Name: 출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 학습하세요 형광 현미경을 이용한 출생 후 심근 세포의 세포주기 활성 및 핵 특성 시각화 방법을. 이 기술은 심장 재생 연구에서 세포 분열과 배수성 변화를 구분하는 데 활용됩니다.

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기술 지원을 제공해 주신 S. Grünberg(독일 본)와 P. Freitag(독일 본)에게 감사드립니다.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

심근 세포가 세포주기를 다시 입력 및 손상 후 조직의 항상성 동안 나눌 수 있는지 논란이있다. 심근의 기본 회전율의 값은 1 % (1) 80 % (7) 사이의 범위에 제시되어있다. 40 % - 7 또한 심장 병변 후 세포주기 활성의 유도 및 새로운 심근 세포의 생성은 0.0083 %, 8 및 25 사이의 값과, 경계 존에보고되었다. 이러한 불일치는 부분적 학적 섹션 9 및 세포 분열 중에 매우 도전적인 프로세스를 심장 핵을 식별하기 위해 다른 실험적 방법에 의해 설명 될 수있다. 심근 세포가 세포주기의 변동하는 경향으로는 배수체 및 다핵 세포 이어질 endoreduplication acytokinetic 및 유사 분열에서 세포 분열 확실한 구별하기 매우 중요하다. 에 대한세포 분열의 식별은, 이러한 수축 링 midb...

심근 핵 및 세포주기 상태의 정확한 식별은 심근 회전율 및 재생의 판정을위한 매우 중요하다. 이것은 세포주기 활동을 식별하기위한 예컨대 pHH3, 기 - (67) 또는 티미 딘 유사체 핵 마커의 사용에 특히 그러하다. 성인 포유 동물 심근 세포의 증식 능력은 (1), 증식 분석의 결과에 중요한 차이를 만들 수있는 심근 핵의 확산 마커에 대한 긍정적 인 핵의 잘못된 식별 매우 작은 때문이다. 또한, 심근 배수체 및 다핵 세포가 아닌 세포 분열 될 같은 endoreduplication acytokinetic과 같은 유사 분열 세포주기의 변동,되기 쉽다. 이를 위해, 일반적인 세포주기 마커에 대한 항체 염색의 해석은 모든 경우에 결정적인 아니다. 여기, 우리는 직선 forwa을위한 방법을 제시<html> RD 마우스 심근의 인식과 핵의 명확한 식별하여 출생 후의 성인 단계에서 기본 절연 세포와 두께의 조직 절편에서의 nuclearity. 그 목적을 위해, Myh6 프로모터 (Myh6-H2B-MCH)의 제어하에 인간 히스톤 H2B mCherry과의 융합 단백질의 심근 특이 식 트랜스 제닉 마우스는 2 라인을 사용 하였다. eGFP는-anillin 융합 단백질의 발현이 CMV 인핸서와 유비쿼터스 닭 액틴 프로모터의 제어하에있는 형질 전환 증식 지표 마우스 선이 마우스 라인을 교배 (CAG-eGFP는-anillin)는 허용 세포주기 상태를 결정. 스캐 폴딩 단백질 anillin 특히 활성 셀 3 세포주기에서 발현하고, 세포주기 동안 그 차이 세포 내 지역화 M 위상의 고해상도 실시간 추적 세포주기 진행을 허용EF &quot;&gt; 4. 따라서, 이중 형질 전환 쥐 심근 세포 증식 및 세포주기 변동을 겪는 것과 구별하기 위해 사용될 수있다.이 시험 관내 증식을 유도하는 물질의 스크리닝에 유용 증명한다.

