Human células estaminais pluripotentes Baseado Developmental Toxicity Ensaios para Química Triagem e Safety Systems Biology Data Generation

O objetivo geral deste procedimento é descrever dois sistemas de teste de toxicidade no desenvolvimento in vitro baseados em células-tronco embrionárias humanas e estudos de transcriptoma. Isso é feito primeiro cultivando células-tronco embrionárias humanas em fibroblastos embrionários de camundongos. O segundo passo é permitir que as células-tronco embrionárias humanas formem corpos Embry nos quais possam gerar células de todas as três camadas germinativas ou diferenciá-las em progenitores neuroectodérmicos.

Em seguida, os corpos embrionários ou progenitores neuroectodérmicos são tratados com compostos de interesse em diferentes concentrações durante a diferenciação. As etapas finais são avaliar a viabilidade das células e isolar o RNA. Em última análise, a análise de microarray de transcriptoma é usada para mostrar as mudanças na expressão de RNA de células tratadas com um composto de interesse em comparação com células de controle não tratadas Com base em células-tronco neônicas humanas e macroáreas de DNA, estabelecemos uma metodologia in vitro que permite o monitoramento dos efeitos de toxicidade no desenvolvimento humano relevantes.

A metodologia pode ser aplicada pela indústria farmacêutica e química para triagem de segurança de medicamentos potenciais e tóxicos ambientais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da toxicidade do desenvolvimento, como o efeito de produtos químicos no neurodesenvolvimento inicial. Para começar, descongele o suplemento de meio de células-tronco em temperatura ambiente e adicione 100 mililitros dele em 400 mililitros do meio basal de células-tronco.

Em seguida, descongele a matriz da membrana basal no gelo e, em seguida, adicione o volume suplementado da matriz em 24 mililitros de dmm resfriado. F 12 meio basal conforme recomendado pelo fabricante, misture uma solução pipetando suavemente para cima e para baixo e, em seguida, adicione dois mililitros da mistura em 12 placas separadas de seis centímetros. Incube as placas em temperatura ambiente por uma hora enquanto a matriz reveste as placas.

Em seguida, remova o meio e adicione dois mililitros de meio de células-tronco. Em seguida, remova quatro placas confluentes da incubadora contendo embrionário humano. H nove células cultivadas em camadas alimentadoras de fibras embrionárias de camundongos que são preparadas conforme descrito no protocolo de acompanhamento sob um estereoscópio, use uma ponta de pipeta de um mililitro e remova as colônias diferenciadas da placa.

As colônias indiferenciadas têm bordas bem definidas e as células são compactas, enquanto as células diferenciadas começam a se propagar a partir das bordas e suas células são maiores em tamanho. Aspire o meio e lave as células com quatro mililitros de PBS. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de células-tronco com o oito de um estereoscópio.

Corte as colônias em seis a nove pedaços, cada um com uma agulha de calibre 26 e raspe os aglomerados com pontas de pipeta de um mililitro. Recolha delicadamente as colónias cortadas num tubo de falcão de 50 mililitros e pelete-as a 200 G durante cinco minutos. Em seguida, aspire o snat e ressuspenda as células em 12 mililitros de meio de células-tronco.

Coloque 20 microlitros da suspensão celular em uma lâmina de vidro e conte o número de aglomerados sob o microscópio. Ajuste a concentração da suspensão para 150 aglomerados por mililitro e, em seguida, adicione dois mililitros da suspensão em cada placa de seis centímetros. Mova as placas para frente e para trás e de um lado para o outro para distribuir as células uniformemente e, em seguida, incube as placas em uma incubadora de cultura de células a cada dois dias.

Troque cuidadosamente o meio Depois de remover as colônias diferenciadas, adicione 40 microlitros de uma solução estéril de copolímero em bloco a 5% a cada poço de uma placa de poço Vbo 96 e deixe incubar em temperatura ambiente por 45 minutos. Remova uma placa confluente contendo colônias da incubadora e escolha quaisquer colônias diferenciadas sob um microscópio estéreo com uma ponta de pipeta de um mililitro. Em seguida, aspire o meio da placa e lave suavemente as células com quatro mililitros de PBS.

Em seguida, adicione dois mililitros de meio de diferenciação aleatória a cada placa. Use a ferramenta de passagem para cortar as colônias de células H nove em aglomerados de tamanho uniforme. Raspe os aglomerados com um raspador de células e colete-os suavemente em uma centrífuga de tubo de falcão de 50 mililitros.

