Usando um método imunohistoquímico de montagem total para estudar a preservação do trato biliar em Suncus murinus

O objetivo geral deste procedimento é empregar coloração imuno-histoquímica de montagem total para a visualização da distribuição nervosa dentro do trato biliar de Suncus murinus. Este método pode ser usado para analisar a distribuição nervosa dos órgãos viscerais de muitas espécies, particularmente órgãos irregulares ou pequenos que são difíceis de avaliar por métodos padrão. As principais vantagens dessa técnica são que a operação é simples.

Não requer procedimentos complicados e tem uma alta taxa de sucesso. Demonstrando o procedimento comigo estarão Yidan Dai, um estudante de pós-graduação, e Shuang-Qin Yi, um pesquisador, ambos do meu laboratório. Comece lavando o animal com PBS individual e 4% de perfusões de paraformaldeído em uma capela de exaustão.

Em seguida, injete dois a três mililitros de látex de neoprene branco através do cateter de perfusão na aorta abdominal para rotular os vasos sanguíneos. E quando todos os tecidos de interesse tiverem sido marcados, extraia os órgãos abdominais e seus nervos e vasos relacionados. Em seguida, injete aproximadamente 0,1 mililitros de látex de neoprene azul na vesícula biliar para rotular o sistema biliar e pós-fixar os tecidos em paraformaldeído a 4% durante a noite a quatro graus Celsius para imunocoloração de montagem total.

Na manhã seguinte, transfira a amostra para um frasco de vidro para quatro lavagens em temperatura ambiente de uma hora em água destilada em um nutador. Após a última lavagem, incubar os tecidos em ácido ortoperiódico a 1% recém-preparado durante 20 minutos à temperatura ambiente para evitar quaisquer reações intrínsecas da peroxidase. Em seguida, lave a amostra em água destilada por 10 minutos em temperatura ambiente, seguida de incubação em papillon a 0,004% recém-preparado por duas horas em banho-maria de temperatura constante a 37 graus Celsius com balanço suave.

No final da incubação, lave a amostra com água destilada por 50 a 60 minutos. Em seguida, armazene os tecidos em paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, lave a amostra em água destilada, como acabamos de demonstrar, seguida de outra incubação de duas horas em papillon recém-preparado.

Lave a amostra por mais 50 a 60 minutos em água destilada, seguida de fixação noturna em paraformaldeído a 4%. Na terceira manhã, lavar os tecidos quatro vezes em água destilada, seguida de imersão em três incubações sequenciais de sacarose ascendente de 30 minutos. Em seguida, congele a amostra a menos 20 graus Celsius por 30 a 60 minutos, seguido de descongelamento completo em temperatura ambiente.

Após o terceiro ciclo de congelamento e descongelamento, transfira a amostra para 2% Triton X-100 para uma incubação noturna de quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, transfira a amostra para um recipiente do anticorpo primário de interesse para um balanço suave no nutador a quatro graus Celsius por três a seis dias, de acordo com o tamanho da amostra. Após o período de rotulagem apropriado, remova o anticorpo primário não ligado com quatro lavagens de uma hora em PBS à temperatura ambiente e rotule a amostra com o anticorpo secundário apropriado por três dias com balanço suave a quatro graus Celsius.

No final do período de marcação de anticorpos secundários, lave a amostra quatro vezes em PBS. Em seguida, incube os tecidos em 10 microlitros de peróxido de hidrogênio a 30% em 100 mililitros de solução de coloração 0,002% DAB recém-preparada a quatro graus Celsius por 16 a 72 horas com balanço suave. Quando a intensidade de coloração ideal for atingida, transfira a amostra para 0,04% de azida de sódio em PBS para interromper a reação de coloração.

Em seguida, mergulhe cuidadosamente a amostra em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo PBS fresco e capture imagens de montagem inteira dos tecidos usando uma câmera montada em um microscópio estéreo. Além da visualização da inervação do trato biliar extra-hepático, a marcação com anticorpos contra fibras nervosas positivas para neurofilamentos também permite a identificação inequívoca da densidade de funcionamento e distribuição do nervo vago ao longo do esôfago e no estômago. A marcação dos vasos sanguíneos da vesícula biliar com látex de neoprene branco revela fibrose nervosa fina em alto contraste com os tecidos circundantes com maior densidade de inervação observada no colo da vesícula biliar do que no fundo.

No ducto biliar superior, dois tipos de feixes nervosos são rotulados, os feixes nervosos finos que formam uma rede irregular e densa de nervos e correm adesivamente residindo no trato biliar e os feixes neurais mais espessos que são distribuídos paralelamente à superfície do trato biliar. A marcação do ducto colédoco com látex de neoprene azul e dos vasos com látex de neoprene branco permite a visualização das fibras nervosas finas no final do ducto colédoco e da área da papila duodenal. Antes de tentar este procedimento, tome cuidado para reproduzir o cronograma de cada um dos experimentos, pois todo o processo requer de duas a três semanas para ser concluído.

Para evitar danificar a amostra ao trocar as soluções, sempre despeje as soluções em vez de remover a amostra com uma pinça. Depois de assistir a este vídeo, você poderá aplicar essa técnica à rotulagem de uma variedade de nervos em vários órgãos viscerais.