Name: Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda dois protocolos de sincronização celular para analisar a expressão gênica em fases específicas do ciclo celular usando células U2OS. Este método auxilia pesquisadores no estudo de eventos transcricionais relacionados ao câncer.

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Agradecemos aos membros dos laboratórios Zubiaga e Altmeyer por discussões úteis e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por doações do Ministério espanhol (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), do governo basco (IT634-13 e KK-2015/89) e da Universidade do País Basco UPV / EHU ( UFI11 / 20).

1. Sincronização, liberação e monitoramento celular da progressão do ciclo celular <ol><li> Timidina e nocodazol (Thy-Noc) sincronização e liberação de células U2OS da mitose <ol><li> Prepare o meio de cultura celular necessário. As células U2OS são cultivadas rotineiramente em meio DMEM-Glutamina complementado com 10% (vol / vol) de FBS (opcional: 1% de penicilina / estreptomicina). Execute toda a preparação e manipulação do meio em condições estéreis e aquecer o meio complementado (a partir de agora referido como &quot;meio completo&quot;) a 37 ° C antes de usar. </li><li> Semente 2 x 10 6 células U2OS por placa de 100 mm em 10 mL de meio de cultura completo. Para calcular o número de pratos necessários, tenha em conta que cada prato de 100 mm geralmente fornece células mitóticas suficientes para re-colocar aproximadamente 5 poços de uma placa de 6 poços (0,2-0,25 x 10 6 células / poço) (ver Figura 1B ). Dois poços por ponto de tempo selecionado são requeridosEd no experimento (1 poço para extração de RNA e 1 poço para monitorização do ciclo celular). Além disso, um terceiro poço pode ser coletado por ponto de tempo para análise de proteínas. NOTA: células de placa à noite (cerca de 7 da noite) para que as etapas subsequentes possam ser realizadas durante o horário de trabalho nos dias seguintes. Inclua 2 poços adicionais de células de crescimento assíncrono para definir as configurações de compensação de análise FACS. </li><li> Deixe as células se juntarem incubando pratos de 100 mm a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 durante 24 h. </li><li> Para o bloqueio de timidina, preparar uma solução de reserva de timidina 200 mM dissolvendo 145,2 mg de pó de timidina em 3 mL de H 2 O (ou quantidades equivalentes) e esterilizar a solução por filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 μm. Um leve aquecimento pode ajudar a dissolver a timidina. Adicione 100 μL do estoque 200 mM recentemente preparado a cada prato de cultura de 100 mm (concentração final de 2 mM). Incubar células com timidina durante 20 h a 37ºC76; C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . NOTA: Tratar celas à noite (cerca de 7 horas), ter tempo para realizar a liberação de timidina e nocodazol no dia seguinte. </li><li> Para libertar do bloqueio de timidina, remova o meio de crescimento contendo timidina na tarde do dia seguinte (3 horas); Lavar as células duas vezes com 1x PBS pré-aquecido e adicionar 10 mL de meio completo a cada prato de 100 mm. Incubar células durante 5 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . </li><li> Para a prisão de células mitóticas, adicione nocodazol a uma concentração final de 50 ng / mL (8 horas). Prepare uma solução de reserva dissolvendo o pó de nocodazol em DMSO ( por exemplo, 5 mg / mL) e armazene congelado a -20 ° C. Incubar células com nocodazol por não mais de 10 a 11 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . </li><li> Liberação da prisão mediada por nocodazol na fase M inicial (mitotic shake-off) e coleta de amostras em várias vezes poiNts (a partir das 6-7 da manhã). <ol><li> Descarte as células arredondadas (mitóticas) agitando cada placa e pipetando suavemente o meio de crescimento contendo nocodazol. Colete o meio com células separadas de cada placa de 100 mm em tubos estéreis de 50 mL, centrifugue (300 xg, 5 min, temperatura ambiente (RT)) e lave duas vezes por adição de 1x PBS seguido por centrifugação. O uso de PBS frio ou PBS plus nocodazole é recomendado para evitar deslizamento mitótico (ver seção de Discussão). </li><li> Ressuspender as