Name: Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a sincronizar células HeLa com dupla timidina e analisar proteínas multifuncionais durante a mitose por microscopia confocal de alta resolução. Este método permite estudar funções celulares mantendo a fisiologia normal.

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Agradecemos ao Dr. Kozo Tanaka, da Universidade de Tohoku, Japão por compartilhar as células HeLa estàvel expressando mCherry-histona H2B e GFP-α-tubulina. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NCI para DV (R00CA178188) e por fundos de start-up da Universidade de Northwestern.

1. double bloco de timidina e lançamento: preparações de reagente
<ol><li>Fazer 500 mL que Dulbecco modificado suplementado com 10% FBS, penicilina e estreptomicina médio (DMEM) águia.</li>
	<li>Fazer estoque de 100 mM do thymidine em água estéril e loja em alíquotas a-80 ° C.</li>
</ol>2. protocolo para a imagem latente de célula fixa de progressão mitótica (figura 1A)
<ol><li>No dia 1, semente ~ 2 x 105 células de HeLa em poços de uma placa de 6 com uma lamela (esterilizados com 70% de etanol e irradiação UV) e 2 mL do meio DMEM. Crescem as células em uma incubadora umidificada por 24 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>1 bloco de timidinast : no dia 2, misture bem o volume necessário de timidina midiático DMEM fresco (100mm estoque, 2mm concentração final).</li>
	<li>Adicionar 2 mL de timidina-contendo mídia para as células em cada poço do poço 6-placa e incubar por 18 h.</li>
	<li>No dia 3, Aspire o meio e lavar as células duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco; desenvolvem-se células em meio fresco de DMEM escaldado para 9h às células do bloco de lançamento.</li>
	<li>2nd timidina bloco: novamente, adicione 2 mL de timidina-contendo mídia (concentração final de 2 mM) para as células em cada poço da placa de 6-poços.</li>
	<li>Encube por outro 18 h.</li>
	<li>No dia 4, Aspire o meio e lavar as células duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco.</li>
	<li>SiRNAs diluído (controle e Cdt1) e reagente de transfeccao em meio de crescimento livre de soro separadamente durante 10 min. misturam-os e incubam durante 20 min em RT A concentração final de siRNA usada em cada transfeccao foi 100 nM. Adicione a mistura de reação para as células que foram lavadas fora do Thymidine.</li>
	<li>Incubar as células a 37 ° C para 9-10 h para liberação de bloqueio e fixe as células sobre as lamínulas com 4% PFA por 20 min no RT Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.</li>
	<li>
Células de delgados, depois permeabilizing com detergente de 0,5% (v/v) durante 10 minutos a RT e lavar as células duas vezes com PBS 1x por 5 min cada.
	<ol>
<li>Bloquear células com BSA 1% (p/v) em 1X PBS por 1h no RT, seguido por tratamento de células com 50 µ l de anticorpos primários (anticorpo anti-α-tubulina rato diluído a 1:1, 000, anticorpo anti-Zwint1 diluído a 1: 400 e mouse antifosfo-ɣ H2AX diluído a 1: 300) em 1% (p/v) BSA em PBS 1x por 1h em 37 oC.</li>
		<li>Depois de lavar as células com 1X PBS três vezes, tratar as células com 50 µ l de anticorpos secundários para cada vidro de tampa (Alexa 488 e vermelho rodamina em diluições de 1: 250 em 1% (p/v) BSA em 1X PBS) por 1h no RT</li>
		<li>Depois de lavar as células com PBS 1x, duas vezes por 5 min cada, tratar as células com DAPI (0.1µg / mL de 1X PBS) durante 5 min à RT</li>
		<li>Depois de lavar as células com PBS 1x, duas vezes por 5 min cada, coloque a lamínula enfrentando as células para a mídia de montagem apropriado em um slide clara microscópica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem das células para as proteínas immunostained com 60 X ou 100 objectivo de imersão de óleo X 1.4 at plano-apocromático DIC montadas em um microscópio confocal invertido de alta resolução, equipado com uma câmera apropriada conforme necessário para a qualidade das imagens necessárias.</li>
	<li>Adquira imagens em temperatura ambiente como z-pilhas de 0,2 µm de espessura utilizando software apropriado para o microscópio.</li>
</ol>3. protocolo para a imagem latente de célula viva de progressão mitótica (Figura 3A)
