Name: Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Aprenda a cultivar neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de neuritogênese e maturação sináptica. Este método otimiza a viabilidade celular e permite estudos funcionais detalhados.

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Este trabalho é um componente dos grupos nacionais cooperativos reprogramados da pesquisa da pilha (NCRCRG) para estudar a doença mental e foi apoiado pela concessão de NIH U19MH1 2015-0644. O trabalho inicial também foi apoiado pelo NIH Grant NS070297. Agradecemos aos Drs. Carol Marchetto e Fred Gage, o Instituto Salk, por fornecer a linha WT 126 de células progenitoras neurais, e DRS. Eugene Yeo e Lawrence Goldstein, UC San Diego para fornecer a linha CVB WT24 de células progenitoras neurais. Agradecemos a Deborah pre no laboratório do Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, para discussões úteis.

1. período de diferenciação antes de responder
<ol><li>Diferencie os neurônios em pratos de 10 cm, usando um protocolo de escolha7,8até que os neurônios formaram uma rede espessa com seus processos e expressam não apenas marcadores neuronais precoces, como map2 ou TuJ1, mas também marcadores tardios, como Neun.</li>
	<li>
Mude metade do meio de escolha a cada 4 dias durante o processo de diferenciação neuronal. Nota: mudanças médias mais extensas ou freqüentes diluem fatores tróficos essenciais e podem desfavorecer a maturação.<ol>
<li>Para os neurônios WT126 derivados do iPSC, use os seguintes meios de cultivo pós-diferenciação: 5 mL de suplemento de N2 100x, 10 ng/mL de BDNF, 10 ng/mL de GDNF, 1 μg/mL de laminina, 200 μM de ácido ascórbico, 1 μM de dibutyryl-cAMP e 10 mL SM1 para 500 mL de meio/ mistura nutritiva F-12 (DMEM/F12). Gradualmente, usando meia-mídia muda, substituir com o meio neural basal (tabela de materiais) e os mesmos suplementos.</li>
		<li>Para os neurônios CVB WT derivados do iPSC, use o seguinte meio de cultivo pós-diferenciação: 500 mL de meio neural basal A (tabela de materiais) e 500 ml de meio DMEM/F12 com laminina a 2 μg/ml, suplemento de glutamina a 10 ml (tabela de materiais), 0,75 mg/ml de bicarbonato de sódio, 5 ml mínimo essencial médio (MEM) não essenciais aminoácidos, 0,2 mm ácido ascórbico, 10 ng/ml BDNF, 20 ml 50x B27, e 10 ml 100x N2 suplemento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. revestimento Multipoços
<ol><li>O dia antes de replating, revestimento com poli-L-ornithine (PLO). Dissolver PLO em água estéril para fazer uma solução de estoque (10 mg/mL). Armazene este estoque em-20 ° c. Diluir PLO 1:100 em água para produzir uma concentração de 50 μg/mL quando o revestimento de vidro e 1:1000 relação (10 μg/mL) quando o revestimento de plástico.</li>
	<li>Aplique o revestimento diretamente nas placas alvo. Use o volume do revestimento apropriado ao tamanho da placa (isto é, para uma placa de 24 poços aplique 500 μL da solução de PLO por o poço).</li>
	<li>Permita que as placas se sentem no escuro durante a noite na temperatura ambiente.</li>
	<li>Recupere placas revestidas no dia de repique e de transferência a um armário estéril da Biossegurança.</li>
	<li>Aspirar a solução PLO e enxaguar duas vezes com água estéril.</li>
	<li>Diluir a laminina (1,15 mg/mL) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) a 1:400 diluição. Nota: Descongelar laminina a 4 ° c e adicionar rapidamente a PBS para evitar a agregação de laminina e revestimento irregular.</li>
	<li>Aspirar água estéril e aplicar 500 μL de revestimento de laminina a poços previamente revestidos com PLO.</li>
	<li>Coloque as placas em uma incubadora de 37 ° c por um mínimo de 4-6 h. Use incubações mais longas, até 16 h, para superfícies de vidro. Use tempos de incubação consistentes.</li>
</ol>3. replando neurônios diferenciados
<ol><li>Enxágüe a placa de neurônios diferenciados com PBS uma vez delicadamente. Disperse PBS suavemente para baixo da parede da placa, e não diretamente sobre as células, para evitar interrompê-los.</li>