<table><tbody><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m 세포 여과기</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; 주입 캐뉼라, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>20 게이지 바늘</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-메틸-부탄</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드 용액</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>3방향 마개</td><td>B. 브라운 메디컬 Inc.</td><td>16494C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 주사기</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 마이크로플레이트, 96 Well, 절반 영역</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat CM 3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>PromoCell, 하이델베르크</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액(4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>돼지 피부의 젤라틴, A형</td><td>시그마-알드리치, 스타인하임</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger 확장 튜브</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond 현미경 슬라이드</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s 수정됨둘베코' s 매체 (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, 다름슈타트</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>코닝</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, 다름슈타트</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG Cy5 (당나귀)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>미니 셰이커</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA 모방, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>생검 금형</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-슬라이드 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>음성 control(scrambled RNA)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>신생아 심장 해리 키트</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산, NEAA</td><td>Gibco/Life Technologies, 다름스타드</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, 환원 혈청 매체</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco/Life Technologies, 다름슈타트</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>DABCO&reg;, 퇴색 방지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, 다름슈타트</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>샘플 용기</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 NIS 요소</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 화합물</td><td>Sakura Finetek / VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 요오드화물 (642/661)</td> <td>분자 프로브/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-actinin 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

심근세포는 세포내복제(endoreduplication, karyokinesis와 cytokinesis 없이 DNA 합성을 계속하는 것) 및 acytokinetic mitosis(karyokinesis이지만 cytokinesis는 없음)와 같은 세포주기의 변화에 취약합니다. 이러한 비정형 세포주기 변이는 세포 분열보다는 배수성 및 다핵 세포를 초래합니다. 따라서 심장 회전율과 재생을 결정하기 위해서는 심근세포 핵, 세포당 핵 수 및 세포주기 상태를 정확하게 식별하는 것이 매우 중요합니다. 이는 티미딘 유사체 Ki-67, PCNA 또는 pHH3와 같은 세포주기 활성을 식별하기 위한 핵 마커를 사용하는 데 특히 그렇습니다. 여기에서는 심근세포와 그 핵성을 인식하고 세포주기 활성을 결정하는 방법을 제시합니다. 자사는 심근세포 핵의 명백한 식별을 위해 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스군과 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 CAG-eGFP-아닐린 마우스군이라는 두 가지 발표된 형질전환 시스템을 사용합니다. 이 두 시스템을 함께 사용하면 심장 재생 및 가소성에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

시험 관내에서 출생 후의 심근 두 번 형질 전환 Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP는-anillin 쥐의 심근 세포의 세포주기 활동에 대한 siRNA를 /의 miRNAs의 효과를 분석하기 위해 출생 후 하루 3 (P3)에 격리하고, 형질 세포주기 활성 유도 miR199 5 P27의 siRNA 및 siRNA를 Fzr1있다. 음성 대조군 (도 1a)와 비교 miR199- (도 1b)와 siRNA를 p27- (도 1C)의 이미지가 심근 세포주기 활성의 유도 표시 형질. Fzr1 억제가 형질 감염된 세포의 핵에서 eGFP는-anillin 융합 단백질의 축적 Fzr1의 손실에 이르게 같이 eGFP는-anillin 마우스 모델에서 Fzr1에 대한 siRNA가이 APC의 억제로 연결, 형질 컨트롤로서 사용될 수있다 F...

심근세포의 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 심근세포 핵의 명확한 식별을 위한 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스와 세포 분열과 세포주기 변이를 구별하기 위한 CAG-eGFP-아닐린 마우스의 두 가지 형질전환 마우스 라인을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

