Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

O objetivo geral desta série de ensaios é investigar a função do gene humano durante a meiose I usando oócitos de camundongos. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo reprodutivo humano, como se há uma predisposição genética para a aneuploidia materna. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa oócitos de camundongos como modelo para a meiose de mamíferos, o que é útil devido à inacessibilidade de óvulos humanos para estudos de função gênica.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando sequenciamos os exomas de mulheres que haviam sido submetidas a tratamentos de fertilização in vitro e cujas taxas de aneuploidia embrionária não podiam ser explicadas pela idade materna. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de análise de imagem são difíceis de aprender e a definição de parâmetros de análise rigorosos é fundamental para o rigor e a reprodutibilidade. Inserir, utilizando uma estratégia de clonagem validada, a sequência codificante completa do gene de interesse na região de clonagem múltipla do vector de transcrição in vitro.

Mutagenizar o DNA se gerar polimorfismos de nucleotídeo único ou inserções e deleções, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transforme o DNA mutagenizado em um hospedeiro bacteriano. Use um kit para isolar e purificar o plasmídeo, seguindo as instruções do fabricante.

Em seguida, linearize os produtos finais usando a digestão enzimática de restrição única do DNA purificado. Purifique o produto digerido usando um protocolo de limpeza de DNA validado ou um kit. E eluir em 30 microlitros de água livre de RNase / DNase.

In vitro, transcrever DNA usando polimerase T7 seguindo o protocolo do fabricante. Finalmente, purifique e elua o RNA em 30 microlitros de água livre de RNase / DNase usando um kit de purificação de ácido nucleico baseado em coluna de rotação de matriz de sílica seguindo o protocolo do fabricante. Divida os oócitos em grupos iguais para microinjeção.

Microinjete um grupo com mRNA experimental e o outro grupo com NPBs de controle de tipo selvagem ou mRNA GFP. Usando um aparelho de pipetagem manual ou oral, onde a abertura da pipeta de vidro é ligeiramente maior que o diâmetro de um oócito, transfira os oócitos para uma gota de 100 microlitros de meio de cultura livre de milrinona em uma placa de Petri coberta com óleo mineral de qualidade embrionária. Em seguida, incube os oócitos por sete horas a 37 graus Celsius em 5% de CO2 para permitir maturação suficiente para a metáfase da Meiose I. Após a incubação, use o mesmo aparelho de pipeta para transferir os oócitos para uma placa de cultura de órgãos de poço central contendo 700 microlitros de meio de coleta de MEM pré-resfriado no poço central e 500 microlitros de água no anel externo.

Coloque o prato no gelo por sete minutos. Fixe os oócitos transferindo-os para um poço de uma placa de vidro transparente contendo 400 microlitros de 2% de paraformaldeído em 1x PBS. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente.

Após a imunocoloração, conforme descrito no protocolo de texto, a imagem dos oócitos usando uma objetiva de 40 a 63x em um microscópio confocal. Capture pequenos passos no plano Z otimizado para o objetivo de trabalho e crie imagens de toda a região do fuso metafásico. Para identificar o status de fixação do microtúbulo do cinetócoro, primeiro abra a imagem arrastando o arquivo para a barra de ferramentas do ImageJ.

Na série Z aberta, navegue até o menu suspenso de imagens e, na subguia Cor, clique em Mesclar canais para tornar todos os canais visíveis. É fundamental que o analista esteja familiarizado com o tipo de ligações aos cinetocoros possíveis em oócitos de camundongos. A qualidade da imagem influenciará muito sua capacidade de analisar adequadamente esses dados.

Usando o botão de alternância na parte inferior da imagem, mova-se por cada fatia Z e determine a fixação dos microtúbulos do cinetócoro. Usando o mesmo aparelho de pipeta, transfira os oócitos para uma gota de 100 microlitros de meio de cultura livre de milrinona sob óleo. Incubar os oócitos por sete horas para permitir maturação suficiente para metafase da Meiose I como antes.

Em seguida, transfira os oócitos para uma placa de cultura de órgãos de poço central contendo 700 microlitros de meio de cultura contendo monastrol no poço central e 400 microlitros de água no anel circundante. Incube a 37 graus Celsius por duas horas. Enxágue o monastrol transferindo oócitos através de três gotas de 100 microlitros de meio de cultura CZB.