	<li>Gentilmente aspirar PBS, sendo cuidadoso para evitar tocar as células diretamente, mas para aspirar a partir da borda do prato, enquanto derrubá-lo para o pesquisador.</li>
	<li>Aplique no mínimo 1 mL da enzima proteolítica (tabela de materiais) por placa de 10 cm e células de retorno à incubadora. Adicione volumes ligeiramente mais elevados se a sala da cultura do tecido exibe uma taxa de evaporação elevada devido à baixa umidade.</li>
	<li>Incubar células com enzima proteolítica para 40-45 min, a fim de destacá-los da placa e desanexá-los de outros neurônios dentro da rede neuronal. Nota: O tempo nesta etapa é crítico. Extinguir a protease muito cedo pode levar ao aumento da morte celular após a resposta. O fabricante da enzima proteolítica recomenda que as temperaturas muito inferiores a 37 ° c sejam utilizadas com períodos de incubação mais longos para as linhas celulares de de (por exemplo, durante a noite a 4 ° c). No entanto, os neurônios de manuseio a 4 ° c devem ser evitados, pois muitas vezes mostram a baixa sobrevida após a exposição ao frio. O fabricante igualmente indica que uma incubação de 60 minutos com a enzima em 37 ° c conduz a sua inactivação enzimática. Entretanto, na experiência dos autores, uma incubação de 40-45 minutos de culturas neuronal hiPSC-derivadas em 37 ° c é suficiente para a dissociação eficiente e a sobrevivência neuronal excelente em cima de responder.</li>
	<li>Verifique os neurônios em um microscópio de contraste de fase durante o tempo de incubação e permitir que o tratamento de protease para continuar até que a rede neural se desconecta completamente da placa e começa a se separar em folhas menores ao agitar brevemente a placa o Microscópio.</li>
	<li>Saciar a atividade da protease usando 5 mL de mídia DMEM fresca por 1 mL de protease na placa de 10 cm para parar a digestão. Triturar suavemente as células contra a placa 5-8 vezes para interromper a rede, utilizando pipetas serológicas. Tenha cuidado para não aplicar demasiada pressão ao triturar, pois os neurônios diferenciados são frágeis. Não use uma ponta P1000, como o fim é muito afiada e estreita, e, portanto, pode pura ou danificar os neurônios.</li>
	<li>Aplique a solução com as pilhas através de um filtro da pilha com engranzamento do diâmetro de 100 μm em uma gota cónica fresca do tubo 50 mL pela gota.</li>
	<li>Enxague o filtro com um adicional de 5 mL de mídia DMEM fresca, após as células terem sido filtradas.</li>
	<li>Gire pilhas no centrifugador do de bancada em 1.000 x g por 5 minutos.</li>
	<li>Retorne o tubo cônico ao gabinete de biossegurança e aspirar a maioria dos meios de comunicação, deixando em torno de 250 μL para garantir que as células retenham a humidade.</li>
	<li>Reressuscite as células suavemente em 2 mL de mídia DMEM fresca. Não pipeta o pellet contra o lado do tubo. Em vez disso, inverta suavemente cónicos 2-3 vezes e passar as células através do final de um 5 mL de Pipet serológico para desalojar-los.</li>
	<li>Aplique 10 μL de neurônios ressuscipended na borda de um Hemocytometer.</li>
	<li>Adicionar 8-10 μL de azul de Tripan a gotículo de células para avaliar a viabilidade celular durante esta etapa de ressuscipensão. Aplique 10 μL desta mistura ao hemocitômetro ou aos outros contadores automáticos da pilha. Avaliar como viável as células que são fase brilhante e excluir o corante azul Tripan.</li>
	<li>Determine a quantidade de células/mL viáveis, e prepare-se para diluir o conteúdo do tubo cônico de acordo com a densidade da célula desejada.</li>
	<li>Placa ~ 10.000 células por poço para uma placa de 384 poços; placa ~ 150000-200000 células por poço para uma placa de 24 poços.</li>
	<li>Adicione o DMEM fresco ao tubo cônico das células reressuscitadas para obter a diluição apropriada e adicione suplementos apropriados adicionais, como B27 e/ou BDNF, dependendo dos requisitos da linha celular específica.</li>