<ol><li>No dia 1, cerca de 0,5-1 x 105 células de HeLa estàvel expressando mCherry-H2B e GFP-α-tubulina (ligeiramente variável com base no tipo de célula e as proteínas que eles expressam) em pratos de fundo de vidro de 35 milímetros com 1,5 mL de DMEM meio de sementes e cultivá-las em um umidificado incubadora para 24 h a 37 oC e 5% de CO2.</li>
	<li>1 bloco de timidinast : no dia 2, adicionar 1,5 mL de timidina-contendo mídia às células no prato (timidina 100mm, concentração final de 2 mM,).</li>
	<li>Incube por 18 h.</li>
	<li>No dia 3, Aspire o meio contendo timidina e lavar as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco.</li>
	<li>SiRNAs diluído (controle e Hec1) e reagente de transfeccao, com média de crescimento livre de soro separadamente durante 10 min. misturam-os e incubam durante 20 min em RT A concentração final de siRNA usada em cada transfeccao foi 100 nM. Adicione a mistura de reação para as células que foram lavadas fora do Thymidine.</li>
	<li>Desenvolvem-se células em 1,5 mL de meio fresco de DMEM escaldado para 8h às células do bloco de lançamento.</li>
	<li>bloco de timidinand 2: adicionar 1,5 mL de timidina-contendo mídia (concentração final de 2 mM) para as células no prato.</li>
	<li>Encube por outro 18 h.</li>
	<li>No dia 4, Aspire o meio e lavar as células três vezes, duas vezes com 2 mL de 1X PBS e uma vez com DMEM escaldada fresco. Desenvolvem-se células em fresca escaldada Leibovitz é (L-15) meio suplementado com 10% FBS e 20 mM HEPES pH 7.0 para 8h às células do bloco de lançamento.</li>
	<li>Coloca o prato na câmara de controle de temperatura definida na alta resolução do microscópio confocal que já tem ligado pelo menos 30 min antes de iniciar a geração de imagens para estabilizar as temperaturas no palco e experimentais.</li>
	<li>Concentre-se em campo claro, com o objectivo de 60 x até que as células são visíveis e, em seguida, manualmente, Peneire o palco para a região de escolha.</li>
	<li>Configure a luz e energia/exposição do laser, parâmetros de aquisição de imagem e duração do experimento usando o software de aquisição de imagem do microscópio de escolha. Use filtros de GFP (488 excitação; 385 emissão nm) e mCherry (561 excitação nm e 385 nm de emissão) para adquirir imagens.</li>
	<li>Realizar o experimento de lapso de tempo adquirindo separadamente a transmissão da luz pulsada e fluorescência imagens cada 10 min por um período até 16 h.</li>
	<li>Adquira imagens como doze 1.0 separada µm z-aviões às 9 horas após o lançamento do bloco duplo timidina usando o software apropriado para o microscópio.</li>
	<li>Analisar as imagens de rastreamento células individuais para progressão mitótica e finalmente montar o filme correspondente com o software de fonte Fiji/ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li>
<li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle%2C+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li>
<li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+and+miracles+of+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li>
<li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li>
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<li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li>
<li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
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<li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li>
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<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li>
<li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li>
<li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li>
<li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li>
<li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1%2FMad2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li>
<li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).</li>
<li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm nenhum interesse financeiro concorrente.

A vantagem mais crítica da sincronização de timidina duplo é que fornece um tamanho de amostra maior das células mitóticas em uma janela de tempo curto com muitas dessas células entrando em mitose em uníssono, permitindo assim também análises de alinhamento de cromossomo, bipolar eixo de formação e de segregação de cromossomas com eficiência muito maior.
Muitos complexos de proteína reguladora e vias de sinalização dedicam-se a garantir a progressão normal através de mitose e desregulamentação...

