Um método simples para glucosinolatos Extracção e análise com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC)
15 de março de 2017
Aqui, descrevemos em detalhes um protocolo estabelecido e robusto para a extração de glucosinolatos de materiais vegetais moídos. Após um tratamento com sulfatase nos extratos na coluna, os dessulfoglucosinolatos são eluídos e analisados por cromatografia líquida de alta pressão.
O objetivo geral deste protocolo é realizar uma análise fácil e direta de glucosinolatos em plantas e outras amostras biológicas. Este método, para extrair e analisar glucosinolatos, pode ser usado para responder perguntas-chave em ecologia planta-inseto, patologia vegetal, melhoramento de plantas e ciências dos alimentos. A principal vantagem desta técnica é que ela é bem validada e amplamente aplicável a uma ampla gama de amostras biológicas.
Embora este método seja principalmente utilizado para quantificar glucosinolatos em materiais vegetais, ele também pode ser aplicado a solos ou alimentos processados. Este procedimento de extração pode ser realizado em praticamente qualquer laboratório, pois utiliza principalmente equipamentos laboratoriais padrão. Geralmente, indivíduos novos neste método realizarão as análises e inspeções melhor quando lerem e assistirem ao vídeo pelo menos uma vez.
Para iniciar o procedimento, misture 10 gramas do gel de dextrina reticulada G-25 com 125 mililitros de água ultrapura. Armazene a mistura em um frasco com tampa a 4 graus Celsius. Em seguida, dissolva 10.000 unidades do arilsulfatase tipo H-1 em 30 mililitros de água ultrapura.
Adicione a isso 30 mililitros de etanol absoluto e agite bem a mistura. Centrifugue a mistura a 2.650 ×g por 20 minutos à temperatura ambiente. Combine o sobrenadante com 90 mililitros de etanol absoluto em um béquer.
Misture e transfira para novos tubos de centrífuga. Centrifugue a mistura a 1.030 × g por 15 minutos em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante.
Dissolva e combine os pellets em um volume total de 25 mililitros de água ultrapura. Agite bem a mistura em vórtex e, em seguida, transfira a mistura para tubos de 1 mililitro. Armazene as amostras de sulfatato a 20 graus Celsius por até um ano.
Em seguida, pese cerca de 90 miligramas de sinograma e registre o peso com precisão de 1 micrograma. Depois, dissolva o monoidrato de sinograma em 10 mililitros de água ultrapura. Prepare a partir dessa solução estoque de sinograma cinco soluções de referência com concentrações variando de 50 a 750 micromolares.
Armazene as soluções de referência em tubos de 1,5 mililitro a 20 graus Celsius. Em seguida, rotule um tubo de microcentrífuga de 2 mililitros em uma posição de rack em coluna para cada amostra e referência. Fure a tampa de cada tubo de microcentrífuga com uma agulha de dissecação para posterior liofilização.
Coloque os tubos identificados em um suporte, na mesma configuração e espaçamento das colunas identificadas. Para preparar as colunas de pipeta de vidro, utilize uma haste de madeira ou vidro para pressionar suavemente um pedaço de lã de vidro de 1 centímetro por 1 centímetro dentro da pipeta. Compacte a lã de vidro na transição entre o corpo da pipeta e o seu tubo estreito.
Coloque uma coluna de pipeta em cada posição identificada no suporte. Posicione o suporte sobre uma bandeja de resíduos. Corte a extremidade de uma ponteira plástica de pipeta de 1 mililitro.
Agite bem o gel de dextrina preparado. Em seguida, use a ponteira alargada para carregar 0,5 mililitros do gel de dextrina preparado em cada coluna. Verifique se há vazamento do gel de dextrina nas colunas e substitua quaisquer colunas com vazamento.
Após todas as colunas terem sido carregadas com gel de dextrina, lave cada coluna com 1 mililitro de água ultrapura. Pese entre 50 e 100 miligramas de material vegetal finamente moído, livre de amido, em um tubo de reação de 2 mililitros com tampa de segurança e registre o peso com precisão de 0,1 miligrama. Coloque duas esferas metálicas de 3 milímetros de diâmetro em cada tubo.
Adicione a cada tubo 1 mililitro de metanol 70% em água ultrapura e vortexe brevemente cada mistura. Feche os tubos com tampas de segurança adicionais e coloque-os imediatamente em um banho-maria a 90 a 92 graus Celsius. Aqueça os tubos até que a solução comece a ferver.
