, hidroxilação) 4, 5. Uma das espécies de plantas em glucosinolatos pode conter até 37 glucosinolatos diferentes pertencentes a diferentes classes estruturais 6. Apesar de espécies de plantas têm perfis glucosinolatos típicos, variação intraespecífica para os tipos de glucosinolatos é freqüentemente encontrada entre os indivíduos e populações 6, 7. Glucosinolatos intactos são armazenados nos vacúolos das células vegetais e podem ser encontrados em nenhum dos órgãos acima do solo ou abaixo do solo 7, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. Após a ruptura de células (por exemplo, por herbivoria), glucosinolatos são liberados e são misturados com a enzima mirosinase, desencadeando uma bomba de óleo de mostarda 10. Devido à actividade de mirosinase, e, dependendo da estrutura do glucosinolato, as condições de reacção, e a presença de enzimas modificadoras, diferentes compostos pungentes, tóxicas ou nocivas são formados, tais como nitrilos e (iso) tiocianatos 11. Os produtos de reacção têm altas actividades biológicas; por exemplo, eles servem como repelentes de insetos herbívoros generalistas 12. A hereditariedade e biossintéticas vias de glucosinolatos são bem estudadas, principalmente por causa de sua importância para herbívoro e resistência de patógenos, seu valor como componentes de sabor em mostardas e couves, e sua negativa (progoitrin) e efeitos positivos (glucoraphanin) na saúde humana 5, </sup&gt; 13, 14. Por causa do grande interesse em glucosinolatos como compostos, métodos biologicamente activas de extracção e detecção com base em cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (HPLC), equipado com radiação ultravioleta (UV) ou o agrupamento de fotodíodos (PDA) detectores de ter sido utilizada desde a década de 1980 15 . Com base neste método, as Comunidades Europeias emitido um protocolo padrão que foi testado e validado em vários laboratórios para a análise de glucosinolatos em sementes oleaginosas (Brassica napus, colza, canola 16). Outros adicionado a este método (por exemplo, determinando os factores de resposta para glucosinolatos adicionais que não estão presentes nas sementes de colza) 17. Apesar da crescente disponibilidade de espectrometria de cromatografia de massa plataformas líquidos (LC-MS) e protocolos de alto rendimento para a análise de glucosinolatos 18 <sup&gt;, 19, o método HPLC-UV / PDA originais ainda é bastante usada pelos cientistas. As principais razões são que este método é simples e de baixo custo, e relativamente acessível a laboratórios, sem uma extensa infra-estrutura de conhecimento químico-analíticos. Para servir esta comunidade, nós aqui detalhadamente o protocolo para a extração de glucosinolatos partir de materiais vegetais ea análise de suas formas desulfo com HPLC-PDA.

<table><tbody><tr><td>Metanol HiPerSolv CHROMANORM&reg; grau de gradiente para HPLC grau</td><td>VWR</td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>(&minus;)-Hidrato de sinigrina de raiz-forte&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Aril sulfatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>Lã de vidro</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>Vara de vidro/madeira</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reação de 2 mL</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de dissecação</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Pratos Rotilabo-lab</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>Bandeja de resíduos</td></tr><tr><td>Clipes de vedação de rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador Freezone 12 L</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril grau super gradiente</td><td>VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>Banho ultrassônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>PH Eletrodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2115</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Pré-coluna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>Coluna C18 (4,6 x 10 mm, 5 &micro; m, 300 &)&nbsp;</td></tr><tr><td>Coluna Acclaim 300</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>C18 coluna (4.6 x 150 mm, 3 &micro; m, 300 &)&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>com forno de coluna e detector UV ou PDA</td></tr><tr><td>Frasco 1.000 mL</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>Compostos de referência de glucosinolato</td><td>Phytoplan</td><td>vários</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