	<li>Incline suavemente o tubo cônico para misturar 2-3 vezes.</li>
	<li>Aspire o revestimento do laminina da placa 24-well, ou da placa do de do 384-well usando um Pipet de 16 canais e enxague uma vez com PBS.</li>
	<li>Aspirar PBS usando um P1000 para a placa de 24 poços, ou a pipeta de 16 canais para placas 384-well.</li>
	<li>Aplique a solução da pilha a cada poço em um movimento da figura oito para evitar aglomerar. A uniformidade do chapeamento também pode ser otimizada usando dispositivos de manuseio de líquidos automatizados. Nota: A adição de laminina para a mídia a partir de 2-4 dias pós-replating também ajuda a manter uma distribuição homogênea das células.</li>
	<li>Repita as etapas 3,19 e 3,20 para cada poço.</li>
	<li>Retorne a placa à incubadora ajustada em 37 ° c e em 5% CO2.</li>
	<li>Depois de 2 dias, comece a mudar metade do meio a cada 4 dias usando a mídia de cultivo pós-diferenciação descrita na seção 1,2. Após o tempo de maturação desejado, fixar culturas usando 3,7% formaldeído a 37 ° c e células de mancha de acordo com as exigências experimentais.</li>
</ol>4. ensaios de viabilidade celular post-replating
<ol><li>Adicione o repórter de morte celular precoce (VivaFix: 0,5 μL da solução de estoque de 50 μL por 500 μL de mídia de cultura por poço) depois de rapidamente vortexing a solução de estoque.</li>
	<li>Imagem as células ao vivo e mortas cultivadas em multipoços de vidro-fundo, após 20 min, sem qualquer etapa de lavagem, uma vez que o corante fluoresce a apenas um dentro das células, ou correção e co-mancha com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e/ou outros anticorpos antes de imagem usando um microscópio confocal.</li>
</ol>5. imunocoloração
<ol><li>Corrija culturas com 3,7% de formaldeído em PBS mais 120 mM de sacarose por 20 min a 37 ° c.</li>
	<li>Enxague e Permeabilize com 0,2% Triton X-100 por 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, bloqueie por 30 min com 2% de albumina sérica bovina (BSA).</li>
	<li>Aspire a BSA sem enxaguar e incubar por 1 h em temperatura ambiente com coelho MAP2 anticorpo 1:1000, mouse anti-β3 tubulina (TuJ1) Anticorpo 1:2000, frango anti-NeuN anticorpo (1:100) e Rat anti-CTIP2 anticorpo (1:500), ou com mouse anti-PSD95 ( 1:200), coelho anti-synapsin 1 (1:200) e frango anti-MAP2 anticorpo para coloração sináptica.</li>
	<li>Enxague com PBS, e incubar com os anticorpos secundários conjugados de Alexa fluor mais DAPI para 45 min em 37 ° c.</li>
	<li>Finalmente, lave duas vezes com PBS antes da imagem latente.</li>
</ol>6. imagem latente do cálcio
<ol><li>Infectar células cultivadas com AAV8-SYN-jGCAMP7f-WPRE (o Instituto Salk de estudos biológicos, GT3 Core Facility) em 10 dias após a reresposta e imagem para avaliar transientes de cálcio espontâneo em 3-4 semanas após a resposta.</li>
</ol>7. aquisição e análise de imagens
Nota: Para mais informações sobre o sistema de aquisição, consultar Calabrese et al.12.
<ol><li>Use um módulo de imagem para aquisição manual ou automatizada de imagens e um módulo de software de análise de imagem, como o CellProfiler13, para medições morfométricas.</li>
	<li>Calcule o comprimento médio de TuJ1 positivos e MAP2 dendritos positivos medindo o comprimento total por campo de visão dividido pelo número de neurônios (DAPI + MAP2 ou TuJ1 células positivas) dentro do mesmo campo.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós demonstramos um procedimento reto para a ressuscita e a resposta de culturas neuronal humanas que aperfeiçoa a viabilidade, o sucesso da diferenciação, e a imagem latente subcellular em uma maneira que seja compatível com as plataformas elevadas da seleção satisfeita, e outros ensaios relevantes para a descoberta de fármacos. A Figura 6 ilustra o fluxo de trabalho geral e exemplos de tais aplicativos.
Embora aqui nós nos concentramos em neurônios derivados de ...