células mitóticas recolhidas de cada placa de 100 mm em 10 mL de meio completo. Economize 2 mL para extração de RNA e 2 mL para análise FACS para o ponto de tempo de 0 h (aproximadamente 0,2-0,25 x 10 6 células por amostra). </li><li> Replaca as células mitóticas restantes para pontos de tempo subsequentes em placas de 6 poços (2 mL / poço, 0,2-0,25 x 10 6 células / poço). NOTA: Lembre-se de que são necessários 2 poços por ponto de tempo selecionado (1 para RNA e 1 para análise FACS). </li></ol></li><li> Coletar amostras no selPontos de tempo. Todas as 1,5 a 3 h são recomendadas para obter um perfil adequado da progressão do ciclo celular. <ol><li> Para extração de RNA, remova o meio, enxague bem com 2 mL de pré-aquecimento 1x PBS e adicione 1 mL de reagente de isolamento de RNA adequado ( por exemplo, TRIzol) no poço (execute este último passo em um gabinete de segurança para produtos químicos). Pipetar para cima e para baixo para separar e lisar células, transferir lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, incubar 5 min na RT e armazenar o tubo a -80 ° C até o uso posterior. </li><li> Para a análise FACS, enxágue bem com 2 mL de pré-aquecimento 1x PBS, adicione solução de tripsina-EDTA pré-aquecida (0,3 mL / poço) para separar as células, bloqueie a tripsina-EDTA adicionando 1 mL de meio completo e colete cada amostra separadamente Tubo de 15 mL. <ol><li> Células de centrifugação (300 xg, 5 min, RT), salve o sedimento celular e descarta o sobrenadante. A fim de consertar células, ressuspenda as células em 1 mL de etanol refrigerado a 70% (v / v) em 1x PBS por tubos suavemente vórtex e coloque-os no gelo para o aplicativoCerca de 15 min antes de armazenar a 4 ° C ou a coloração para posterior análise por FACS (descrito nos passos 1.4 - 1.5). </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Sincronização baseada em HU e liberação de células U2OS do limite G1 / S <ol><li> Prepare o meio completo de cultura de células como descrito no passo 1.1. </li><li> Semente 0,25 x 10 6 células U2OS por poço em placas de 6 poços (2 mL de meio de cultura completo por poço). Para calcular o número de poços necessários para o experimento, tenha em conta que serão necessários 2 poços por ponto de tempo selecionado (1 poço para extração de RNA e 1 poço para monitoração do ciclo celular) e que 2 poços adicionais de células de crescimento assíncrono são Precisava definir as configurações de compensação de análise FACS. </li><li> As células se ligam por incubação de placas de 6 poços durante a noite (O / N) a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . </li><li> Remova o meio completo dos poços na manhã seguinte e adicione 2 mLDe meio DMEM-Glutamina pré-aquecido sem FBS por poço. Incubar células durante mais 24 h a 37 ° C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . NOTA: Execute esta etapa em todos os poços, exceto para 2 (aqueles salvos para definir configurações FACS). O passo de retirada de soro pode ser omitido se a sincronização eficiente for conseguida simplesmente incubando células com HU. </li><li> Parada do ciclo celular G1 / S com HU. <ol><li> Prepare uma solução de reserva fresca de HU (500 mM) antes de cada uso. Adicione 2 mL de H 2 O a 76,06 mg de pó de HU e misture até dissolver completamente. Esterilize a solução por filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,2 μm. Misture 50 mL de meio completo com 400 μL de solução de reserva de HU esterilizada por filtro para uma concentração final de HU de 4 mM. </li><li> Remova o meio de todos os poços, exceto dos 2 poços necessários para a definição das configurações de FACS e substitua-os por um meio completo contendo 2 mM de HU preparado recentemente (2 mL / poço). </li><li> Incube células por 24 h emMeio contendo HU a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Liberação de células da prisão mediada por HU. Remova o meio contendo HU dos poços e enxágue os poços duas vezes com 1x PBS pré-aquecido (2 mL a cada vez). Adicione 2 mL de meio completo por poço. Coletar 2 amostras para o ponto de tempo de 0 h (1 para extração de RNA e 1 para verificação de parada de ciclo celular por FACS), bem como 2 amostras salvas para configurações de FACS. Coloque os poços remanescentes na