A colônia se aglomera a 200 G por cinco minutos e, em seguida, aspira o snat e ressuspende a célula e o meio de diferenciação aleatória a 1000 aglomerados por mililitro. Em seguida, aspire o copolímero em bloco da placa de 96 poços do fundo em V Com a ajuda de uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros da suspensão da colônia a cada poço agregue os aglomerados no fundo dos poços em forma de V centrifugando a placa a quatro graus Celsius por quatro minutos a 400 G. Em seguida, coloque uma placa na incubadora por quatro dias usando pontas de 200 microlitros de diâmetro mais largo. Remova os corpos embrionários da placa de 96 poços e coloque-os em uma placa quadrada estéril de 122 milímetros.

Em seguida, use uma pipeta sorológica estéril de 10 mililitros para transferir os corpos embrionários da placa quadrada para um tubo de falcão de 15 mililitros. Deixe os corpos embrionários assentarem por dois minutos e, em seguida, aspire o snat e lave os corpos embrionários com cinco mililitros de PBS. Novamente, espere que os corpos embrionários se assentem por dois minutos e, em seguida, aspire o sobrenadante.

Desta vez, ressuspenda os corpos embrionários em cinco mililitros de meio de diferenciação aleatória. Em seguida, transfira os corpos embrionários para uma placa bacteriológica de 10 centímetros e adicione mais 10 mililitros de diferenciação aleatória. Média. Incube as placas a 37 graus Celsius e 5%CO2 em um agitador horizontal.

A 50 RPMs, os corpos embrionários representativos são mostrados para o dia cinco, dia nove e dia 14. Troque cuidadosamente o meio a cada dois dias, substituindo todos os 15 mililitros por uma nova diferenciação aleatória. Média. Para avaliar o efeito de um medicamento na diferenciação, comece a adicionar o medicamento ao meio no quinto dia por 10 dias, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Usando uma pipeta estéril, colete os corpos embrionários das placas de 10 centímetros em um tubo de falcão de 15 mililitros. Deixe-os repousar por dois minutos e, em seguida, aspire o sobrenadante. Lave-os com cinco mililitros de PBS e transfira-os para um tubo de 1,5 mililitro sem nuclease.

Deixe-os se acomodarem e aspirarem o snat raise. Suspenda os corpos embrionários em um mililitro de reagente de triol e passe uma solução por uma agulha de calibre 24 com uma seringa de um mililitro aproximadamente 15 vezes para romper as células. Em seguida, adicione 200 microlitros de clorofórmio a cada amostra.

Vortex o conteúdo brevemente e, em seguida, centrifugue as amostras a 12.000 G por 15 minutos A quatro graus Celsius, colete o sobrenadante em tubos de 1,5 mililitro sem perturbar nenhuma das outras camadas. Em seguida, adicione um volume igual de etanol 70% resfriado ao sobrenadante e misture suavemente o conteúdo agitando. Transfira 700 microlitros da mistura para uma mini coluna de centrifugação e siga as instruções do fabricante para purificar o RNA na etapa final de eluição.

Aplicar 22 microlitros de água livre de nuclease na coluna de centrifugação e centrifugar os tubos a 12 000 G durante um minuto. Em seguida, remova o tubo de coleta e coloque o RNA no gelo. Adicionar um mililitro de espaço de disco pré-aquecido por balão confluente T 25 de células H nove e incubar o balão durante nove minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, adicione dois mililitros de pré-aquecimento. Lave o meio até as células tratadas deslocadas e pipete suavemente para cima e para baixo cinco vezes com uma pipeta de cinco mililitros. Transfira a solução celular para um tubo de falcão.

Em seguida, lave o frasco com nove mililitros de meio de lavagem e adicione-o ao tubo com as células. PT a colheita de suas células por três minutos e meio a 500 G.Em seguida, remova o snat e ressuspenda as células em 10 mililitros de meio de lavagem. PT as células novamente por três minutos e meio a 500 G e, em seguida, remova o estimulante e ressuspenda as células em quatro mililitros de meio de células-tronco embrionárias humanas, adicione 0,5 mililitros da suspensão celular e 4,5 mililitros de meio fresco em um frasco T 25 lavado com PBS fresco contendo fibroblastos embrionários de camundongo mitoticamente inativados.

Troque o meio no frasco todos os dias. Cubra um prato de 10 centímetros com 0,1% de gelatina em PBS e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, colha uma célula-tronco embrionária humana removendo o meio e adicione um mililitro de acuta ao frasco T 25 enquanto as células estão se desprendendo.