Células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC)-os neurônios derivados são cada vez mais relevantes nas áreas de pesquisa básica, desenvolvimento de fármacos e medicina regenerativa. Fluxos de trabalho e procedimentos para otimizar sua cultura e manutenção, e melhorar a eficiência da diferenciação em subtipos neuronais específicos, estão evoluindo rapidamente1,2. Para melhorar a utilidade e a relação custo-eficácia dos neurônios derivados de células-tronco humanas como sistemas modelo que permitem análises de alto conteúdo na descoberta de fármacos e na validação de alvos, é útil diminuir o tempo de cultivo necessário para gerar neurônios, mantendo a máxima robustez, reprodutibilidade e relevância do fenótipo. Embora as culturas organoid 3-dimensionais estejam conduzindo avanços na pesquisa do neurodesenvolvimento3, as culturas do monocamada 2-dimensional são especial compatíveis com as aplicações Imaging-based automatizadas devido a sua espessura mínima do tecido.
No entanto, a adaptação de métodos de triagem baseados em imagem para modelos de doença neurológica e neurodesenvolvimental humana enfrenta um grande desafio. O período prolongado sobre o qual o sistema nervoso humano amadurece in vivo necessita de tempo estendido na cultura para acomodar programas naturais de expressão gênica e alcançar a maturação neuronal.
Uma conseqüência prática do programa longo da diferenciação neuronal é que a manutenção de culturas monocamada hipsc-derivadas deve ser sustentada por muitas semanas para conseguir a maturidade adequada do sinapse. Durante esse tempo, os progenitores neurais que permanecem indiferenciados continuam a se dividir. Estes podem rapidamente overgrow a cultura e usurpar o índice nutriente exigido para manter neurônios células viáveis. A divisão vigorosamente de células progenitoras neurais (NPCs) também pode competir com neurônios para o substrato de crescimento. Isso pode tornar essas culturas sujeitas a problemas de má adesão, uma condição inadequada para ensaios baseados em imagem. Além disso, muitos investigadores acham que quanto menor o volume de cultura, maior a dificuldade em manter populações saudáveis de neurônios diferenciados tempo suficiente para observar os estágios tardios da diferenciação neuronal. Em outras palavras, os ensaios de maturação de sinapse usando abordagens de rastreamento de alto conteúdo (HCS) podem ser muito desafiadores para os neurônios derivados do ser humano.
Para contornar alguns desses problemas, foi utilizado um procedimento de ressuscito e replante de neurônios derivados de hiPSC previamente diferenciados. Em primeiro lugar, permite o estudo do crescimento do neurite (ou, mais precisamente, regeneração de neurite) em uma população de neurônios totalmente comprometidos. Em segundo lugar, a resposta de neurônios previamente diferenciados de um formato de grande volume (como placas de 10 cm ou maior), até formatos de volume pequeno (como placas de de microtitulação 96-ou 384-well compatíveis com HCS) permite uma redução significativa no tempo total de cultivo em a condição de pequeno volume. Isto facilita o estudo do conjunto e da maturação da sinapse sobre semanas subseqüentes in vitro.
No entanto, a resposta de neurônios maduros que já estabeleceram neuritos longos e uma complexa rede de conectividade apresenta vários desafios, um dos quais é a taxa às vezes alta e variável de morte celular. Aqui, nós descrevemos um procedimento de repique que resulte na sobrevivência e na reprodutibilidade excelentes da pilha. Comumente, os neurônios são expostos a enzimas proteolíticas para períodos curtos de incubação (tipicamente ~ 3-10 min), a fim de separar as células do substrato antes da trituração. Este breve tempo de proteólise é habitualmente utilizado para ressuscitar e de muitos tipos de células divisórias, incluindo células não-neuronais e progenitores indiferenciados4,5,6. No entanto, para neurônios diferenciados que carregam neuritos longos e interligados, é essencial não apenas separar as células do substrato, mas também interromper a rede dendrítica e axonal, a fim de isolar as células individuais, minimizando os danos. Na verdade, uma malha grossa de neurônios geralmente tende a se separar do substrato como uma única folha, em vez de células individuais. Se o cuidado não é tomado para afrouxar a rede grossa de neurites, os neurônios não somente tornam-se irreversivelmente danificados durante o trituration, mas muitos deles não conseguem passar através do filtro usado para remover os grupos, tendo por resultado o rendimento pobre da pilha. Abaixo descrevemos uma simples modificação em um procedimento de incubação de protease amplamente utilizado para contrariar essas dificuldades.
No protocolo descrito abaixo, os neurônios são incubados por 40-45 min com uma protease leve, como a enzima proteolítica (por exemplo, Accutase). Durante o primeiro 5-10 min após a adição da enzima, a rede neuronal levanta-se do substrato como uma folha. A incubação com a protease prossegue por um adicional de 30-40 min antes de prosseguir com trituração e filtração suaves. Este tempo extra da incubação ajuda a assegurar-se de que a digestão do material Relaxe a rede intercelular, assegurando desse modo que o trituration subseqüente produza uma suspensão de pilhas individuais. Este procedimento maximiza a uniformidade da distribuição da pilha em cima de repique ao minimizar a morte da pilha. Nós aplicamos com sucesso este método de repique às culturas neuronal hipsc-derivadas geradas por vários protocolos7,8 da diferenciação e das várias linhas de hipscs. O procedimento é nominalmente adequado para uso com a maioria ou todas as linhas de neurônios derivados de células-tronco. Observou-se que um tempo prolongado de incubação da protease não é absolutamente essencial para a resposta de culturas de placas de pequeno formato (por exemplo, 35 mm de diâmetro); Entretanto, como nós mostramos aqui, fornece um benefício significativo ao repique das placas do grande diâmetro (por exemplo, diâmetro de 10 cm ou maior), provavelmente porque os neuritos em tais placas podem estender processos muito longos e formar uma disposição densa interconectada.
Aqui nós demonstramos este método e ilustram momentaneamente sua aplicação nos ensaios para o neuritogênese adiantado e para a maturação do sinapse, que envolve o agrupamento de proteínas pre-e pós-sináptica ao longo dos dendritos e dos axônios, seguidos por seu mais atrasado colocalização em sítios sinápticos. Os exemplos destacam as vantagens que este protocolo oferece na preservação da viabilidade celular e reprodutibilidade. Primeiramente, permite que os investigadores estudem etapas adiantadas no neuritogenesis humano. O cenário experimental é semelhante às culturas primárias comumente usadas de neurônios corticais ou hipocampais de roedores, onde as células são extraídas do cérebro pós-natal fetal ou precoce, dissociada pela trituração após tratamento suave da protease, e permitiu Iniciar neuritos ou regenerar neuritos que foram cortados no procedimento9,10. Semelhante a tais neurônios primários de roedores, neurónios derivados de hiPSC começam a formar ou regenerar seus neuritos dentro de horas após a resposta, permitindo a imagem de cones de crescimento e morfologia neurite em um ambiente ideal para imagens de alta espaciotemporal com menos células não diferenciadas circundantes. Nós observamos que o conseqüência do neurite é mais sincronizado comparado aos atrasos variáveis e às taxas diferentes do conseqüência consideradas quando os neurônios começam primeiramente a diferenciar-se de uma população do progenitor. Além disso, a resposta permite ensaios de neurônios expressando marcadores de subtipo neuronal que tipicamente aparecem mais tarde no desenvolvimento neural, como a camada cortical 5/6 fator de transcrição CTIP2 (frango ovalbumina transcrição promotor upstream fator-interagindo proteína 2), ou o marcador Pan-neuronal NeuN11. Uma característica especialmente útil da abordagem de resposta é que o sinaptogênese prossegue dentro de um período de tempo compatível com HCS.