No ciclo celular, as células sofrem uma série de eventos altamente regulamentados e temporalmente controlados para a duplicação exata do seu genoma e proliferação. Nos mamíferos, o ciclo celular consiste em interfase e fase M. Na interfase, que consiste em três fases - G1, S, e G2, a célula duplica seu genoma e sofre o crescimento que é necessário para o ciclo celular normal progressão1,2. Na fase M, que consiste de mitose (prófase, prometafase, metáfase, anáfase e telófase) e citocinese, uma célula parental produz duas células-filhas geneticamente idênticas. Em mitose, irmã cromátides irmãs de duplicação do genoma são condensado (prófase) e são capturados em seus cinetócoros por microtúbulos do fuso mitótico montado (prometafase), que dirige o seu alinhamento na placa metafásica (metáfase) seguida por seus igual a segregação quando irmã cromátides irmãs são divididos em direção e transportados para eixo oposto polos (anáfase). As duas células-filhas são fisicamente separadas pela atividade de um anel contrátil actina-baseado (telófase e citocinese). O cinetócoro é uma estrutura especializada proteicas que monta na região centromérica de cromátides irmãs e servem como locais de fixação para os microtúbulos do fuso. Sua principal função é conduzir a captura do cromossomo, alinhamento, e ajuda na correção de acessório do microtubule imprópria do eixo, enquanto mediando o checkpoint de montagem do eixo para manter a fidelidade do cromossoma segregação3,4.
A técnica de sincronização do celular serve como uma ferramenta ideal para compreender os eventos moleculares e estruturais envolvidos na progressão do ciclo celular. Esta abordagem tem sido usada para enriquecer as populações de células em fases específicas para vários tipos de análises, incluindo a criação de perfil de expressão gênica, análises de processos bioquímicos celulares e detecção de Localização subcellular das proteínas. Células de mamíferos sincronizadas podem ser usadas não só para o estudo de produtos de genes individuais, mas também para abordagens envolvendo análise de genomas inteira, incluindo análise de microarray de gene expressão5, miRNA expressão padrões6, Regulamento de translação7e análise proteômica de proteína modificações8. Sincronização também pode ser usada para estudar os efeitos da expressão do gene ou a proteína knock-down ou mata-mata, ou de produtos químicos na progressão do ciclo celular.
As células podem ser sincronizadas em diferentes fases do ciclo celular. Métodos físicos e químicos são amplamente utilizados para sincronização do celular. Os critérios mais importantes para a sincronização de célula são que a sincronização deve ser fotoefeito e reversível. Devido as potenciais consequências celulares adversas de Sincronizando pilhas por agentes farmacológicos, métodos químico-dependente podem ser vantajosos para estudar eventos chave ciclo celular. Por exemplo, Hidroxiureia, amphidicolin, mimosine e lovastatina, podem ser usados para sincronização de célula na fase G1/S, mas, por causa de seu efeito sobre as vias bioquímicas que eles inibem, eles ativar mecanismos de ponto de verificação do ciclo celular e matar um importante fração das células9,10. Por outro lado, feedback inibição da replicação do DNA pela adição de timidina para a mídia de crescimento, conhecida como "bloco" de timidina, pode prender o ciclo celular em certos pontos11,12,13. As células também podem ser sincronizadas na fase G2/M, tratando com nocodazole e RO-33069,14. Nocodazole, que impede a montagem de microtúbulos, tem uma relativamente elevada citotoxicidade. Além disso, as células nocodazole-preso podem retornar para interphase precocemente por deslizamento mitótico. Dupla timidina bloco prisão células na fase G1/S e após o lançamento do bloco, as células encontram-se proceder de forma síncrona G2 e mitose. A normal progressão do ciclo celular por células liberado do bloco de timidina pode ser observada sob microscopia confocal de alta resolução por fixação da pilha ou imagens ao vivo. O efeito da perturbação das proteínas mitóticas pode ser estudado especificamente quando células entram e prosseguir através de mitose, após o lançamento do bloco de timidina duplo. Cdt1, uma proteína multifuncional, está envolvido em licenciamento de origem de replicação do DNA na fase G1 e também é necessária para anexos do microtubule cinetócoro durante a mitose15. Para estudar a função de Cdt1 durante a mitose, é necessário adoptar um método que evita o efeito de sua redução na replicação de licenciamento durante a fase G1, enquanto ao mesmo tempo efetuar sua redução especificamente na fase G2/M apenas. Aqui, apresentamos protocolos detalhados baseados no bloco de timidina duplo para estudar o papel mitótico das proteínas executar múltiplas funções durante as diferentes fases do ciclo celular de imagens fixas e viver-pilha.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Leibovitz' s (1x) L-15 médio</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td>Loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Serum reduzido médio (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>319-85-070</td><td>Armazene em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063 (Pen Strep)</td><td>1:1,000 diluição</td></tr><tr><td>Dharmafect2</td><td>GE Dharmacon</td><td>T-2002-02</td><td>Loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Timidina</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>103056</td><td>Dissolvido em água destilada estéril</td></tr><tr><td>Cdt1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 10</td></tr><tr><td>Hec1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 13</td></tr><tr><td>Células HeLa expressando GFP-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa expressando GFP-&alfa;-tubulina e mCherry H2B</td><td>Presente generoso do Dr. Kozo Tanaka de Tohoku universidade, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>F8775</td><td>Tóxico, precisa de cautela</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>D9542</td><td>Tóxico, precisa de cautela</td></tr><tr><td>Rato anti-&alfa;-tubulina</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>Sc32293</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Rabbit ant-Zwint1</td><td>Bethyl</td><td>A300-781A</td><td>diluição 1:400</td></tr><tr><td>Anti-fosfo-&gama de camundongo; H2AX (Ser139)</td><td>Upstate Biotechnology</td><td>05-626, clone JBW301</td><td>Diluição 1:300</td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>Diluição 1:250</td></tr><tr><td>Rodamine Red-X</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>Diluição 1:250</td></tr><tr><td>BioLite 6 poços multiprato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Prato com fundo de vidro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TiE microscópio invertido</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco giratório para câmera confocal</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 888 EM-CCD</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>4 laser de comprimento de onda</td> Sistema de incubação <td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para microscópios</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Software de elementos NIS</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinando células mitóticas sincronização e microscopia confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas multifunctional ciclo celular durante a mitose