Transfira os tubos para um banho ultrassônico e sonique os amostras por 15 minutos com aquecimento. Durante a sonicação, inicie o descongelamento da amostra de sulfatato e das referências de sinograma. Após a sonicação, centrifugue as amostras a 2.700 × g por 10 minutos à temperatura ambiente.
Carregue os sobrenadantes e as referências de sinograma descongeladas nas colunas correspondentes, tomando cuidado para não aspirar material vegetal na pipeta. Adicione 1 mililitro de metanol 70% a cada tubo. Agite as misturas em vórtex.
E aqueça as misturas por ultrassom durante 15 minutos. Centrifugue novamente os tubos nas mesmas condições que anteriormente. Aplique os sobrenadantes nas colunas correspondentes.
Adicione duas porções de 1 mililitro de metanol 70% a cada coluna, permitindo que as colunas sequem entre cada porção. Lave o metanol residual de cada coluna com 1 mililitro de água ultrapura. Em seguida, lave cada coluna com duas porções de 1 mililitro de tampão de acetato de sódio 20 milimolar, pH 5,5.
Após a drenagem das últimas porções do tampão de acetato de sódio para a bandeja de resíduos, remova a bandeja da bandeja de descarte e seque os pés da bandeja com papel absorvente. Posicione a bandeja sobre o bloco de tubos de microcentrífuga rotulados, de modo que as pontas das colunas fiquem sobre os tubos correspondentes. Adicione 20 microlitros de solução de sulfatato em cada coluna, garantindo que a solução atinja a superfície do material da coluna.
Enxágue a solução de sulfatato no material da coluna com 50 microlitros de tampão de acetato de sódio. É muito importante que o sulfatato seja lavado para dentro da coluna. A enzima deve estar na coluna para reagir com as glucosinolatos intactas ligadas à coluna.
Uma vez que a solução de sulfatato tenha sido lavada para baixo em cada coluna, cubra as colunas com papel de alumínio. Deixe as colunas em repouso durante a noite. Em seguida, elua os desulfo-glucosinolatos de cada coluna com duas porções de 0,75 mililitro de água ultrapura.
Uma vez que as colunas tenham secado completamente, remova o suporte das colunas e tampe cada tubo. Congele os tubos em nitrogênio líquido ou a -80 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Liofilize as amostras por 12 a 24 horas.
Dissolva cada resíduo em 1 mililitro de água ultrapura. Em seguida, transfira cada amostra e referência para frascos rotulados para cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Separe os extratos em uma coluna de fase reversa CAT.
Utilize um comprimento de onda de detecção de 229 nanômetros. Após a separação por CLAE, as glucosinolatos podem ser identificadas pela comparação dos tempos de retenção e dos espectros UV com padrões conhecidos de glucosinolatos. As concentrações de glucosinolatos na amostra são calculadas a partir de uma curva de calibração de sinograma e valores da literatura para fatores de resposta.
A partir disso, podem ser determinadas as concentrações de glucosinolatos na amostra vegetal original. Nas condições de CLAE utilizadas, o progoitrina prejudicial elui bastante cedo e é separado do glucorafanina, que é biologicamente benéfico. Os glucosinolatos endógenos também são bem separados.
As séries liotrópicas são observadas com o aumento dos elos da cadeia lateral para alconol, metilfol-alconol e glucosinolatos de cadeia mais longa de metil-solfinol. Assim, glucosinolatos desconhecidos podem ser classificados de forma preliminar com base nessas séries liotrópicas em combinação com espectros no ultravioleta. Com o preparo adequado, uma pessoa pode extrair de 150 a 200 amostras em um único dia de trabalho.
Levará mais um dia para eluir as colunas, liofilizar as amostras e prepará-las para HPLC. Após este procedimento, outros métodos, como LC-MS, podem ser aplicados para identificar desulfo-glucosinolatos desconhecidos em seu cromatograma. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair glucosinolatos de suas amostras biológicas e analisá-los por meio de HPLC.
Não se esqueça de que trabalhar com metanol pode ser extremamente perigoso e deve ser sempre feito sob capela de exaustão.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a extração de glucosinolatos de materiais vegetais utilizando cromatografia líquida de alta pressão. O método foi desenvolvido para ser simples e aplicável a diversas amostras biológicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Ecologia planta-inseto
- Patologia vegetal
- Ciências dos alimentos
Contexto
- As glucosinolatos são compostos importantes em plantas.
- Eles desempenham um papel nos mecanismos de defesa das plantas.
- Compreender sua concentração pode auxiliar em diversos estudos biológicos.