um método simples para glucosinolatos extracção e análise com cromatografia líquida de alta pressão (hplc)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Os glucosinolatos são uma classe bem estudada e altamente diversificada de compostos vegetais naturais. Eles desempenham papéis importantes na resistência das plantas, na qualidade do óleo de colza, no sabor dos alimentos e na saúde humana. A atividade biológica dos glucosinolatos é liberada após o dano tecidual, quando eles são misturados com a enzima mirosinase. Isso resulta na formação de produtos de decomposição pungentes e tóxicos, como isotiocianatos e nitrilos. Atualmente, mais de 130 glucosinolatos estruturalmente diferentes foram identificados. A estrutura química do glucosinolato é um importante determinante do produto que se forma, que por sua vez determina sua atividade biológica. Este último pode variar de prejudicial (por exemplo, progoitrina) a benéfico (por exemplo, glucorafanina). Cada espécie de planta contendo glucosinolato tem seu próprio perfil específico de glucosinolato. Por esse motivo, é importante identificar corretamente e quantificar de forma confiável os diferentes glucosinolatos presentes em culturas de folhas, sementes e raízes brássicas ou, para estudos ecológicos, em seus parentes selvagens. Aqui, apresentamos um método bem validado, direcionado e robusto para analisar os perfis de glucosinolato em uma ampla gama de espécies e órgãos vegetais. Os glucosinolatos intactos são extraídos de materiais vegetais moídos com uma mistura de metanol-água em altas temperaturas para desativar a atividade da mirosinase. Depois disso, o extrato resultante é levado a uma coluna de troca iônica para purificação. Após o tratamento com sulfatase, os dessulfoglucosinolatos são eluídos com água e o eluído é liofilizado. O resíduo é absorvido em um volume exato de água, que é analisado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com um detector de arranjo de fotodiodos (PDA) ou ultravioleta (UV). A detecção e a quantificação são obtidas por meio da realização de comparações dos tempos de retenção e espectros UV dos padrões de referência comerciais. As concentrações são calculadas com base em uma curva de referência de sinigrina e fatores de resposta bem estabelecidos. As vantagens e desvantagens desse método simples, quando comparado a métodos mais rápidos e tecnologicamente avançados, são discutidas aqui.

Este método permite a detecção e a separação de desulfoglucosinolates comumente encontrados em todas as classes estruturais (Figura 3). A prejudicial progoitrin 2-hydroxyglucosinolate vem relativamente cedo no cromatograma e é claramente separada da glucoraphanin glucosinolatos benéfica, a única methylsulfinylglucosinolate nesta amostra. Sinigrin, gluconapin, e glucobrassicanapin formar uma série de glucosinolatos eluotropic alcenilo com comprimentos de cadeia lateral aumentando (C3, C4, C5 e, respectivamente). Uma série lógica semelhante é visível para as duas glucosinolatos methylthioalkenyl, glucoiberverin (C3) e glucoerucin (C4). Os picos dos três glucosinolatos de indolo, glucobrassicina e seus derivados de 4-hidroxi-1 e methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), são também claramente separados. Deve-se notar que os picos de neoglucobrassicin e glucoerucin, bem como gluconasturtiin, a única gluco aromáticosinolate neste exemplo, são particularmente elevados neste extrato Brassica devido à adição de extratos de raiz à mistura 9. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> Figura 3: Cromatograma de um extracto de glucosinolatos. Detalhe (1-32 min) de um cromatograma HPLC resultante da análise de amostras combinadas da raiz e caule de Brassica nigra, B. rapa e B. oleracea. Os rótulos de pico indicam o tempo de retenção e as abreviaturas para desulfoglucosinolates identificados (GSL). Pro = progoitrin (2-OH-3-butenil GSL); RAPH = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenil GSL), GNA = gluconapin (3-butenil GSL); 4Oh = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-metiltiopropil GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenilo GSL); ERU = glucoerucin (4-metiltiobutilo GSL); GBC = glucobrassicina (indol-3-ilmetil GSL); NAS = gluconasturtiin (2-feniletil GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Mais glucosinolatos metilsulfinilo cadeia, que são comumente encontrados na planta modelo Arabidopsis, também mostram uma série eluotropic, como visto em um extrato de raiz de Rorippa austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8) e glucoarabin (C9) aparecem em intervalos regulares sobre o cromatograma (Figura 4). Juntamente com o espectro de UV dos picos, tal série lógica eluotropic podem ser usadas para classificar e identificar provisoriamente, glucosinolatos desconhecidos. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> Figura 4: Cromatograma (quadro 9-30 min) Dos desulfoglucosinolates em um extrato austriaca raiz Rorippa. Os rótulos de pico indicam o tempo de retenção e as abreviaturas para desulfoglucosinolates identificados (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicina (indol-3-ilmetil GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome comum </td><td> Estrutura de cadeia lateral </td><td> Tr (min) * </td><td> 229 nm </td><td> referência# </td></tr><tr><td> aliphatic glucosinolatos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td> metilo </td><td> 3,5 </td><td> 1 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> sinigrin </td><td> 2-propenilo </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> Brown, CE </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3-butenilo </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4-pentenilo </td><td> 13,5 </td><td> 1.15 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3-metiltiopropilo </td><td> 10,9 </td><td> 0,8 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4-metiltiobutilo </td><td> 14,0 </td><td> 0,9 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3-methylsulfinylpropyl </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> glucoraphanin </td><td> 4-methylsulfinylbutyl </td><td> 4.9 </td><td> 0,9 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5-methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0,9 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6-methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7-methylsulfinylheptyl </td><td> 13,5 </td><td> 1 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8-methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9-methylsulfinylnonyl </td><td> 20,5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3-methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0,9 </td><td> Castanho </td></tr><tr><td> Progoitrin </td><td> 2 (R) -OH-3-butenil </td><td> 4,5 </td><td> 1,09 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH-5-pentenilo </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> CE </td&gt; </tr><tr><td> glucosinolatos de indole </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4-hydroxyglucobrassicin </td><td> 4-hidroxi-indol-3-ilmetil </td><td> 11.2 </td><td> 0,28 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> glucobrassicin </td><td> indol-3-ilmetil </td><td> 15,3 </td><td> 0,29 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> 4-Methoxyglucobrassicin </td><td> 4-metoxi-indol-3-ilmetil </td><td> 18,2 </td><td> 0,25 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1-metoxi-indol-3-ilmetil </td><td> 22,5 </td><td> 0,2 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> glucosinolatos aromáticos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinalbin </td><td> 4-hidroxibenzil </td><td> 8.1 </td><td> 0,5 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH-2-feniletil </td><td> 12.1 </td><td&gt; 0,95 </td><td> veja a próxima </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH-2-feniletil </td><td> 12,7 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td> benzilo </td><td> 13,8 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Gluconasturtiin </td><td> 2-feniletil </td><td> 18,0 </td><td> 0,95 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> desconhecido - alifático / aromático como espectro UV </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> CE </td></tr><tr><td> desconhecido - indole como espectro </td><td></td><td></td><td> 0,25 </td><td> CE </td></tr><tr><td colspan="5"> * O tempo de retenção aproximado (Rt) arredondadas para o mais próximo de 0,1 min (± 0,3 minutos dependendo da coluna, a qualidade do eluente). Os tempos de retenção são determinadas em plataformas ThermoFisher / Dionex final de HPLC equipado com uma coluna C 18 (150 x 4,6 mm, 3 micrómetros de tamanho de partícula) mais C 18 </sUB&gt; pr coluna (10 x 4,6 mm, 5 micrómetros de tamanho de partícula) com um programa de gradiente como na Tabela 1. </td></tr><tr><td colspan="5"> # Referências para factores de resposta: Buchner, R. em glucosinolatos em sementes de colza (ed JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. &amp; Gershenzon, J. Variação da acumulação de glucosinolatos entre diferentes órgãos e estágios de desenvolvimento de Arabidopsis thaliana. Fitoquímica. 62 (3), 471-481, DOI: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6 (2003); CE. oleaginosas - deliberação de glucosinolatos Líquida de Alta Eficiência cromatografia. Jornal Oficial das Comunidades Europeias. L 170/28. Anexo VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Os factores de resposta dos mais comumente encontrados desulfo-glucosinolatos em extratos vegetais e seus tempos de retenção aproximados no C 18 colunas. Eluentes, gradient, temperatura da coluna, e a taxa de fluxo, como na Tabela 1.