incubadora. </li><li> Coletar amostras a cada 1,5 a 3 h para obter uma distribuição adequada da progressão do ciclo celular. Em cada ponto de tempo, execute um processamento de amostra (para extração de RNA e análise FACS) conforme descrito em 1.1.8.1-1.1.8.2. </li></ol></li><li> Tratamento com agentes prejudiciais ao DNA NOTA: Sempre que o objetivo é elucidar o efeito de um composto ( por exemplo , agentes prejudiciais ao DNA) nos eventos do ciclo celular, qualquer um dos métodos de sincronização descritos anteriormente pode serCombinado com o tratamento de células com o agente genotóxico. Para selecionar o método de sincronização, é importante considerar a fase do ciclo celular que gostaríamos de analisar. Em geral, o procedimento de Thy-Noc pode ser adequado para estudar o efeito de um composto em fase G1 ou entrada de fase S, enquanto a sincronização mediada por HU pode ser mais adequada para estudar o impacto nas fases S a G2 ou na entrada na mitose. <ol><li> Análise do efeito de agentes genotóxicos na fase G1 ou na entrada da fase S <ol><li> Sincronize células como descrito em 1.1.2. Para 1.1.6. </li><li> Libere as células do nocodazol e re-placa-as como descrito em 1.1.7. Incubar a 37 ° C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO 2 por 3 h para permitir que eles se apeguem antes do agente de adição (o período de incubação requerido pode variar de acordo com a linha celular). </li><li> Adicione agente e colete amostras como descrito anteriormente em 1.1.8. </li></ol></li><li> Análise do efeito de agentes genotóxicos em SG2 fases ou M entrada <ol><li> Sincronize as células conforme descrito em 1.2.2. Para 1.2.5. </li><li> Libere células da HU conforme descrito em 1.2.6. E adicione imediatamente agente. </li><li> Coletar amostras como descrito anteriormente em 1.8. </li></ol></li></ol></li><li> Monitoramento da sincronização celular e progressão através do ciclo celular por coloração com iodeto de propídio (PI) e análise FACS NOTA: As amostras coletadas em todos os pontos de tempo juntamente com as necessárias para definir as configurações FACS podem ser armazenadas a 4 ° C uma vez que foram corrigidas (conforme mencionado em 1.1.8.2). Execute manchas com solução PI seguida de análise FACS para todas as amostras da experiência simultaneamente. O PI intercala no sulco principal do DNA de cadeia dupla produzindo um sinal altamente fluorescente quando excitado a 535 nm com um amplo pico de emissão em torno de 600 nm. Como o PI também pode se ligar ao ARN de cadeia dupla, é necessário tratar as células com RNase para uma resolução de DNA ideal. <ol><li> Prepare uma solução de coloração com fraco fraco. Uma solução de reserva de PI pode ser preparada por dissolução de pó PI em PBS ( por exemplo, 5 mg / mL). Armazene a solução de reserva a 4 ° C (na escuridão). A solução de coloração é composta por PI (140 μM), citrato de sódio (38 mM) e Triton X-100 (0,01% v / v). </li><li> Aquecer uma superfície apropriada ( por exemplo, forno) a 37 ° C. </li><li> Centrifugar células fixas (450 xg, 5 min, RT), decantar o sobrenadante (etanol) e lavar uma vez com 1x PBS. </li><li> Centrifugar as células novamente, remover PBS e adicionar 300 μL de solução de coloração PI por amostra (exceto para uma das amostras para configurações FACS, adicionar PBS a esta amostra). </li><li> Transferir células para Tubos FACS (5 mL de tubos de poliestireno de fundo redondo). </li><li> Adicione 1 μL de RNase A a cada amostra, misture e incuba as amostras durante 30 min na escuridão a 37 ° C. As amostras podem ser armazenadas protegidas da luz a 4 ° C por um período máximo de 2 a 3 dias. </li><li> Analisar o conteúdo de DNA em amostras por fluxoCitometria. Defina as configurações de compensação de análise FACS com amostra assíncrona manchada com PI. Use amostra em branco (sem solução de coloração PI) para verificar a autofluorescência. Os conceitos básicos da análise mediada por picoterapia de DNA do conteúdo de DNA por citometria de fluxo foram descritos anteriormente 9 . </li></ol></li><li> Determinação do índice mitótico por coloração fosfo-H3 (Ser 10) / PI NOTA: As células que sofrem mitosis podem ser facilmente detectadas por citometria de fluxo com anticorpos específicos para fosfo-histona