Avançando a imagem de alta resolução de conjuntos de vírus em líquido e gelo

Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.

O interesse na microscopia eletrônica líquida disparou nos últimos anos, como podemos visualizar agora nos processos em tempo real em nanoescala. Um melhor conhecimento sobre essas estruturas flexíveis pode nos ajudar a desenvolver novos reagentes para combater patógenos emergentes, como o SARS-CoV-2. Ver proteínas em um ambiente fluido ajuda a imitar sistemas biológicos e nos dá a oportunidade de olhar para as proteínas de uma maneira mais dinâmica.

E este experimento mostrará novas técnicas sobre como usar e visualizar proteínas em ambientes de gelo vítreo e líquido. Resultados recentes incluem insights dinâmicos de candidatas a vacinas em terapias baseadas em anticorpos com imagens em líquido. As aplicações correlativas de líquido e crio-EM avançam nossa capacidade de visualizar a dinâmica molecular, fornecendo um contexto único para a saúde e a doença humanas.

Os leitores que empregam tecnologias convencionais de TEM ou crio-EM podem considerar a implementação de fluxos de trabalho de EM líquidos para fornecer novas observações dinâmicas de suas amostras de uma forma que complemente suas estratégias atuais. Os sistemas de EM líquido comercialmente disponíveis podem fornecer fluxo, mistura, estímulos eletroquímicos e controle de temperatura, que são essenciais para muitas aplicações de imagem em tempo real. O método sanduíche de microchip apresentado aqui descreve uma maneira simples de nível de entrada para visualizar primeiro os espécimes em líquido antes de dar o salto para um sistema comercial mais complexo para experimentos in situ.

Para começar, limpe os microchips de nitreto de silício incubando cada chip em 150 mililitros de acetona por dois minutos, seguido de incubação em 150 mililitros de metanol por dois minutos. Deixe os cavacos secarem em um fluxo de ar laminar. Limpe a plasma os cavacos secos usando um instrumento de descarga de brilho operando em condições padrão por 45 segundos usando gás argônio.

Em seguida, carregue um microchip de base seca na ponta do suporte da amostra e adicione cerca de 0,2 microlitros da amostra ao chip de base. Depois de incubar por um a dois minutos, coloque o chip superior no chip de base úmida que contém a amostra. Plante o conjunto em conjunto para formar um invólucro hermeticamente selado mantido no lugar mecanicamente por três parafusos de latão.

Bombeie a ponta para 10 para o torr de menos seis usando uma estação de bombeamento seco com bombeamento turbo. O suporte está agora pronto para ser inserido no TEM. O plasma limpa os microchips e as grades de carbono usando um instrumento de descarga de brilho por 45 segundos.

E adicione cerca de dois microlitros de amostra a um microchip descarregado de brilho colocado em um pacote de gel. Retire o excesso de solução usando papel de filtro ou uma pipeta e incube por um a dois minutos. Em seguida, adicione a grade de carbono descarregada por brilho ao microchip úmido que contém a amostra.

Plante o conjunto em conjunto usando um único suporte de amostra de inclinação à temperatura ambiente para formar um invólucro hermeticamente fechado. Como alternativa, use clipes de grade do carregador automático e coloque o conjunto sanduíche no clipe C inferior. Coloque o clipe superior em cima do conjunto e use a ferramenta de fixação padrão para selar o conjunto.

O espécime está agora pronto para ser inserido no TEM. Examine as amostras colocadas em carregadores automáticos sob condições criogênicas ou à temperatura ambiente. Para imagens de EM líquido, carregue o suporte da amostra no MET equipado com um canhão de emissão de campo e opere a 200 quilovolts.

Ligue a pistola e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio em relação à amostra usando a função oscilante, inclinando a amostra de menos 15 graus para mais 15 graus na coluna. Este procedimento ajusta o estágio na direção Z para acomodar a espessura da amostra e ajuda a garantir uma ampliação precisa durante a gravação da imagem. Grave imagens como filmes longos emoldurados ou imagens individuais usando o pacote de software de coleta de dados seriais, implementando rotinas de imagem automatizadas.

Adquira imagens em condições de baixa dose em ampliações que variam de 28.000X a 92, 000X e 40 quadros por segundo. Ajuste os tempos de exposição para minimizar os danos do feixe à amostra e use uma faixa de desfocagem de menos um a quatro micrômetros na ampliação especificada. Se uma solução espessa for encontrada, use valores de desfocagem mais altos ou selecione uma região diferente de interesse.

Certifique-se de que a solução esteja presente nas amostras durante toda a sessão de imagem, concentrando o feixe de elétrons em uma área de sacrifício não usada para coleta de dados até que as bolhas sejam formadas. Analise filmes para partículas de SARS-CoV-2 usando o programa RELION-3.0.8 ou qualquer outro software de processamento de imagem. Execute a correção de movimento usando o programa MotionCor2.

Uma vez corrigido, extraia partículas usando a ferramenta de seleção automática no pacote de software do programa. Os tamanhos típicos das caixas são de 330 pixels para espécimes líquidos e 350 pixels para espécimes de gelo. Calcule as reconstruções iniciais usando a simetria C1 com a rotina do modelo inicial 3D do programa e as opções do modelo ab initio no pacote de software de processamento de dados.

Em seguida, execute protocolos de refinamento no software de processamento de dados. Examine os resultados usando um pacote de software de análise de estrutura molecular enquanto avalia as mudanças dinâmicas. Uma comparação das estruturas líquido-EM e crio-EM no subtipo de vírus adenoassociado três ou AAV é mostrada aqui.

As imagens representativas mostram a estrutura do AAV na solução e no gelo. As vistas rotacionais da subunidade AAV VP1 extraídas das estruturas líquidas e de gelo são mostradas aqui. Essas imagens representam os valores dinâmicos nas estruturas líquidas geradas usando a função morph map no software de análise de estrutura molecular.

As estruturas médias de vários conjuntos de vírus mostram mudanças conformacionais com uma mudança de diâmetro de quase 5% medida usando dados EM. Uma imagem de conjuntos subvirais do SARS-CoV-2 isolados de frações séricas de pacientes com COVID-19 é mostrada aqui. Essas bolhas brancas indicam a presença de líquido na amostra.

Uma reconstrução EM desses conjuntos subvirais é mostrada aqui com densidades radiais coloridas a cinco fatias nanométricas através do mapa. A imagem representativa descreve a análise de partículas de dupla camada de rotavírus preparadas em gelo vítreo utilizando a técnica de sanduíche de microchip. O uso de detergentes, glicerol, polietileno, glicóis e altos níveis de açúcares deve ser minimizado ou evitado para imagens líquidas-EM.

Esses reagentes podem introduzir artefatos, criar borbulhamento excessivo, produtos de hidrólise e radicais livres devido a danos no feixe. O uso desses protocolos permitirá que os cientistas possam estudar processos dinâmicos em detalhes atômicos. E isso se estende por vários campos da ciência, incluindo medicina, ciências da vida e pesquisa de materiais.

Os protocolos apresentados aqui descrevem como ferramentas de última geração podem fornecer um meio empolgante de visualizar macromoléculas biológicas através de novos olhos. O campo da microscopia eletrônica líquida pode elevar a forma como estudamos esses novos vírus que representam uma ameaça à saúde humana, talvez até contribuindo para nossas medidas de preparação para a pandemia.