출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

이 절차의 전반적인 목표는 출생 후 심근세포의 세포주기 활동을 시각화하고 핵성을 결정하는 것입니다. 이 방법은 심장 재생 분야의 주요 질문, 예를 들어 심근세포가 실제로 분열하는지, 아니면 ploidy를 증가시키거나 다핵이 되는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포주기의 M기를 높은 시공간 해상도로 시각화할 수 있고 심근세포 핵을 형광으로 식별할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Patricia Freitag입니다. 비동형접합 번식 쌍을 사용하는 경우 먼저 형광 현미경을 통해 형질전환 심장을 식별하여 EGFP 아날린 및 H2B-mCherry 발현을 확인합니다. 핵 신호의 EGFP 분석은 조직층을 통해 초점을 맞추어 심방의 가장자리에서 가장 쉽게 감지할 수 있습니다.

심근세포를 분리하려면 신생아 심장 해리 키트에서 추출한 효소 혼합물 1ml가 들어 있는 1.5ml 반응 튜브에 적절한 수의 심장을 넣고 가위로 심장을 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 용액을 15ml 반응 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 37도의 거의 수평 위치에 15분 동안 놓고 배양이 끝날 때 5ml 피펫으로 조직을 5-10회 혼합합니다.

세 번째 분해가 끝나면 7.5ml의 배지 2로 반응을 중지하고 70미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 세포 여과기를 3ml의 배지 2로 헹구고, 수집된 세포와 세척액을 모으고 원심분리로 세포를 수집합니다. 계수를 위해 펠릿을 500마이크로리터의 중간 용량에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 96웰의 평평한 바닥 플레이트에 120마이크로리터의 중간 용량으로 구성된 웰당 10배에서 4번째 세포를 파종하고 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양 전에 세포를 원심분리합니다. 다음 날에는 대부분의 심근세포가 박동을 해야 합니다. transfection을 시작하기 전에 RNAse 오염 제거 용액으로 벤치와 모든 transfection 재료를 닦아 RNAse를 제거합니다.

모든 재료가 준비되면 새로 준비된 siRNA 믹스 20마이크로리터를 각 웰에 추가하고 세포를 48시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이틀 후, 각 웰의 상등액을 120마이크로리터의 미디엄 1로 교체하고 세포를 최소 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양이 끝나면 PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 4% 포름알데히드 용액에 20분 동안 고정합니다.

컨포칼 비디오 현미경으로 세포를 분석하려면 플레이트를 컨포칼 현미경 스테이지로 옮기고 이미징 소프트웨어를 시작합니다. A1plus 설정을 열고 채널 1, 2, 3, 4 상자를 선택합니다. 풀다운 메뉴에서 채널 1을 DAPI로, 채널 2를 eGFP로, 채널 3을 RFP, 채널 4를 Cy5로 설정합니다.

채널 전압을 클릭하고 슬라이드 막대를 사용하여 각 채널에 대해 전압을 80으로 설정합니다. 슬라이드 바를 사용하여 오프셋을 0으로 설정하고 홈 버튼을 클릭하여 핀홀을 홈 위치로 설정합니다. 풀다운 메뉴에서 스캔 크기를 1024 x 1024 픽셀로 설정합니다.

최적화를 클릭하여 XYZ 크기 설정 창을 열고 제안된 단계 Z.Select 20x objective에서 완벽한 복셀 상자를 선택하고 사진이 과소 노출되거나 과다 노출되지 않을 때까지 레이저 강도를 조정합니다. 모든 파라미터가 설정되었으면 획득 메뉴를 엽니다. 큰 이미지 스캔을 선택한 다음 영역 아래 왼쪽 상단 모서리에 있는 현재 위치를 선택합니다.

그런 다음 X와 Y의 필드 수를 3x3으로 설정하고 스캔을 클릭합니다. 심근세포 핵의 수를 정의하려면 measure(측정), manual measurement(수동 측정) 및 counts(개수)를 클릭합니다. H2B-mCherry 신호가 있는 핵을 선택하여 표시하고 계수합니다.

그런 다음 알파-액티닌 양성 세포를 선택하여 심근세포의 수를 결정합니다. 핵 EGFP 아날린 신호가 있는 G1, S, G2 위상 심근세포를 계수하려면 measure, manual measurement 및 counts를 선택합니다. 클릭으로 핵을 발현하는 EGFP 아날린 및 H2B-mCherry를 표시하고 수축 고리 및 중간체와 같은 유사분열 특이적 EGFP 아날린 신호로 심근세포를 수동으로 계산합니다.

그런 다음 측정(measure), 수동 측정(manual measurement), 계수(counts)를 클릭하고 유사분열 특이적 EGFP 아날린 신호, 세포질 신호, 수축성 고리 및 중간체가 있는 심근세포를 클릭합니다. 음성 대조군과 비교했을 때, miRNA 및 siRNA transfection된 심근세포는 세포주기 활성의 유도를 보여줍니다. endoreduplication을 수행하는 심근세포는 독점적으로 핵 EGFP 아날린 발현을 나타내는 반면, 세포 분열을 겪는 심근세포는 M상 전형적인 국소화에서 EGFP 아날린 발현을 나타냅니다.

Langendorff 장치에서 심장 조직의 효소 분해 후, 심방과 심실을 기계적으로 분리하고 독립적으로 분석할 수 있으며, 이를 통해 H2B-mCherry 양성 이중핵 심근세포가 많은 H2B-mCherry 형질전환 심실근세포를 시각화할 수 있습니다. 대조적으로, 대부분의 심방 심근세포는 단핵세포입니다. 효소 분해는 알파-액티닌 염색에 의한 교차 줄무늬 패턴을 드러내는 100% 단세포 집단을 초래하지 않으며, 교차 줄무늬와 세포 이중선의 연속적인 패턴으로 이중핵 심근세포 간의 구별을 더욱 용이하게 합니다.

두꺼운 슬라이스에서 심근세포의 이중핵형성 지수를 분석하려면 핵이 반드시 하나의 Z-평면 내에 있을 필요는 없기 때문에 스택을 수동으로 스크롤해야 하며, 밀 배아 응집소 염색을 통해 세포 검출을 허용borders. 3D 성인 형질전환 마우스 심장의 고정 슬라이스를 재구성하면 후크를 검출하고 자동으로 계산할 수 있습니다. 염색된, 및 H2B-mCherry 양성 핵을 사용하여 조직 내 생리학적 조건 하에서 심근세포 핵의 비율을 결정합니다. 일단 숙달되면, 심장 해리는 제대로 수행된다면 2-3시간 내에 완료될 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 실험 전반에 걸쳐 세포의 생존력을 유지하기 위해 지속적으로 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 microRNA 또는 기타 작은 물질의 산후 심근세포에서 증식 유도 효과를 스크리닝할 수 있습니다.