- Este protocolo é validado para uma ampla variedade de amostras.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para extração e análise de glucosinolatos.
- Facilitar pesquisas em áreas relacionadas a plantas.
- Permitir a quantificação de glucosinolatos em amostras diversas.
Métodos Utilizados
- Preparação do gel de dextrina e da solução de sulfatase.
- Extração da amostra utilizando metanol e sonicador.
- Cromatografia líquida de alta pressão para análise.
- Comparação dos tempos de retenção e espectros de UV com padrões.
Resultados Principais
- Extração bem-sucedida de glucosinolatos de materiais vegetais.
- Validação do método em diversas amostras biológicas.
- Identificação de glucosinolatos por meio de HPLC.
- Aplicações potenciais em ecologia e ciências dos alimentos.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para a análise de glucosinolatos.
- Pode ser utilizado em diversos ambientes de pesquisa.
- Estudos futuros podem ampliar suas aplicações nas ciências vegetais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa de glucosinolatos apoia a validação de alvos na descoberta de compostos bioativos de origem vegetal, permitindo a redução de riscos mecanicistas de candidatos a nutracêuticos e proteção de cultivos. Este método fornece confiança preditiva na identificação de perfis de glucosinolatos benéficos versus prejudiciais, orientando a identificação de compostos líderes e a triagem de portfólios no desenvolvimento de biotecnologia agrícola e alimentos funcionais. Sua ampla aplicabilidade em tecidos vegetais e amostras biológicas aumenta a continuidade translacional, desde a descoberta até a avaliação pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao associar estruturas específicas de glucosinolatos a atividades biológicas, como progoitrina (prejudicial) ou glucorafanina (benéfica).
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da quantificação confiável de glucosinolatos intactos após a inativação da mirosinase e tratamento com sulfatase.
- Valor Preditivo: Facilita a confiança preditiva na validação de alvos ao gerar dados quantitativos para análise da relação estrutura-atividade.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, fornecendo desulfoglicosinolatos adequados para detecção e quantificação baseadas em HPLC.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio de curvas de calibração baseadas em sinigrina e fatores de resposta estabelecidos.
- Escalabilidade: Permite o processamento de 150 a 200 amostras por pessoa por dia, apoiando a preparação para triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta o perfilhamento de glucosinolatos na fase de descoberta à validação pré-clínica por meio de sistemas relevantes para doenças nas áreas de patologia vegetal e ciências dos alimentos.
- Avanço com Base no Risco: Apoia decisões de continuidade ou interrupção do desenvolvimento ao identificar produtos de degradação prejudiciais (por exemplo, nitrilas) em contraste com os benéficos (por exemplo, isotiocianatos), com base nos perfis de glucosinolatos.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite o desenvolvimento translacional de biomarcadores ao correlacionar as concentrações de glucosinolatos com resultados fenotípicos em estudos ecológicos e de melhoramento genético.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos promissores e o suporte pré-clínico, especialmente em pipelines de desenvolvimento de nutracêuticos e características agronômicas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao quantificar perfis de glucosinolatos que determinam a formação de produtos bioativos derivados.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos prontos para ensaio por meio de HPLC com detecção PDA/UV, permitindo avaliação confiável de compostos em diversas matrizes vegetais.
- Análise: Oferece leituras mensuráveis (tempos de retenção, espectros de UV, cálculos de concentração) que permitem comparação entre condições e classificação baseada em estrutura.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de aplicações na segurança alimentar e na saúde vegetal, nas quais os produtos derivados do glucosinolato influenciam resultados biológicos.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma analítica reutilizável devido à sua dependência de equipamentos laboratoriais padrão e ampla compatibilidade com amostras (vegetais, solo, alimentos).
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista na identificação de compostos bioativos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade entre laboratórios utilizando equipamentos acessíveis.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguir ou interromper projetos, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados no desenvolvimento de compostos bioativos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e tomada de decisões de avanço ajustadas ao risco, com base na quantificação validada de glucosinolatos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em preparação de amostras vegetais, tratamento enzimático e operação de CLAE.
- Depende do acesso a centrífugas, banhos-maria, banhos ultrassônicos, liofilizadores e sistemas de CLAE com detecção PDA/UV.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao tempo de extração, incubação com sulfatase e preparação de curvas de referência.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes matrizes vegetais (folha, semente, raiz) e amostras não vegetais (solo, alimentos).
- Inclui limitações práticas, como os riscos no manuseio de metanol, que exige o uso de capela, e o passo de liofilização de 12–24 horas, que afeta o tempo de análise.