H3 em Serina 10 (pH3). Uma coloração concomitante de PI é útil para determinar a distribuição baseada em conteúdo de DNA da população de células. São necessárias 5 amostras para as configurações ótimas das configurações de FACS: em branco, somente para PI, apenas para pH3, anticorpo secundário e colorações duplas. <ol><li> Centrifugar células fixas (450 xg, 5 min, 4 ° C) e descartar o sobrenadante. As seguintes etapas são descritas para realizar a coloração em tubos de 15 mL. </li><li> Lavar as células adicionando 1ML de PBS-T (PBS + 0,05% de Tween-20) ao sedimento e centrífuga (450 xg, 5 min, 4 ° C). Retire o sobrenadante. </li><li> Adicionar anticorpo anti-pH3 diluído (1: 500) em 100-200 μL de PBS-T + 3% BSA e incubar com balanço durante 2 h à TA (ou O / N a 4 ° C). </li><li> Adicione 2 mL de PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) e centrifugação (450 xg, 5 min, 4 ° C). Retire o sobrenadante. </li><li> Lave mais uma vez adicionando 2 mL de PBS-T ao sedimento, centrifugando e descarte o sobrenadante. </li><li> Adicionar anticorpo secundário (AlexaFluor 488 anti-coelho no caso do anticorpo pH3 selecionado) diluído (1: 500) em 100-200 μL de PBS-T + 3% de BSA e incubar com balanço durante 1 h à TA (ou O / N A 4 ° C). Proteja as amostras da luz. </li><li> Lavar duas vezes com PBS-T (2 mL) por centrifugação como descrito no passo 1.5.4. </li><li> Execute a coloração PI como descrito (passos 1.4.1 a 1.4.6). </li></ol></li></ol> 2. Recolha e Processo de Amostras para Análise de Expressão Genética <ol><li> Levar1,5 mL de amostras de microcentrífuga no reagente de isolamento de ARN do congelador e deixá-los descongelar à temperatura ambiente dentro de um armário de segurança para produtos químicos. </li><li> Adicione 400 μL de clorofórmio a cada amostra e agite vigorosamente (mas não vortex) até completar a mistura. Incubar amostras por 5 min à TA. </li><li> Centrifugação de tubos por 15 min (≥8,000 xg, 4 ° C) em uma microcentrífuga de bancada. </li><li> Transfira a fase aquosa (superior) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e registre o volume transferido (para simplificar o procedimento, recomenda-se coletar volumes iguais em todas as amostras da experiência). </li><li> Adicione 1 volume de etanol 100% lentamente (gota a gota) à fase aquosa enquanto se mistura. Não centrifugue. </li><li> Execute os próximos passos com o kit de preparação de RNA mini comercial. Pipetar até 700 μL de cada amostra, incluindo qualquer precipitado que tenha se formado, em uma coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mL (fornecido pelo fabricante). </li><li> Feche oTampa e centrífuga (≥ 8,000 g, RT) por 15 s. Descarte o fluxo contínuo. Repita a etapa anterior com a amostra restante (se houver). </li><li> Siga as instruções dos fabricantes para a lavagem e eluição do ARN (eluir cada amostra em 30 a 40 μl de H 2 O isento de nuclease para obter uma concentração apropriada de ARN para o próximo passo). </li><li> Determine a concentração de ARN e a pureza das amostras por medidas de absorvência (uma razão de 260/280 de 2,0-2,1 indica boa pureza da amostra de ARN). Armazene amostras de ARN a -80 ° C até uso para análise de RT-qPCR. </li><li> Para a conversão de ARN em cDNA e subsequente PCR quantitativa, tome 1 μg de RNA por amostra e prepare a reação retrotranscriptase de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de cDNA obtidas podem ser armazenadas a 4 ° C (por alguns dias) ou a -20 ° C (por períodos de tempo mais longos). NOTA: A preparação de amostras, o design do primer e outras considerações para PCR em tempo real foram exDetalhadamente descrito na literatura 22 , 23 . </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A análise de genes regulados por ajuste fino envolvidos em papéis temporários e temporários no ciclo celular requer uma população celular uniforme. Muitos pesquisadores usam rotineiramente linhas de células tumorais estabelecidas há muito tempo para esses propósitos e uma variedade de métodos foram desenvolvidos para obter populações celulares síncronas (ou parcialmente síncronas), com o objetivo de acumular o maior número possível de células em fases definidas do ciclo celular. Além disso, esforços intensos foram reali...

