Estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um contexto para a análise da expressão gênica de maneira específica ao ciclo celular. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área do câncer relacionadas a eventos transcricionais dependentes do ciclo celular que subjazem à transformação maligna, bem como ao tratamento anticâncer. A principal vantagem deste protocolo é que ele estabelece com precisão padrões de expressão gênica específicos a cada fase do ciclo celular, tanto em duas condições distintas quanto após exposição à quimioterapia.

Células U2OS são utilizadas para este experimento e devem ser semeadas em placas de 100 milímetros na parte da noite por volta das 19h, para que os passos subsequentes possam ser realizados durante o horário de trabalho. Deixe as células aderirem incubando as placas a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada com 5%CO2 por 24 horas.

No dia seguinte, examine as células para confirmar que estão com 50% de confluência. Para o bloqueio com timidina, adicione 100 microlitros de um estoque recém-preparado de timidina 200 milimolar a cada placa de cultura de 100 milímetros. Incube as células com timidina a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada com 5% de CO2 por 20 horas.

No dia seguinte, por volta das 15h, libere as células do bloqueio com timidina removendo o meio de crescimento contendo timidina. Lave as células duas vezes com PBS 1X pré-aquecido.

Em seguida, adicione 10 mililitros de meio completo a cada placa de 100 milímetros. Incube as células a 37 graus Celsius por cinco horas. Para a parada celular mitótica, adicione nocodazol a uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro.

Incube as células com nocodazol por não mais de 10 a 11 horas. Na manhã seguinte, entre seis e sete horas da manhã, examine as células ao microscópio para confirmar que estão realmente bloqueadas na fase G2-M, indicado por sua aparência arredondada.

Desprenda as células mitóticas agitando cada placa e pipetando suavemente o meio de crescimento contendo nocodazol com as células desprendidas de cada placa de 100 milímetros. Combine as células mitóticas de todas as placas em um tubo estéril de 50 mililitros. Centrifugue a 300 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Lave as células duas vezes adicionando PBS 1X frio, seguido por centrifugação. Após a remoção do PBS da segunda lavagem, re-suspenda as células mitóticas em meio de cultura completo. Reserve dois mililitros para extração de RNA e dois mililitros para análise por FACS no ponto de tempo zero hora.

Replaque as células mitóticas remanescentes para pontos temporais subsequentes em placas de seis poços. Para iniciar este procedimento, semeie 0,25 vezes 10 à sexta potência de células U2OS por poço em placas de seis poços. Na tampa de cada placa de seis poços, escreva a condição experimental para cada poço.

Por exemplo, não tratadas ou tratadas com diferentes concentrações de fármaco e em diferentes pontos de tempo. Deixe as células aderirem incubando as placas de seis poços durante a noite. Na manhã seguinte, examine as células para confirmar que estão com 50% de confluência.

Remova o meio completo dos poços e adicione dois mililitros de meio DMEM-Glutamina livre de FBS, previamente aquecido, por poço. Incube as células por mais 24 horas. Para bloquear as células com hidroxiuréia, remova o meio dos poços e substitua por meio completo contendo hidroxiuréia recém-preparada a quatro micromolares.

Incube as células em meio contendo hidroxiuréia por 24 horas. Antes de liberar as células do bloqueio mediado por hidroxiuréia, verifique-as para confirmar que estão bloqueadas. Remova o meio contendo hidroxiuréia dos poços e lave os poços duas vezes com PBS 1X pré-aquecido.

Após remover o PBS da segunda lavagem, adicione dois mililitros de meio completo por poço. Mantenha as placas no incubador até a coleta das amostras. As amostras de ambos os protocolos de sincronização são coletadas da mesma forma para análise de FACS e para extração de RNA.

Para a análise por FACS, lave cada poço com dois mililitros de PBS 1X pré-aquecido e, em seguida, adicione 0,3 mililitros de solução de Tripsina-EDTA pré-aquecida para destacar as células. Após cinco minutos, inative a Tripsina-EDTA adicionando um mililitro de meio completo. Colete cada amostra em um tubo separado de 15 mililitros.

Centrifugue as células a 300 vezes G em temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte o sobrenadante, lave com PBS 1X e centrifugue novamente. Remova o PBS e conserve o pellet celular.