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Estudo dos vários eventos reguladoras do ciclo celular de uma forma dependente da fase fornece um entendimento claro sobre o crescimento celular e divisão. A sincronização de populações de células em estágios específicos do ciclo celular foi encontrada para ser muito útil em tais esforços experimentais. Sincronização de células por tratamento com produtos químicos que são relativamente menos tóxicos pode ser vantajosa sobre o uso de drogas inibidoras farmacológicas para o estudo de eventos consequente ciclo celular e obter enriquecimento específico das fases mitóticas selecionados. Aqui, descrevemos o protocolo para Sincronizando pilhas humanas em diferentes fases da célula o ciclo, incluindo ambos na fase S e fase de M com um bloco de timidina duplo e liberar o procedimento para estudar a funcionalidade das proteínas mitóticas em alinhamento de cromossomo e segregação. Este protocolo tem sido extremamente útil para estudar as funções mitóticas das proteínas multifunctional que possuem funções de interfase estabelecida. No nosso caso, o papel mitótico da Cdt1, uma proteína essencial para o licenciamento de origem de replicação na fase G1, pode ser estudado efetivamente somente quando Cdt1 G2/M-específico pode ser esgotado. Descrevemos o protocolo detalhado para esgotamento de Cdt1 G2/M-específicos usando a sincronização de timidina duplo. Nós também explicar o protocolo de fixação da pilha e viver a imagem latente da pilha usando microscopia confocal de alta resolução após lançamento de timidina. O método também é útil para analisar a função das proteínas mitóticas em condições fisiológicas e perturbadas como para Hec1, um componente do complexo, o Ndc80, que permite um para obter os tamanhos de amostra grande de células mitóticas para celular fixo e ao vivo análise como mostramos aqui.