A transição através de todas as fases do ciclo celular é acoplada a um programa de expressão de genes bem regulado. Este coordenado &quot;ligado e desligado&quot; da transcrição de genes ao longo do ciclo celular acredita estar sob o controle de sistemas regulatórios transcricionais complexos, regulando não apenas o tempo, mas também os níveis de expressão gênica. É sabido que a desregulamentação dos principais componentes do ciclo celular contribui para o desenvolvimento de várias doenças e é uma marca bem estabelecida da tumorigênese 1 , 2 . As análises transcriptômicas do genoma realizadas em células de leveduras e mamíferos revelaram que um grande número de genes exibem padrões periódicos de expressão gênica no ciclo celular, sugerindo que a flutuação da transcrição durante o ciclo celular é um reflexo do requisito temporal de um determinado produto de gene Em uma fase precisa 3 , 4 , </suP&gt; 5 . Uma tarefa importante no estudo da expressão de genes regulados pelo ciclo celular é a sincronização de células em fases específicas do ciclo celular. A sincronização celular ajuda a interpretar a associação de um padrão de expressão genética a uma transição de fase específica do ciclo celular e levou a uma melhor compreensão da regulação e função de vários genes. A sincronização celular também é importante para estudar o mecanismo de ação de fármacos anticancerígenos, já que os agentes quimioterapêuticos afetam tanto a expressão gênica como a cinética do ciclo celular 6 , 7 . No entanto, muitas vezes é difícil determinar se as diferenças de expressão gênica resultantes do tratamento com esses agentes são uma resposta direta ao tratamento ou são apenas a conseqüência de mudanças nos perfis do ciclo celular. Para distinguir entre essas possibilidades, a expressão gênica deve ser analisada em células que foram sE sincronizado antes da adição do medicamento quimioterapêutico. Com a exceção de algumas células primárias, como células linfóides recém-isoladas - que constituem uma população de células homogêneas sincronizadas em G0 8 -, as linhas celulares estabelecidas in vitro crescem de forma assíncrona em cultura. Sob condições de crescimento regulares, essas células de ciclagem assíncrona são encontradas em todas as fases do ciclo celular, mas preferencialmente em G1 9 . Portanto, esse contexto não fornece um cenário ótimo para análises de expressão funcional ou genética em uma fase específica do ciclo celular ( por exemplo , G1, S, etc.). As linhas celulares imortalizadas não transformadas ( por exemplo, fibroblastos) podem ser sincronizadas com os chamados métodos fisiológicos 10 . Esses métodos são baseados nos recursos de células primárias retidos das células não transformadas, como a inibição do contato celular e a dependência do fator de crescimento para continuar a andar de bicicleta. RemoçãoDe soro em combinação com inibição de contato torna as células não transformadas presas em G0 / G1. No entanto, a entrada e progressão sincronizada do ciclo celular muitas vezes requer subcultura, o que também envolve o desprendimento artificial das células e re-chapeamento 10 . Mais importante ainda, este método não é adequado para a sincronização de linhas celulares transformadas, a grande maioria das linhas celulares estabelecidas atualmente em uso, caracterizada por falta de inibição do crescimento mediada por contato celular ou resposta à retirada do fator de crescimento. Assim, é claro que são necessários métodos alternativos para a sincronização celular eficiente em fases específicas do ciclo celular. Em termos gerais, os métodos de sincronização mais utilizados são baseados em inibição química ou farmacológica transitória de um ponto definido do ciclo celular, tipicamente síntese de DNA ou formação de fuso mitótico. A inibição da síntese do DNA sincroniza as células prendendo-as no final da fase G1 ou inicial S. Isso pode ser achiEvitado pela adição de compostos como a mimosina, um inibidor da biossíntese de nucleótidos 11 , 12 , a afidicolina, um inibidor das polimerases de ADN 13 , 14 , a hidroxiureia, um inibidor da ribonucleótido redutase 15 , 16 ou por quantidades excessivas de timidina 17 , 18 . Por outro lado, os inibidores da polimerização de microtúbulos, como a colchicina ou o nocodazol, são capazes de bloquear a formação de fuso mitótico, levando à sincronização celular no início da fase M 19 , 20 , 21 . Neste trabalho descrevemos um método envolvendo dois protocolos de sincronização complementares baseados na inibição química transitória para estudar a expressão de genes regulados pelo ciclo celular no mRNAnível. Este método é fundamental para definir o papel dos genes do ciclo celular em processos específicos do ciclo celular. Além disso, fornece um quadro geral para estudar o impacto de tratamentos anticancerígenos, a fim de detectar com precisão os genes sensíveis a drogas e minimizar as interpretações erradas derivadas de perturbações na progressão do ciclo celular gerada por esses medicamentos.