Adicione 6,6 mililitros de meio frio a 330 microlitros de matriz de membrana basal congelada. Filtre a solução através de um filtro de células de 40 micrômetros e use um mililitro da solução filtrada para cobrir cada poço de uma placa de seis poços. As células serão posteriormente plaqueadas nas placas revestidas após a incubação de 30 minutos das células embrionárias humanas com Accutane, interrompendo a reação adicionando 1,5 mililitros de meio Hess.

Raspe as células do frasco e adicione mais oito mililitros de meio Hess. Produzir uma solução de célula única pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 10 ml de células filtrantes através de um filtro de células de 40 micrómetros e, em seguida, centrifugar as células durante três minutos A 500 G, retirar o sobrenadante S e ressuspender as células em 10 mililitros de células de centrifugação média novamente durante três minutos a 500 G. Suspender as células em 10 mililitros de meio Hess S contendo o inibidor de rocha Y 2 7 6 3 2 a uma concentração final de 10 micromolares.

Em seguida, remova o sobrenadante da placa revestida de gelatina, a suspensão celular na placa revestida de gelatina e incube por exatamente uma hora a 37 graus Celsius. Durante essas etapas, o hipoplasto se instalará nas placas revestidas de gelatina, onde as células-tronco embrionárias humanas permanecerão livres. O tempo de flutuação é crucial, pois a incubação longa resultará na aglomeração das células-tronco e a incubação curta removerá apenas alguns desses fibroblastos quando os fibroblastos se fixarem.

Use o meio na placa para lavar suavemente as células-tronco não aderentes da placa. Lave a placa uma segunda vez com 10 mililitros de meio Hess e agrupe as células, centrifugue as células por três minutos a 500 G, remova o sobrenadante S resultante e ressuspenda as células em aproximadamente quatro mililitros de meio condicionado contendo 10 micromolares de inibidor de rocha Y 2, 7, 6, 3, 2 e 10 nanogramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos dois. Em seguida, misturou as células com azul trian e conte-as em uma placa de hemocitômetro.

18.000 células por centímetro quadrado na placa antes do porão. As placas revestidas com membrana cobrem as células com 1,5 mililitros de meio por poço e incubam a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, refresque o meio Após mais 24 horas, troque o meio por meio condicionado fresco suplementado com apenas 10 nanogramas por mililitro de fator de crescimento de fibroblastos 2 72 horas.

Depois de semear as células, mude o meio para o meio de reposição de soro knockout. Esse ponto de tempo é chamado de dia zero da diferenciação. Refresque as células com meio fresco todos os dias durante os próximos três dias.

Ao trocar o meio no quarto e quinto dias, adicione um composto de 25%N dois meios suplementados e 75% de reposição de soro knockout. Meio no sexto dia colher as células para análise. Os corpos embrionários podem ser usados para muitos estudos diferentes.

Aqui está um exemplo de estudo de citotoxicidade mostrando o efeito de concentrações variáveis de metilmercúrio na viabilidade das células. A partir deste gráfico, determinou-se que o ponto 24 micromolar causou 10% de morte celular e uma concentração de 1,61 micromolar causou 50% de morte celular após exposição por 14 dias. RNAs isolados de corpos embrionários de três grupos de tratamento com metilmercúrio foram executados em um microarray para observar uma ampla variedade de biomarcadores.

Aqueles expostos ao mercúrio micromolar do ponto 25 são mostrados em vermelho. Aqueles expostos a um metilmercúrio micromolar são mostrados em azul e o RNA de controle é mostrado em verde. Este mapa de análise de componentes principais mostra que as características genéticas de cada grupo de tratamento variam significativamente do outro em todos os mais de 276 genes foram modificados mais de duas vezes quando expostos a uma concentração micromolar de metilmercúrio.

30 desses genes também foram modificados pelo grupo de concentração mais baixa no ponto 25 micromolar. Neste mapa de calor, pode-se ver que 233 dos genes modificados no grupo de tratamento micromolar eram genes que foram regulados negativamente e apenas 43 foram regulados positivamente pelo tratamento. Não se esqueça de que trabalhar com triazol ou formigas de desenvolvimento pode ser extremamente perigoso e precauções como usar óculos de proteção, luvas de mão resistentes a produtos químicos e realizar todo o trabalho relacionado ao triol na capela de exaustão devem sempre ser consideradas durante a execução deste procedimento.

Seguindo este procedimento. Outros métodos, como coloração, formação de feros, que podem misturar a formação do tubo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como ancoragem fenotípica.