Para fixar as células, re-suspenda cada pellet celular em um mililitro de etanol a 70% gelado, agitando suavemente em vórtex. Coloque as células no gelo por aproximadamente 15 minutos antes da coloração com iodeto de propídio e análise por FACS. Para a extração de RNA, remova o meio e lave cada poço com dois mililitros de PBS 1X pré-aquecido.

Leve a placa para uma cabine de segurança e adicione um mililitro de reagente apropriado para isolamento de RNA por poço. Pipete para cima e para baixo para lisar as células e, em seguida, transfira cada lisado celular para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. Incube à temperatura ambiente por cinco minutos.

Inicie o procedimento de extração de RNA retirando do congelador os tubos de microcentrífuga com as amostras em reagente de isolamento de RNA e deixe-os descongelar à temperatura ambiente dentro de uma cabine de segurança para produtos químicos. Adicione 400 microlitros de clorofórmio a cada amostra e agite vigorosamente sem usar vortex até que a mistura fique completa. Incube as amostras à temperatura ambiente por cinco minutos.

Centrifugue os tubos por 15 minutos em uma microcentrífuga de bancada. Transfira a fase aquosa de cada amostra para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um volume de etanol a 100% lentamente, gota a gota, à fase aquosa, agitando durante a adição.

Não centrifugue. Transfira até 700 microlitros de cada amostra, incluindo qualquer precipitado que possa ter se formado, para uma coluna de centrifugação em um tubo de coleta de dois mililitros fornecido por um kit comercial de mini-preparo de RNA e feche a tampa. Centrifugue por 15 segundos.

Descarte o fluxo passante. Se iniciar com mais de 700 microlitros por amostra, transfira a amostra restante para a coluna de centrifugação e centrifugue novamente. Após a lavagem do RNA conforme as instruções do fabricante, elua cada amostra pipetando de 30 a 40 microlitros de água livre de nucleases para dentro da coluna de centrifugação e centrifugando à temperatura ambiente por um minuto.

Determine a concentração e a pureza do RNA das amostras por meio de medidas de absorbância. Armazene as amostras de RNA a menos 80 graus Celsius até o uso na análise de expressão gênica. O tratamento pelo protocolo Tididina-Nocodazol promove a parada das células U2OS na entrada da fase M e fornece uma população celular que progride de forma sincronizada pela fase G1 e para a fase S, conforme demonstrado pela análise de citometria de fluxo.

O tratamento pelo protocolo da hidroxiuréia retém as células no limite entre G1 e S. Após a liberação, as células transicionam de forma sincronizada pelas fases S e G2. O protocolo da timidina-nocodazol é o mais adequado para analisar os perfis de mRNA de genes com expressão máxima durante a fase G1.

Conforme demonstrado para a expressão de E2F1. Em contraste, o protocolo com hidroxiuréia funciona melhor para a análise de genes com expressão preferencial em S ou G2, conforme ilustrado para a expressão de E2F7. O ciclo celular é tipicamente perturbado por fármacos antitumorais; mostra-se aqui uma parada permanente na fase G2 induzida por mitomicina C em células sincronizadas com hidroxiuréia.

A sincronização celular ajuda a discriminar genes que respondem ao agente antitumoral daqueles afetados exclusivamente por perturbações do ciclo celular impostas pelo agente; por exemplo, a redução nos níveis de mRNA de E2F1 após tratamento com mitomicina C é provavelmente um efeito indireto da droga sobre a dinâmica do ciclo celular. Em contraste, o pico de expressão do mRNA de p21-Cip1 após tratamento com mitomicina C é resultado direto de um programa transcripcional ativado por essa droga. Após este procedimento, podem ser realizadas análises transcriptômicas e proteômicas em todo o genoma, com o objetivo de revelar alterações globais na expressão gênica que afetam fases específicas do ciclo celular.

Seja na condição dois ou após tratamentos antitumorais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão dos procedimentos necessários para realizar a análise de expressão gênica em culturas celulares sincronizadas. Não se esqueça de que o trabalho com iodeto de propídio ou reagentes de isolamento de RNA pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de luvas e de cabine de segurança para produtos químicos, devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.