<table><tbody><tr><td>DMEM, glicose alta, suplemento GutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965-059</td><td></td></tr><tr><td>FBS, qualificado, aprovado pela UE, origem da América do Sul</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Timidina</td><td>SIGMA</td><td>T1895-5G</td><td>Recém-preparado. Um leve aquecimento pode ajudar a dissolver a timidina.</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>SIGMA</td><td>M-1404 Solução-mãe</td><td>em DMSO armazenado a -20 &ordm; C em pequenas alíquotas</td></tr><tr><td>Hidroxiureia</td><td>SIGMA</td><td>H8627</td><td>Mitomicina C recém-preparada</td></tr><tr><td>de Streptomyces caespitosus</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>1,5 mM solução estoque em H2O estéril protegida da luz e armazenada a 4 &�; C</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>SIGMA</td><td>P4170</td><td>Solução-mãe em PBS estéril a 5 mg/ml, conservada a 4 &quotm; C protegido da luz.</td></tr><tr><td>PBS pH 7,6</td><td></td><td></td><td>Etanol caseiro</td></tr><tr><td></td><td>PANREAC</td><td>A3678,2500</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>SIGMA</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>PANREAC</td><td>131655</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>LifeTechnologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ciclina E1 anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>4129</td><td>Diluição 1:1000 em 5% de leite, o/n, 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Anti-Ciclina B1 anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>4135</td><td>Diluição de 1:1000 em 5% de leite, o/n, 4 & C</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actina</td><td>SIGMA</td><td>A-5441</td><td>diluição 1:3000 em leite a 5%, 1 hora, RT</td></tr><tr><td>Anti-pH3 (Ser 10) antiboty</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Especificado no protocolo</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>R37116</td><td>Especificado no protocolo</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-camundongo-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3697</td><td>Diluição 1:3000 em 5% de leite, 1 hora, anticorpo RT</td></tr><tr><td>Forward E2F1 (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TGACATCACCAACGTCCTTGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticorpo E2F1 reverso (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; CTGTGCGAGGTCCTGGGTC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticorpo Forward E2F7 (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; GGAAAGGCAACAGCAAACTCT</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticorpo E2F7 reverso (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TGGGAGAGCACCAAGAGAGAGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward p21Cip1 antibody (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse p21Cip1 antibody (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Gene de referência do anticorpo TBP (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticorpo TBP reverso (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Gene de referência do anticorpo Oxa1L (humano) Forward&nbsp; &nbsp; CACTTGCCAGAGATCCAGAAG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse Oxa1L &nbsp; anticorpo (humano)&nbsp; &nbsp; &nbsp; CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Projetado pela ferramenta PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Power SYBRGreen PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368702</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS&nbsp;</td>Placa de reação óptica de 96 <td>poços Sarstedt</td><td>551578</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm TC-Treated Culture Plate</td><td>Corning Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Costar placas de cultura de células 6 poços</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada refrigerada Jouan CR3.12</td><td>Jouan</td><td>743205604</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Citômetro de fluxo</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Sistema de PCR em tempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A28567</td><td></td></tr></tbody></table>

estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

O programa de expressão gênica do ciclo celular representa um passo crítico para a compreensão dos processos dependentes do ciclo celular e seu papel em doenças como o câncer. A análise de expressão de genes regulada pelo ciclo celular depende da sincronização celular em fases específicas. Aqui descrevemos um método que utiliza dois protocolos de sincronização complementares que é comumente usado para estudar a variação periódica da expressão gênica durante o ciclo celular. Ambos os procedimentos são baseados no bloqueio transitório do ciclo celular em um ponto definido. O protocolo de sincronização pelo tratamento com hidroxiureia (HU) leva à prisão celular na fase final G1 / início da S e a liberação da prisão mediada por HU fornece uma população celular progredindo uniformemente através de S e G2 / M. O protocolo de sincronização pelo tratamento com timidina e nocodazol (Thy-Noc) bloqueia as células na mitosis precoce e a liberação da prisão mediada por Thy-Noc fornece uma população celular sincronizada adequada para a fase G1 e a fase S-enTente estudos. A aplicação de ambos os procedimentos requer o monitoramento dos perfis de distribuição do ciclo celular, que normalmente é realizado após a coloração do iodeto de propídio (PI) das células e a análise mediada por citometria de fluxo do conteúdo de DNA. Mostramos que o uso combinado de dois protocolos de sincronização é uma abordagem robusta para determinar claramente os perfis transcricionais de genes que são diferencialmente regulados no ciclo celular ( ie E2F1 e E2F7) e, conseqüentemente, ter uma melhor compreensão de seu papel no ciclo celular Processos. Além disso, mostramos que essa abordagem é útil para o estudo de mecanismos subjacentes a terapias baseadas em drogas ( ou seja, mitomicina C, um agente anticancerígeno), porque permite discriminar genes que respondem ao agente genotóxico daqueles que são exclusivamente afetados por perturbações do ciclo celular Imposto pelo agente.