Aqui, descrevemos em detalhes um protocolo estabelecido e robusto para a extração de glucosinolatos de materiais vegetais moídos. Após um tratamento com sulfatase nos extratos na coluna, os dessulfoglucosinolatos são eluídos e analisados por cromatografia líquida de alta pressão.

Um método simples para glucosinolatos Extracção e análise com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

O objetivo geral deste protocolo é realizar uma análise fácil e direta de glucosinolatos em plantas e outras amostras biológicas. Este método, para extrair e analisar glucosinolatos, pode ser usado para responder perguntas-chave em ecologia planta-inseto, patologia vegetal, melhoramento de plantas e ciências dos alimentos. A principal vantagem desta técnica é que ela é bem validada e amplamente aplicável a uma ampla gama de amostras biológicas.Embora este método seja principalmente utilizado para quantificar glucosinolatos em materiais vegetais, ele também pode ser aplicado a solos ou alimentos processados. Este procedimento de extração pode ser realizado em praticamente qualquer laboratório, pois utiliza principalmente equipamentos laboratoriais padrão. Geralmente, indivíduos novos neste método realizarão as análises e inspeções melhor quando lerem e assistirem ao vídeo pelo menos uma vez.Para iniciar o procedimento, misture 10 gramas do gel de dextrina reticulada G-25 com 125 mililitros de água ultrapura. Armazene a mistura em um frasco com tampa a 4 graus Celsius. Em seguida, dissolva 10.000 unidades do arilsulfatase tipo H-1 em 30 mililitros de água ultrapura.Adicione a isso 30 mililitros de etanol absoluto e agite bem a mistura. Centrifugue a mistura a 2.650 ×g por 20 minutos à temperatura ambiente. Combine o sobrenadante com 90 mililitros de etanol absoluto em um béquer.Misture e transfira para novos tubos de centrífuga. Centrifugue a mistura a 1.030 × g por 15 minutos em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.Dissolva e combine os pellets em um volume total de 25 mililitros de água ultrapura. Agite bem a mistura em vórtex e, em seguida, transfira a mistura para tubos de 1 mililitro. Armazene as amostras de sulfatato a 20 graus Celsius por até um ano.Em seguida, pese cerca de 90 miligramas de sinograma e registre o peso com precisão de 1 micrograma. Depois, dissolva o monoidrato de sinograma em 10 mililitros de água ultrapura. Prepare a partir dessa solução estoque de sinograma cinco soluções de referência com concentrações variando de 50 a 750 micromolares.Armazene as soluções de referência em tubos de 1,5 mililitro a 20 graus Celsius. Em seguida, rotule um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros em uma posição de rack em coluna para cada amostra e referência. Fure a tampa de cada tubo de microcentrífuga com uma agulha de dissecação para posterior liofilização.Coloque os tubos identificados em um suporte, na mesma configuração e espaçamento das colunas identificadas. Para preparar as colunas de pipeta de vidro, utilize uma haste de madeira ou vidro para pressionar suavemente um pedaço de lã de vidro de 1 centímetro por 1 centímetro dentro da pipeta. Compacte a lã de vidro na transição entre o corpo da pipeta e o seu tubo estreito.Coloque uma coluna de pipeta em cada posição identificada no suporte. Posicione o suporte sobre uma bandeja de resíduos. Corte a extremidade de uma ponteira plástica de pipeta de 1 mililitro.Agite bem o gel de dextrina preparado. Em seguida, use a ponteira alargada para carregar 0,5 mililitros do gel de dextrina preparado em cada coluna. Verifique se há vazamento do gel de dextrina nas colunas e substitua quaisquer colunas com vazamento.Após todas as colunas terem sido carregadas com gel de dextrina, lave cada coluna com 1 mililitro de água ultrapura. Pese entre 50 e 100 miligramas de material vegetal finamente moído, livre de amido, em um tubo de reação de 2 mililitros com tampa de segurança e registre o peso com precisão de 0,1 miligrama. Coloque duas esferas metálicas de 3 milímetros de diâmetro em cada tubo.Adicione a cada tubo 1 mililitro de metanol 70% em água ultrapura e vortexe brevemente cada mistura. Feche os tubos com tampas de segurança adicionais e coloque-os imediatamente em um