Em seguida, transfira os oócitos para uma nova placa de cultura de órgãos de poço central contendo 700 microlitros de meio de cultura mais inibidor de proteassoma no anel central. Adicione 400 microlitros de água ao anel externo e incube por três horas. Em seguida, fixe os oócitos transferindo-os para um poço de uma placa de vidro transparente contendo 400 microlitros de 2% de paraformaldeído em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente.

Visualize os oócitos usando uma objetiva de 40 a 63x em um microscópio confocal, capturando etapas de menos de um mícron no plano Z e certificando-se de obter imagens de toda a região do fuso metafásico. Para identificar o status de alinhamento cromossômico, abra os arquivos de imagem usando o software de imagem. Em seguida, arraste a imagem para o painel de controle do ImageJ.

Na série Z aberta, use a ferramenta de ponto para marcar pontos no final de cada pólo do fuso em sua respectiva fatia Z, colocando a ferramenta sobre o pólo do fuso na imagem e clicando na imagem. Adicione esses pontos ao ROI Manager pressionando simultaneamente o botão de comando e o botão T no teclado. Determine as coordenadas específicas para cada uma das posições definidas destacando o ponto específico no ROI Manager e clicando no botão Medir.

Isso fornecerá uma tabela de resultados contendo as coordenadas X e Y para cada ponto, que são os pontos X1, Y1 e X1, Y2, respectivamente. Em seguida, determine a coordenada Z verdadeira. Isso é feito multiplicando o número da fatia da fatia Z específica na pilha Z na qual o pólo do fuso foi identificado pela espessura da pilha.

Estes serão os pontos Z1 e Z2, respectivamente. Determine o comprimento do fuso usando a equação do teorema de Pitágoras com as coordenadas X, Y e Z previamente definidas. Em seguida, determine a zona média do fuso.

Isso é calculado como 1/2 do comprimento do fuso. Clique no ícone de linha na barra de ferramentas do ImageJ e desenhe uma linha que vai de um pólo do spindle até a zona média do spindle. O comprimento será exibido na barra de ferramentas do ImageJ.

A definição de parâmetros rígidos de alinhamento cromossômico permite uma análise quantitativa robusta, importante na reprodutibilidade dos dados. Determine o status de alinhamento cromossômico avaliando a distância cromossômica da zona média do fuso usando a ferramenta de medição de linha. Clique no ícone de linha na barra de ferramentas do ImageJ e desenhe uma linha da zona média do fuso até o cromossomo.

O comprimento será exibido na barra de ferramentas do ImageJ. Cromossomos maiores que quatro mícrons da zona média do fuso são considerados desalinhados. Depois que os oócitos foram submetidos a imunocoloração e imagem, as ligações corretas de cinetócoro de microtúbulos podem ser avaliadas.

Em uma fixação normal, cada par de cinetocoros irmãos do bivalente é ligado aos microtúbulos do fuso de pólos opostos. Até três tipos diferentes de anexos anormais podem ser observados. Um exemplo ocorre quando não há microtúbulos em contato com o cinetócoro.

Alternativamente, os microtúbulos podem se ligar incorretamente, produzindo anexos sintélicos ou merotélicos. Os anexos sintélicos se formam com ambos os pares de cinetocoros irmãos ligados a microtúbulos que emanam de um único pólo. As ligações merotélicas ocorrem quando os cinetocoros irmãos em um par estão ligados a pólos opostos.

Depois que os oócitos se recuperam do desalinhamento induzido, a capacidade de realinhamento dos cromossomos é avaliada por imagens. Neste exemplo, um cromossomo bivalente é considerado desalinhado, pois está localizado a mais de quatro mícrons da zona média do fuso. Ao escolher qual ensaio é apropriado para avaliar a função da variante do gene, é importante lembrar que as variantes do gene humano em estudo estão sendo superexpressas e que os homólogos endógenos do camundongo podem precisar ser esgotados ao mesmo tempo.

Após esse procedimento, outros métodos como o CRISPR-Cas9 para criar cepas de camundongos humanizados podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como entender como a variante do gene influencia a qualidade do óvulo e do embrião e se isso afeta a saúde reprodutiva do indivíduo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da genética reprodutiva explorarem outros fatores causadores da aneuploidia materna em humanos. A identificação de genes pode fornecer diagnósticos poderosos e uma base para estudos na correção de aneuploidias.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seus experimentos.