Representação esquemática dos protocolos Thy-Noc e HU para sincronização celular. A Figura 1 resume as etapas necessárias para a sincronização de células U2OS e posterior coleta de amostras, a fim de verificar a progressão através do ciclo celular e realizar análises de expressão gênica. A coloração de Phospho-H3 e PI são bons parâmetros de avaliação para...

Relatamos dois protocolos de sincronização de células que fornecem um contexto para estudar eventos relacionados a fases específicas do ciclo celular. Mostramos que essa abordagem é útil para analisar a regulação de genes específicos em um ciclo celular não perturbado ou após a exposição a agentes que afetam o ciclo celular.

Estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um contexto para a análise da expressão gênica de maneira específica ao ciclo celular. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área do câncer relacionadas a eventos transcricionais dependentes do ciclo celular que subjazem à transformação maligna, bem como ao tratamento anticâncer. A principal vantagem deste protocolo é que ele estabelece com precisão padrões de expressão gênica específicos a cada fase do ciclo celular, tanto em duas condições distintas quanto após exposição à quimioterapia.Células U2OS são utilizadas para este experimento e devem ser semeadas em placas de 100 milímetros na parte da noite por volta das 19h, para que os passos subsequentes possam ser realizados durante o horário de trabalho. Deixe as células aderirem incubando as placas a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada com 5%CO2 por 24 horas.No dia seguinte, examine as células para confirmar que estão com 50% de confluência. Para o bloqueio com timidina, adicione 100 microlitros de um estoque recém-preparado de timidina 200 milimolar a cada placa de cultura de 100 milímetros. Incube as células com timidina a 37 graus Celsius em atmosfera umi

studying-cell-cycle-regulated-gene-expression-two-complementary-cell

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

A sincronização das células bacterianas é essencial para estudos do ciclo e desenvolvimento celular bacteriano.  Caulobacter crescentus é sincronizável através de centrifugação por densidade, permitindo uma ferramenta rápida e poderosa para estudos do ciclo celular bacteriano.  Aqui fornecemos um protocolo detalhado para a sincronização de células de Caulobacter.

Sincronização de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Para Investigação do Ciclo Celular Bacteriana

Este protocolo descreve o uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir a absorção de seguimento temporais de células que estavam na fase S de um determinado ponto no tempo. A adição de corantes de ADN e rotulagem anticorpo facilita a análise detalhada do destino das células em fase S em momentos posteriores.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Este protocolo descreve um método não invasivo para identificar eficientemente células da fase S para estudos de microscopia a jusante, como medir o recrutamento de proteínas de reparação de DNA por micro-irradiação a laser.

Micro-irradiação a laser para estudar recrutamento de DNA durante a fase S

Um desafio de analisar experimentos sincronizados de séries temporais é que os experimentos geralmente diferem na duração da recuperação da sincronia e no período do ciclo celular. Assim, as medidas de diferentes experimentos não podem ser analisadas de forma agregada ou facilmente comparadas. Aqui, descrevemos um método para alinhar experimentos para permitir comparações específicas de fase.

Alinhamento de dados sincronizados de séries temporais usando o modelo de caracterização de perda de sincronia do ciclo celular para comparações entre experimentos

O protocolo a seguir apresenta a detecção de focos de DNA de fita simples na fase G1 do ciclo celular utilizando sincronização do ciclo celular seguida de coloração por imunofluorescência RPA2.

Visualizando focos de DNA de fita simples na fase G1 do ciclo celular

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aqui, descrevemos as configurações para monitorar em paralelo a bioluminescência circadiana e a atividade secretora das células das ilhotas humanas e miotubos primários. Para isso, empregamos a entrega do gene lentiviral de um repórter de relógio central de luciferase, seguido de sincronização in vitro e coleta de meio de saída por perifusão celular contínua.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Aprenda dois protocolos de sincronização celular para analisar a expressão gênica em fases específicas do ciclo celular usando células U2OS. Este método auxilia pesquisadores no estudo de eventos transcricionais relacionados ao câncer.

Estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células

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