Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um contexto para a análise da expressão gênica de uma maneira específica do ciclo celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer relacionadas a eventos transcricionais dependentes do ciclo celular subjacentes à transformação maligna, bem como ao tratamento anticâncer. A principal vantagem deste protocolo é que ele estabelece com precisão padrões de expressão gênica específicos da fase do ciclo celular, tanto nas condições número dois quanto após a exposição à quimioterapia.

As células U2OS são usadas para este experimento e devem ser semeadas em pratos de 100 milímetros à noite, por volta das sete da tarde, para que as etapas subsequentes possam ser realizadas durante o horário de trabalho. Deixe as células se ligarem incubando os pratos a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 por 24 horas.

No dia seguinte, examine as células para confirmar se estão em 50% de confluência. Para o bloco de timidina, adicione 100 microlitros de um caldo de timidina de 200 milimolares recém-preparado a cada placa de cultura de 100 milímetros. Incube as células com timidina a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 por 20 horas.

No dia seguinte, por volta das três da tarde, libere células do bloco de timidina removendo o meio de crescimento contendo timidina. Lave as células duas vezes com PBS 1X pré-aquecido.

Em seguida, adicione 10 mililitros de meio completo a cada prato de 100 milímetros. Incube células a 37 graus Celsius por cinco horas. Para a parada celular mitótica, adicione nocodazol a uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro.

Incubar as células com nocodazol por não mais de 10 a 11 horas. Na manhã seguinte, entre seis e sete da manhã, verifique as células ao microscópio para confirmar se elas estão realmente bloqueadas no G2-M, indicado por sua aparência arredondada.

Separe as células mitóticas agitando cada placa e pipetando suavemente o meio de crescimento contendo nocodazol com células destacadas de cada placa de 100 milímetros. Combine células mitóticas de todos os pratos em um tubo estéril de 50 mililitros. Centrifugue 300 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Lave as células duas vezes adicionando 1X PBS frio, seguido de centrifugação. Depois de remover o PBS da segunda lavagem, ressuspenda as células mitóticas em meio de cultura completo. Economize dois mililitros para extração de RNA e dois mililitros para análise FACS para o ponto de tempo de zero hora.

Recoloque as células mitóticas restantes para pontos de tempo subsequentes em placas de seis poços. Para iniciar este procedimento, semeie 0,25 vezes 10 para a sexta célula U2OS por poço em seis placas de poço. Na tampa de cada placa de seis poços, escreva a condição experimental para cada poço.

Por exemplo, não tratado ou tratado com diferentes concentrações de drogas e pontos de tempo. Deixe as células se ligarem incubando as placas de seis poços durante a noite. Na manhã seguinte, examine as células para confirmar se estão em 50% de confluência.

Remova o meio completo dos poços e adicione dois mililitros de meio DMEM-Glutamina pré-aquecido e livre de FBS por poço. Incube as células por mais 24 horas. Para prender as células com hidroxiureia, remova o meio dos poços e substitua por quatro hidroxiureia micromolar recém-preparada contendo meio completo.

Incubar as células em meio contendo hidroxiureia por 24 horas. Antes de liberar as células da parada mediada por hidroxiureia, verifique as células para confirmar se elas estão presas. Remova o meio contendo hidroxiureia dos poços e enxágue os poços duas vezes com PBS 1X pré-aquecido.

Depois de remover o PBS da segunda lavagem, adicione dois mililitros de meio completo por poço. Mantenha as placas na incubadora até a coleta da amostra. Amostras de ambos os protocolos de sincronização são coletadas da mesma maneira para análise FACS e para extração de RNA.

Para análise FACS, enxágue cada poço com dois mililitros de PBS 1X pré-aquecido e, em seguida, adicione 0,3 mililitros de solução pré-aquecida de tripsina-EDTA para separar as células. Após cinco minutos, inative a tripsina-EDTA adicionando um mililitro de meio completo. Coletar cada amostra em um tubo separado de 15 mililitros.

Centrifugar as células a 300 vezes G à temperatura ambiente durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante, lave com 1X PBS e gire novamente. Remova o PBS e guarde o pellet celular.