<table><tbody><tr><td><forte>Pós Replating Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>Adicione 1 mL de estoque de 200 mM a 1 L de N2B27 media</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Adicione 1 &micro; M</td></tr><tr><td>BDNF Humano</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml concentração final</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Adicionar 20 mL a 1 L N2B27 mídia</td></tr><tr><td>DMEM/F12 com Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31331093</td><td>Adicionar N2 e distribuir em 50 mL cônicos; tampas de filme</td></tr><tr><td>Humano GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL concentração final</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Adicione 10 ml a 1 L de meio N2B27; suplemento de glutamina</td></tr><tr><td>Mouse Laminin</td><td>Sigma</td><td>P3655-10mg</td><td>Adicione 100 &micro; L a 50 mL N2B27</td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos não essenciais</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Adicionar 5 mL a 1 L N2B27 meio</td></tr><tr><td>N2 (100x) Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>Adicionar 5 mL a 500 mL de meio</td></tr><tr><td>Neurobasal A Meio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10888022</td><td>Combine com DMEM/F12 para gerar meio N2B27 para células CVB wt; meio neural basal A</td></tr><tr><td>Meio</td> <td>neurobasalThermofisher Scientific</td><td>21103049</td><td>para células WT126; meio neural basal</td></tr><tr><td>SM1 Suplemento</td><td>StemCell Technologies</td><td>5711</td><td>Adicionar 1:50 ao meio</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25080-094</td><td>Adicionar 10 mL a 1 L N2B27 meio</td></tr><tr><td><forte>Preparação da placa</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placas de cultura de tecidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772-E</td><td>Placas de plástico tratadas com TC Placas de</td></tr><tr><td>cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Thomas Scientific</td><td>1194Y80</td><td>Placas NEST</td></tr><tr><td>Mouse Laminin</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Adicionar 1:400 em plástico</td></tr><tr><td>Poly-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655-10mg</td><td>Adicionar 1:1.000 em plástico</td></tr><tr><td>Água Destilada UltraPure</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>Para diluir Reagentes de Poli-L-Ornitina</td></tr><tr><td><forte>Revestimento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Filtro de Células</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>Estéril, embalada individualmente</td></tr>, placa <tr>de<td>384 poços, não revestida</td><td>PerkinElmer</td><td>6007550</td><td>Coat com PLO e Laminina</td></tr><tr><td>A DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td>solução salina</td></tr> <tr><td>tamponada com fosfato da DulbeccoPlacas de 384 poços pré-revestidas com poli-D-lisina</td><td>PerkinElmer</td><td>6057500</td><td>Enxágue antes de revestir com laminina</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Aplique 1 mL/10 cm de placa por 30-45 min; enzima proteolítica</td></tr><tr><td><forte>Materiais de Fixação</forte>37</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% Formaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-1</td><td>Dissolvido em PBS</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-12</td><td>0,8 g por 10 mL de fixador</td></tr><tr><td><forte>Materiais de imunocoloração</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra anti-camundongo</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Cabra anti-frango</td><td>Invitrogen</td><td>A-11041</td><td>anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Cabra anti-frango</td><td>Invitrogen</td><td>A-21449</td><td>anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 561 Cabra anti-rato</td><td>Invitrogen</td><td>A-11077</td><td>anticorpo secundário</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>visualiza DNA</td></tr><tr><td>anticorpo de camundongo contra b3-tubulina (TuJ-1)</td> <td>Neurômica</td><td>MO15013</td><td>marcador neuronal em estágio inicial</td></tr><tr><td>Anticorpo de rato contra CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td>camada 5/6 cortical neurônios</td></tr><tr><td>Anticorpo de galinha contra MAP2</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B290</td><td>marcador neuronal em estágio inicial</td></tr><tr><td>Anticorpo de galinha contra</td><td>NeuN Millipore</td><td>ABN91</td><td>marcador neuronal em estágio avançado</td></tr><tr><td>Anticorpo de coelho contra MAP2</td><td>Shelley Halpain</td><td>N/A</td><td>marcador neuronal em estágio inicial</td></tr><tr><td>Anticorpo de camundongo contra PSD-95</td><td>Sigma</td><td>P-246</td><td>marcador pós-sináptico</td></tr><tr><td>Anticorpo de coelho contra sinapsina 1</td><td>Millipore</td><td>AB1543</td><td>marcador pré-sináptico</td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina (BSA)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30574,02</td><td>10% em PBS para bloqueio</td></tr><tr>de<td>Titon X-100</td><td>Sigma</td><td>9002931</td><td>Diluir a 0,2% em PBS para permeabilização</td></tr><tr><td><forte>Marcadores de viabilidade</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivafix 649/660</td><td>Biorad</td><td>135-1118 marcador de</td><td>morte celular</td></tr><tr><td>Imaging de cálcio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome do reagente/Equipamento</td><td>Número de catálogo da empresa</td><td></td><td>Comentários/</td></tr><tr><td>Descrição AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td><td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td><td>N/A</td><td>repórter de cálcio em um sistema de entrega viral</td></tr><tr><td>hiPSC-derived NPCs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WT 126 (Y2610)</td><td>Gage lab</td><td>N/A</td><td>Marchetto et al., 2010</td></tr><tr><td>CVB WT24</td><td>Yeo e Goldstein labs</td><td>N/A</td><td>não publicado</td></tr></tbody></table>

resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de neuritogênese e maturação de sinapse

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Os neurônios diferenciados na cultura bidimensional das células progenitoras neurais pluripotentes humanas (NPCs) representam um poderoso sistema modelo para explorar os mecanismos de doença e realizar a triagem de alto conteúdo (HCS) para interrogar o composto bibliotecas ou identificar fenótipos de mutação genética. Entretanto, com as pilhas humanas a transição do NPC ao neurônio funcional, maduro exige diversas semanas. As sinapses normalmente começam a se formar após 3 semanas de diferenciação na cultura monocamada, e várias proteínas neuronais específicas, por exemplo, o marcador Pan-neuronal mais tarde expressando Neun, ou a camada 5/6 neurônio cortical cerebral marcador CTIP2, começam a expressar cerca de 4-5 semanas após a diferenciação. Este tempo longo da diferenciação pode ser incompatível com as condições ideais da cultura usadas para o volume pequeno, plataformas multi-well do HCS. Entre os muitos desafios estão a necessidade de células bem aderidas e uniformemente distribuídas com o mínimo de aglomeração celular e procedimentos de cultura que promovem a viabilidade a longo prazo e a maturação funcional da sinapse. Uma abordagem é diferenciar os neurônios em um formato de grande volume, em seguida, mas-los em um ponto de tempo posterior em HCS-compatível com vários poços. Alguns dos principais desafios ao usar essa abordagem de resposta referem-se à reprodutibilidade e viabilidade celular, devido ao rompimento estressante da rede dendrítica e axonal. Aqui nós demonstramos um procedimento detalhado e de confiança para a célula de haste pluripotente induzida enzimaticamente ressuscitem os neurônios (hipsc)-derivado humanos após sua diferenciação por 4-8 semanas em um formato Large-volume, transferindo os ao de microtitulação 384-well placas, e cultivando-os para umas 1-3 semanas mais adicionais com sobrevivência excelente da pilha. Esta resposta de neurônios humanos não só permite o estudo do conjunto de sinapse e maturação dentro de duas semanas de repique, mas também permite estudos de regeneração neurite e características do cone de crescimento. Nós fornecemos exemplos de ensaios escalonáveis para neuritogênese e sinaptogênese usando uma plataforma 384-well.