이 절차의 전반적인 목표는 출생 후 심근세포의 세포주기 활동을 시각화하고 핵성을 결정하는 것입니다. 이 방법은 심장 재생 분야의 주요 질문, 예를 들어 심근세포가 실제로 분열하는지, 아니면 ploidy를 증가시키거나 다핵이 되는지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포주기의 M기를 높은 시공간 해상도로 시각화할 수 있고 심근세포 핵을 형광으로 식별할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Patricia Freitag입니다. 비동형접합 번식 쌍을 사용하는 경우 먼저 형광 현미경을 통해 형질전환 심장을 식별하여 EGFP 아날린 및 H2B-mCherry 발현을 확인합니다. 핵 신호의 EGFP 분석은 조직층을 통해 초점을 맞추어 심방의 가장자리에서 가장 쉽게 감지할 수 있습니다.심근세포를 분리하려면 신생아 심장 해리 키트에서 추출한 효소 혼합물 1ml가 들어 있는 1.5ml 반응 튜브에 적절한 수의 심장을 넣고 가위로 심장을 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 용액을 15ml 반응 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 37도의 거의 수평 위치에 15분 동안 놓고 배양이 끝날 때 5ml 피펫으로 조직을 5-10회 혼합합니다.세 번째 분해가 끝나면 7.5ml의 배지 2로 반응을 중지하고 70미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다. 세포 여과기를 3ml의 배지 2로 헹구고, 수집된 세포와 세척액을 모으고 원심분리로 세포를 수집합니다. 계수를 위해 펠릿을 500마이크로리터의 중간 용량에 다시 현탁시킵니다.그런 다음 96웰의 평평한 바닥 플레이트에 120마이크로리터의 중간 용량으로 구성된 웰당 10배에서 4번째 세포를 파종하고 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양 전에 세포를 원심분리합니다. 다음 날에는 대부분의 심근세포가 박동을 해야 합니다. transfection을 시작하기 전에 RNAse 오염 제거 용액으로 벤치와 모든 transfection 재료를 닦아 RNAse를 제거합니다.모든 재료가 준비되면 새로 준비된 siRNA 믹스 20마이크로리터를 각 웰에 추가하고 세포를 48시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이틀 후, 각 웰의 상등액을 120마이크로리터의 미디엄 1로 교체하고 세포를 최소 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양이 끝나면 PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 4% 포름알데히드 용액에 20분 동안 고정합니다.컨포칼 비디오 현미경으로 세포를 분석하려면 플레이트를 컨포칼 현미경 스테이지로 옮기고 이미징 소프트웨어를 시작합니다. A1plus 설정을 열고 채널 1, 2, 3, 4 상자를 선택합니다. 풀다운 메뉴에서 채널 1을 DAPI로, 채널 2를 eGFP로, 채널 3을 RFP, 채널 4를 Cy5로 설정합니다.채널 전압을 클릭하고 슬라이드 막대를 사용하여 각 채널에 대해 전압을 80으로 설정합니다. 슬라이드 바를 사용하여 오프셋을 0으로 설정하고 홈 버튼을 클릭하여 핀홀을 홈 위치로 설정합니다. 풀다운 메뉴에서 스캔 크기를 1024 x 1024 픽셀로 설정합니다.최적화를 클릭하여 XYZ 크기 설정 창을 열고 제안된 단계 Z.Select 20x objective에서 완벽한 복셀 상자를 선택하고 사진이 과소 노출되거나 과다 노출되지 않을 때까지 레이저 강도를 조정합니다. 모든 파라미터가 설정되었으면 획득 메뉴를 엽니다. 큰 이미지 스캔을 선택한 다음 영역 아래 왼쪽 상단 모서리에 있는 현재 위치를 선택합니다.그런 다음 X와 Y의 필드 수를 3x3으로 설정하고 스캔을 클릭합니다. 심근세포 핵의 수를 정의하려면 measure(측정), manual measurement(수동 측정) 및 counts(개수)를 클릭합니다. H2B-mCherry 신호가 있는 핵을 선택하여 표시하고 계수합니다.그런 다음 알파-액티닌 양성 세포를 선택하여 심근세포의 수를 결정합니다. 핵 EGFP 아날린 신호가 있는 G1, S, G2 위상 심근세포를 계수하려면 measure, manual measurement 및 counts를 선택합니다. 클릭으로 핵을 발현하는 EGFP 아날린 및 H2B-mCherry를 표시하고 수축 고리 및 중간체와 같은 유사분열 특이적 EGFP 아날린 신호로 심근세포를 수동으로 계산합니다.그런 다음 측정(measure), 수동 측정(manual measurement), 계수(counts)를 클릭하고 유사분열 특이적 EGFP 아날린 신호, 세포질 신호, 수축성 고리 및 중간체가 있는 심근세포를 클릭합니다. 음성 대조군과 비교했을 때, miRNA 및 siRNA transfection된 심근세포는 세포주기 활성의 유도를 보여줍니다. endoreduplication을 수행하는 심근세포는 독점적으로 핵 EGFP 아날린 발현을 나타내는 반면, 세포 분열을 겪는 심근세포는 M상 전형적인 국소화에서 EGFP 아날린 발현을 나타냅니다.Langendorff 장치에서 심장 조직의 효소 분해 후, 심방과 심실을 기계적으로 분리하고 독립적으로 분석할 수 있으며, 이를 통해 H2B-mCherry 양성 이중핵 심근세포가 많은 H2B-mCherry 형질전환 심실근세포를 시각화할 수 있습니다. 대조적으로, 대부분의 심방 심근세포는 단핵세포입니다. 효소 분해는 알파-액티닌 염색에 의한 교차 줄무늬 패턴을 드러내는 100% 단세포 집단을 초래하지 않으며, 교차 줄무늬와 세포 이중선의 연속적인 패턴으로 이중핵 심근세포 간의 구별을 더욱 용이하게 합니다.두꺼운 슬라이스에서 심근세포의 이중핵형성 지수를 분석하려면 핵이 반드시 하나의 Z-평면 내에 있을 필요는 없기 때문에 스택을 수동으로 스크롤해야 하며, 밀 배아 응집소 염색을 통해 세포 검출을 허용borders. 3D 성인 형질전환 마우스 심장의 고정 슬라이스를 재구성하면 후크를 검출하고 자동으로 계산할 수 있습니다. 염색된, 및 H2B-mCherry 양성 핵을 사용하여 조직 내 생리학적 조건 하에서 심근세포 핵의 비율을 결정합니다. 일단 숙달되면, 심장 해리는 제대로 수행된다면 2-3시간 내에 완료될 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 실험 전반에 걸쳐 세포의 생존력을 유지하기 위해 지속적으로 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 microRNA 또는 기타 작은 물질의 산후 심근세포에서 증식 유도 효과를 스크리닝할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

