Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

O objetivo geral deste procedimento é usar sincronização dupla de timidina e microscopia confocal de alta resolução para estudar os papéis mitóticos de proteínas multifuncionais que podem possuir funções críticas de interfase. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, sobre como delinear as funções normais das proteínas envolvidas no ciclo celular e na mitose. As principais vantagens desta técnica são que, as células podem manter seu comportamento fisiológico normal e que este método também é muito fácil de executar.

Demonstrando este procedimento estará o Dr. Mohammed Amin, um pós-doutorando do meu laboratório, que é especialista no uso deste método. Para imagens de células fixas da progressão celular mitótica, comece semeando aproximadamente duas vezes 10 para a quinta célula HeLa em cada poço de uma placa de seis poços, contendo uma lamínula esterilizada com 70% de etanol e UV e dois mililitros de meio DMEM. Após 24 horas em uma incubadora de cultura de células, bloqueie as células com dois mililitros de timidina recém-diluída e meio fresco por poço e retorne a placa à incubadora por mais 18 horas.

No dia seguinte, lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS e uma vez com meio fresco de 37 graus Celsius. Retorne as células à incubadora por nove horas para liberá-las do bloco, seguido pela adição de mais dois mililitros de meio suplementado com timidina por poço. Após a segunda incubação de bloqueio, lave as células duas vezes com dois mililitros de PBS e uma vez com dois mililitros de meio fresco a 37 graus Celsius e adicione 100 nanomolares de siRNA recém-preparado aos poços apropriados.

Após nove a 10 horas, aspire o sobrenadante e fixe as células nas lamínulas com paraformaldeído a quatro por cento por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS, permeabilize as células fixas com 0,5% de detergente por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de duas lavagens de cinco minutos em PBS. Bloqueie as células com um por cento de BSA em PBS por uma hora em temperatura ambiente.

Em seguida, rotule as células com 50 microlitros dos anticorpos primários de interesse por uma hora a 37 graus Celsius. No final da incubação, lave as células três vezes em PBS e marque-as com 50 microlitros dos anticorpos secundários apropriados de interesse. Após uma hora em temperatura ambiente, lave as células duas vezes em PBS por cinco minutos a cada lavagem e rotule as células com DAPI por cinco minutos em temperatura ambiente.

Siga a coloração DAPI com duas lavagens de cinco minutos em PBS e use o meio de montagem apropriado para montar as lamínulas em lâminas de microscópio transparentes individuais. Em seguida, usando objetivas de imersão em óleo DIC apocromáticas de plano de abertura numérica de 60 ou 100 X 1,4 montadas em um microscópio confocal invertido de alta resolução equipado com uma câmera apropriada, adquira imagens das proteínas imunomarcadas em pilhas Z de 0,2 micrômetro de espessura. Para imagens de células vivas da progressão de células mitóticas, semeie aproximadamente 0,5 a uma vezes 10 para as quintas células HeLa expressando de forma estável mCherry H2B e GFP alfa-tubulina em placas de fundo de vidro de 35 mililitros contendo 1,5 mililitros de meio DMEM.

Cultive as células em uma incubadora de cultura de células por 24 horas. Em seguida, a timidina bloqueia as células duas vezes, como acabamos de demonstrar, desta vez lavando as células duas vezes com dois mililitros de PBS e uma vez com um mililitro de meio DMEM pré-aquecido no final de cada bloco de timidina e tratando as células com siRNA após o primeiro bloqueio durante a primeira lavagem da timidina. Cultive as células em meio de Leibovitz pré-aquecido fresco, suplementado com 10% de FBS e 20 HEPES milimolares por oito horas para liberar as células do segundo bloco.

Em seguida, coloque a primeira placa na câmara com temperatura controlada de um microscópio confocal de alta resolução e use a objetiva de 60 X e a imagem de campo brilhante para colocar as células em foco. Quando as células estiverem visíveis, ajuste manualmente a posição da placa para a região de escolha e use o software de aquisição de imagem para definir a potência e a exposição do laser, os parâmetros de aquisição de imagem e o período de duração do experimento. Selecione os filtros GFP e mCherry apropriados e adquira imagens de luz transmitida pulsada e fluorescência a cada 10 minutos por até 16 horas, para obter imagens de lapso de tempo do processo de mitose.

Nove horas após a liberação do bloqueio duplo de timidina, adquira as imagens em 12 planos z separados por um micrômetro. Em seguida, analise as imagens rastreando células mitóticas individuais e use o software de origem apropriado para montar um filme correspondente. Embora a maioria das células de controle e Cdt1 siRNA esteja no estágio de metáfase nove horas após a liberação do bloqueio duplo de timidina, a fixação em 10 horas revela que a maioria das células tratadas com Cdt1 siRNA ainda são presas na prometáfase tardia, enquanto as células de controle entram na anáfase e segregam seus cromossomos conforme o esperado.

O tratamento a frio nove horas após a liberação do bloqueio duplo da timidina facilita a retenção de microtúbulos de cinetócoro estáveis, que são relativamente menos robustos em células depletadas de Cdt1 em comparação com aquelas dentro de células depletadas de controle. O licenciamento da origem da replicação do DNA não é perturbado em células depletadas de Cdt1 ou controle durante a fase G2-M, pois essas células não induziram o acúmulo de gama fosforalizado H2AX, um marcador de dano ao DNA, durante a fase G2 subsequente. A transfecção de Cdt1 siRNA de culturas assíncronas, no entanto, induz o acúmulo de focos positivos de fosfogama H2AX, possivelmente devido ao dano ao DNA induzido pelo licenciamento inadequado da replicação do DNA.

Após a quebra do envelope nuclear, as células normais entram na mitose e sofrem início de anáfase para sair da mitose em cerca de 30 a 60 minutos. O knockdown mediado por RNAi de Hec1, uma proteína chave do cinetocoro necessária para a formação robusta de ligação dos microtúbulos do cinetócoro, no entanto, atrasa a progressão mitótica normal para o início da anáfase ou saída da mitose, mesmo após várias horas de atraso na mitose. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em três a quatro dias se for executada corretamente.

Ao tentar o procedimento, é importante lembrar de dissolver completamente a timidina depois de descongelá-la do freezer. Após este procedimento, outros métodos como western blotting podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como: quais são os padrões de expressão de proteínas de interesse durante a mitose em comparação com a interfase? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia celular explorarem a biogênese do câncer em modelos de cultura de células humanas e usarem microscopia confocal de alta resolução para identificar as funções relacionadas ao ciclo celular de proteínas de interesse.

Não se esqueça de que trabalhar com reagentes como paraformaldeído e DAPI pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar luvas e jaleco devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.