A resposta de neurônios derivados de hiPSCs que foram diferenciadas por várias semanas oferece várias vantagens. No entanto, a desanexação e A resposta de neurônios diferenciados que têm dendritos e axônios longos e interligados (Figura 1a) podem resultar em uma fração alta de neurônios irreversivelmente danificados.
Como descrito na seção do protocolo, nós usamos a incubação com uma enzima proteolíticas para separar os neurônios do substrato. Tip...

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Este protocolo facilita o uso de neurônios pluripotentes humanos derivados de células-tronco para aplicações de triagem de alto conteúdo. É particularmente adequado para avaliar sinapses, que em neurônios humanos requerem longos períodos de cultura. Demonstramos a replação de neurônios de pratos de grande formato em multi-poços compatíveis com HCS de forma a preservar sua viabilidade.Contra-intuitivamente, mostramos que estender a incubação de protease antes de resuscupar e replacar produz melhor sobrevida neuronal. Os neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanos são cada vez mais relevantes nas áreas de pesquisa básica, desenvolvimento de medicamentos e medicina degenerativa. Este método de titulação suave pode ser usado para resuspensar qualquer grande mono-camada de células com uma rede espessa de processos.Além dos iPSCs humanos, ele pode ser usado para repelar a cultura dos neurônios primários ou para resuspensá-los para classificação de fato ou sequenciamento de células únicas. É importante seguir os protocolos com cuidado e frequência monitorar o destacamento mediado protease dos neurônios da placa. O tempo ideal de incubação pode variar, dependendo da cultura.A demonstração visual permite que até mesmo investigadores inexperientes reproduzam esse procedimento. Comece enxaguando suavemente a placa de neurônios diferenciados com PBS. Disperse o PBS pela parede da placa e não diretamente nas células para evitar interrompê-los.Aspire o PBS da borda do prato enquanto o derruba, tomando cuidado para não tocar nas células. Aplique pelo menos um mililitro de enzima proteolítica por placa de 10 centímetros. E devolva as células à incubadora por 40 a 45 minutos.Durante a incubação, verifique os neurônios em um microscópio de contraste em fases e continue o tratamento de protease até que a rede neural se desprende completamente da placa e comece a se quebrar. Quando os neurônios se separarem, parem a digestão adicionando cinco mililitros de mídia DEMEM fresca para cada mililitro de protease. Use uma pipeta sorológica para titular suavemente as células contra a placa cinco a oito vezes, certificando-se de não aplicar muita pressão.Coe as células através de uma malha de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros, gota a gota. E enxágue o coador com mais cinco mililitros de mídia DMEM fresca. Use uma centrífuga de bancada para girar as células a 1000 vezes G durante cinco minutos.Após a centrifugação, devolva o tubo cônico ao armário de biossegurança e aspire a maior parte da mídia, deixando 250 microliters para manter as células úmidas. Levemente resuspenque as células em dois mililitros de mídia DMEM fresca e passe-as através do final de uma pipeta sorológica de cinco mililitros. Finalmente, inverta o tubo duas a três vezes.Use um hemótmetro e azul tripano para contar as células viáveis. E então DMEM para a concentração desejada. Adicione suplementos apropriados ao tubo, dependendo dos requisitos da linha celular específica e misture suavemente as células inclinando o tubo cônico duas a três vezes.Aspirar revestimento de laminina a partir de uma placa de 24 poços e enxágüe-o uma vez com PBS. Aspire a PBS. E aplique solução celular a cada poço em um movimento de figura oito para evitar a aglomeração.Quando terminar de emplacar as células, devolva a placa à incubadora fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Brevemente vórtice a solução de estoque do repórter de morte celular precoce e adicioná-lo aos poços de acordo com as instruções do manuscrito. Espere 20 minutos.E então imagem as células vivas e mortas em vários poços de fundo de vidro. Prolongar a incubação protease permite o afrouxamento da rede neuronal dentro da folha levantada das células. Isso resulta em redução da morte celular no momento da dissociação, bem como resulta em uma recuperação mais eficiente nos dias seguintes.Usando o procedimento de incubação de enzimas estendida, as culturas exibem uma duplicação aproximada da viabilidade celular durante os dias após a replação e uma menor densidade de células mortas ou moribundas. A fase de transição da diferenciação neuronal ocorre ao longo de vários dias, durante a qual as células gradualmente expressam marcadores neuronais em estágio final. Esses marcadores são imediatamente detectados em culturas que foram repartidas após quatro semanas de pré-diferenciação.O protocolo de protease estendido também melhora moderadamente o crescimento do neuride. Tanto o comprimento total do neuride quanto o crescimento do dendrite são melhorados. Replaing também é útil para estudar sinapses.Apenas uma semana após a replação, foram observados marcadores para proteínas pré e pós-sináptica. Além disso, a atividade elétrica a partir da despolarização espontânea e correntes sináticas é detectável usando imagens de cálcio ou matrizes multieletrínos. Este procedimento de replação pode ser adaptado a muitos tipos de aplicações.Além da triagem de alto conteúdo para identificar potenciais compostos terapêuticos, ele poderia ser usado para cones de crescimento de imagens ou gravações de matriz multieletrística. A dissociação mecânica de neurônios que já formaram processos longos é estressante. A incubação enzimática alongada e a titulação suave das células são passos essenciais para o sucesso deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