심장 핵​​은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

심근세포 회전율의 정량화는 어렵습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 신심근세포 핵 생성 및 핵 ploidy의 정확하고 민감한 정량화를 가능하게 함으로써 이러한 과제에 중요한 기여를 합니다.

심근 DNA 합성 및 배수성의 동시 평가 : Method는 심근 재생 및 회전율의 정량을 지원합니다

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

기존의 방법은 인간 만능의 서스펜션 집계를 기반으로 심장 분화 세포 (hPSCs) 골재의 크기와 모양에 대한 문화의 이질성으로 고생하는 줄기 시작합니다. 여기, 우리는 크기 조절 hPSC가 심장 촉진 조건에서 배양 집계 생성하는 마이크로 웰을 사용하는 심장 차별화를 위해 강력한 방법을 설명합니다.

인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화

이 원고는 Gata4, Hand2, Mef2c 및 Tbx5의 레트로바이러스 매개 전달을 사용하여 다양한 재프로그래밍된 심장 아형의 생성 및 정량화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

이 연구의 목표는 성인 심장에서 심근세포를 재현하고 DNA 함량 및 핵형성을 측정하는 방법을 개발하는 것입니다.

면역 세포 화학 및 Ploidy 분석을 위한 고정된 심혼에서 심근세포의 격리

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

학습하세요 형광 현미경을 이용한 출생 후 심근 세포의 세포주기 활성 및 핵 특성 시각화 방법을. 이 기술은 심장 재생 연구에서 세포 분열과 배수성 변화를 구분하는 데 활용됩니다.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

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