banho-maria a 90 a 92 graus Celsius. Aqueça os tubos até que a solução comece a ferver.Transfira os tubos para um banho ultrassônico e sonique os amostras por 15 minutos com aquecimento. Durante a sonicação, inicie o descongelamento da amostra de sulfatato e das referências de sinograma. Após a sonicação, centrifugue as amostras a 2.700 × g por 10 minutos à temperatura ambiente.Carregue os sobrenadantes e as referências de sinograma descongeladas nas colunas correspondentes, tomando cuidado para não aspirar material vegetal na pipeta. Adicione 1 mililitro de metanol 70% a cada tubo. Agite as misturas em vórtex.E aqueça as misturas por ultrassom durante 15 minutos. Centrifugue novamente os tubos nas mesmas condições que anteriormente. Aplique os sobrenadantes nas colunas correspondentes.Adicione duas porções de 1 mililitro de metanol 70% a cada coluna, permitindo que as colunas sequem entre cada porção. Lave o metanol residual de cada coluna com 1 mililitro de água ultrapura. Em seguida, lave cada coluna com duas porções de 1 mililitro de tampão de acetato de sódio 20 milimolar, pH 5,5.Após a drenagem das últimas porções do tampão de acetato de sódio para a bandeja de resíduos, remova a bandeja da bandeja de descarte e seque os pés da bandeja com papel absorvente. Posicione a bandeja sobre o bloco de tubos de microcentrífuga rotulados, de modo que as pontas das colunas fiquem sobre os tubos correspondentes. Adicione 20 microlitros de solução de sulfatato em cada coluna, garantindo que a solução atinja a superfície do material da coluna.Enxágue a solução de sulfatato no material da coluna com 50 microlitros de tampão de acetato de sódio. É muito importante que o sulfatato seja lavado para dentro da coluna. A enzima deve estar na coluna para reagir com as glucosinolatos intactas ligadas à coluna.Uma vez que a solução de sulfatato tenha sido lavada para baixo em cada coluna, cubra as colunas com papel de alumínio. Deixe as colunas em repouso durante a noite. Em seguida, elua os desulfo-glucosinolatos de cada coluna com duas porções de 0,75 mililitro de água ultrapura.Uma vez que as colunas tenham secado completamente, remova o suporte das colunas e tampe cada tubo. Congele os tubos em nitrogênio líquido ou a -80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Liofilize as amostras por 12 a 24 horas.Dissolva cada resíduo em 1 mililitro de água ultrapura. Em seguida, transfira cada amostra e referência para frascos rotulados para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Separe os extratos em uma coluna de fase reversa CAT.Utilize um comprimento de onda de detecção de 229 nanômetros. Após a separação por CLAE, as glucosinolatos podem ser identificadas pela comparação dos tempos de retenção e dos espectros UV com padrões conhecidos de glucosinolatos. As concentrações de glucosinolatos na amostra são calculadas a partir de uma curva de calibração de sinograma e valores da literatura para fatores de resposta.A partir disso, podem ser determinadas as concentrações de glucosinolatos na amostra vegetal original. Nas condições de CLAE utilizadas, o progoitrina prejudicial elui bastante cedo e é separado do glucorafanina, que é biologicamente benéfico. Os glucosinolatos endógenos também são bem separados.As séries liotrópicas são observadas com o aumento dos elos da cadeia lateral para alconol, metilfol-alconol e glucosinolatos de cadeia mais longa de metil-solfinol. Assim, glucosinolatos desconhecidos podem ser classificados de forma preliminar com base nessas séries liotrópicas em combinação com espectros no ultravioleta. Com o preparo adequado, uma pessoa pode extrair de 150 a 200 amostras em um único dia de trabalho.Levará mais um dia para eluir as colunas, liofilizar as amostras e prepará-las para HPLC. Após este procedimento, outros métodos, como LC-MS, podem ser aplicados para identificar desulfo-glucosinolatos desconhecidos em seu cromatograma. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair glucosinolatos de suas amostras biológicas e analisá-los por meio de HPLC.Não se esqueça de que trabalhar com metanol pode ser extremamente perigoso e deve ser sempre feito sob capela de exaustão.

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