O vídeo demonstra um método para gerar neurônios corticais excitatórios a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Após a indução da doxiciclina, as hiPSCs superexpressam a neurogenina-2, um fator de transcrição neural-específico. Ao usar meios específicos e co-cultura com astrócitos, esse processo facilita a diferenciação dos hiPSCs em neurônios com conexões sinápticas.

Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em neurônios em matrizes de microeletrodos

O vídeo mostra um método para separar e replantar neurônios humanos pluripotentes derivados de células-tronco usando uma enzima proteolítica leve. Após filtração e centrifugação, os neurônios são recolocados em uma placa revestida de vários poços para incubação, promovendo a fixação e a maturação.

Replating de neurônios diferenciados derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Um protocolo personalizado é descrito para diferenciar células ES de camundongos em populações definidas de neurônios altamente puros exibindo sinapses funcionais e comportamento de rede emergente. A análise eletrofisiológica demonstra a perda da transmissão sináptica após a exposição aos sorotipos de neurotoxina botulínica / A- / G e neurotoxina tetânica.

Avaliação Funcional de neurotoxinas Biológica em Culturas em Rede de Células-Tronco derivadas do Sistema Nervoso Central Neurônios

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

O protocolo apresentado descreve um método para um ensaio de crescimento de neurite e avaliação neurotoxicidade de compostos de moléculas pequenas.

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Descrevemos a produção de culturas mistas de astrócitos e células precursoras oligodendrocytes derivadas de células-tronco neurais fetais ou adultas se diferenciando em oligodenrócitos maduros, e modelagem in vitro de estímulos nocivos. O acoplamento com uma técnica de triagem de alto conteúdo baseada em células constrói um sistema de triagem de drogas confiável e robusto.

Análise de diferenciação e maturação de rastreamento de alto conteúdo das culturas celulares precursoras do Oligodendrocyte, derivadas de células-tronco-tronco-tronco-de-alto teor

Aprenda a cultivar neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de neuritogênese e maturação sináptica. Este método otimiza a viabilidade celular e permite estudos funcionais detalhados.

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse (Vídeo) | JoVE Journal

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