Estudo de progressão mitótica e estabilidade de microtúbulos nas células fixo após o lançamento do bloco de timidina dobro Cdt1 está envolvido no licenciamento das origens de replicação do DNA na fase G1. Ela é degradada durante a fase S, mas re-acumula-se na fase G2/M. Para estudar o seu papel na mitose, o Cdt1 endógeno precisa estar esgotado especificamente na fase de G/M, usando a técnica de sincronização de célula mais adequada, o dobro de timidina bloco<sup class=...

Apresentamos um protocolo para sincronização de timidina duplo de células HeLa, seguido de análise utilizando microscopia confocal de alta resolução. Esse método é a chave para a obtenção de grande número de células que proseguem sincronicamente de fase S de mitose, permitindo estudos sobre funções mitóticas das proteínas multifunctional que também possuem funções de interfase.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

O objetivo geral deste procedimento é usar sincronização dupla de timidina e microscopia confocal de alta resolução para estudar os papéis mitóticos de proteínas multifuncionais que podem possuir funções críticas de interfase. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, sobre como delinear as funções normais das proteínas envolvidas no ciclo celular e na mitose. As principais vantagens desta técnica são que, as células podem manter seu comportamento fisiológico normal e que este método também é muito fácil de executar.Demonstrando este procedimento estará o Dr. Mohammed Amin, um pós-doutorando do meu laboratório, que é especialista no uso deste método. Para imagens de células fixas da progressão celular mitótica, comece semeando aproximadamente duas vezes 10 para a quinta célula HeLa em cada poço de uma placa de seis poços, contendo uma lamínula esterilizada com 70% de etanol e UV e dois mililitros de meio DMEM. Após 24 horas em uma incubadora de cultura de células, bloqueie as células com dois mililitros de timidina recém-diluída e meio fresco por poço e retorne a placa à incubadora por mais 18 horas.No dia seguinte, lave as células duas veze

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Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um protocolo básico para a imagem e quantificar o tempo de mitose de células vivas de tecidos de mamíferos cultura após transfecção siRNA.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma...

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

Metáfase para anáfase transição é disparada através anáfase-promover complexo (APC / C) dependente de ubiquitinação e subsequente destruição da ciclina B. Aqui, nós estabelecemos um sistema que, na sequência de pulso-caça, rotulagem permite monitorar proteólise ciclina B em populações de células inteiras e facilita a detecção de interferência do checkpoint mitótico.

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Neural mitose de células progenitoras é um parâmetro crítico da neurogénese. Muito do nosso entendimento da mitose progenitor neural é baseado na análise de tecido fixo. Imagens ao vivo em fatias de cérebro de embriões é uma técnica versátil para avaliar a mitose com resolução temporal e espacial de alta em um ambiente controlado.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Relatamos dois protocolos de sincronização de células que fornecem um contexto para estudar eventos relacionados a fases específicas do ciclo celular. Mostramos que essa abordagem é útil para analisar a regulação de genes específicos em um ciclo celular não perturbado ou após a exposição a agentes que afetam o ciclo celular.

Estudando a expressão de genes regulada pelo ciclo celular por dois protocolos complementares de sincronização de células

Este protocolo eficientemente estuda divisão de células de mamíferos em matrizes de colágeno 3D, integrando a sincronização da divisão celular, monitoramento de eventos de divisão em matrizes 3D usando a técnica de imagem live-célula, microscopia de reflexão confocal tempo-resolvido e análise quantitativa de imagem.

Divisão celular dos mamíferos em matrizes 3D através de microscopia de reflexão Confocal quantitativa

Este protocolo descreve um método fácil e conveniente para rotular e Visualizar ao vivo cromossomos em células mitóticas usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 label e um sistema de microscopia confocal de disco girando.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.

Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aprenda a sincronizar células HeLa com dupla timidina e analisar proteínas multifuncionais durante a mitose por microscopia confocal de alta resolução. Este método permite estudar funções celulares mantendo a fisiologia normal.

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose (Vídeo) | JoVE Journal

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

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