Para fixar as células, ressuspenda cada pellet celular em um mililitro de etanol 70% resfriado por vórtice suave. Coloque as células em gelo por aproximadamente 15 minutos antes da coloração com iodeto de propídio e análise FACS. Para extração de RNA, remova o meio e enxágue cada poço com dois mililitros de PBS 1X pré-aquecido.

Leve a placa para um armário de segurança e adicione um mililitro de reagente de isolamento de RNA adequado por poço. Pipet para cima e para baixo para pipetar e lisar as células e, em seguida, transferir cada lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Incube em temperatura ambiente por cinco minutos.

Inicie o procedimento de extração de RNA recuperando do freezer os tubos de microcentrífuga com amostras em reagente de isolamento de RNA e descongelando-os em temperatura ambiente dentro de uma cabine de segurança para produtos químicos. Adicione 400 microlitros de clorofórmio a cada amostra e agite vigorosamente sem vórtice até ficar completamente misturado. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante cinco minutos.

Centrifugue os tubos por 15 minutos em uma microcentrífuga de bancada. Transferir a fase aquosa de cada amostra para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 militer. Adicione um volume de etanol 100% lentamente, gota a gota, à fase aquosa durante a mistura.

Não centrifugue. Transfira até 700 microlitros de cada amostra, incluindo qualquer precipitado que possa ter se formado em uma coluna de rotação em um tubo de coleta de dois mililitros fornecido por um kit comercial de mini-preparação de RNA, e feche a tampa. Centrifugue por 15 segundos.

Descarte o fluxo. Se começar com mais de 700 microlitros por amostra, transfira a amostra restante para a coluna de centrifugação e centrifugue novamente. Depois de lavar o RNA de acordo com as instruções do fabricante, eluir cada amostra pipetando 30 a 40 microlitros de água livre de nuclease na coluna de centrifugação e centrifugando em temperatura ambiente por um minuto.

Determinar a concentração de RNA e a pureza das amostras por meio de medições de absorbância. Armazene as amostras de RNA a menos 80 graus Celsius até serem usadas para análise de expressão gênica. O tratamento pelo protocolo Timidina-Nocodazol interrompe as células U2OS na entrada da fase m e fornece uma população de células que progride de forma síncrona através de G1 e para a fase S, conforme mostrado pela análise de citometria de fluxo.

O tratamento pelo protocolo de hidroxiureia prende as células no limite G1 / S. Após a liberação, as células fazem a transição síncrona através das fases S e G2. O protocolo Timidina-Nocodazol é mais adequado para analisar perfis de mRNA de genes com expressão máxima durante a fase G1.

Como mostrado para a expressão E2F1. Por outro lado, o protocolo Hydroxyurea funciona melhor para a análise de genes com expressão preferencial em S ou G2, conforme ilustrado para a expressão de E2F7. O ciclo celular é tipicamente perturbado por drogas antitumorais, mostradas como uma parada permanente da fase G2 imposta pela mitomicina C em células sincronizadas com hidroxiureia.

A sincronização celular ajuda a discriminar genes que respondem ao agente antitumoral daqueles que são afetados exclusivamente por perturbações do ciclo celular impostas pelo agente, por exemplo, uma redução nos níveis de mRNA E2F1 após o tratamento com mitomicina C é provavelmente um efeito indireto da droga na dinâmica do ciclo celular. Por outro lado, o pico de expressão do mRNA p21-Cip1 após o tratamento com mitomicina C é diretamente o resultado de um programa transcricional desencadeado por essa droga. Após este procedimento, análises transcriptômicas e proteômicas de todo o genoma podem ser realizadas, a fim de desvendar as alterações globais da expressão gênica que afetam as fases específicas do ciclo celular.

Seja em condições número dois ou em tratamentos antitumorais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão dos procedimentos necessários para realizar a análise da expressão gênica em culturas de células sincronizadas. Não se esqueça de que trabalhar com iodeto de propídio ou reagentes de isolamento de RNA pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas e armário de segurança para produtos químicos devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.